結(jié)核分枝桿菌及其實驗室診斷新技術(shù)

1、結(jié)核分枝桿菌及其實驗室診斷新技術(shù)第1頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三 結(jié)核病又稱為癆病和白色瘟疫。 公元三世紀以前，我國古代醫(yī)學還只是認識到該病可能是一種極為嚴重的慢性傳染病，“累年積月，漸就頓滯，以至于死，死后復轉(zhuǎn)旁人，乃至滅門”。以后逐漸認識到這是一種“肺癆”，其病因為“癆蟲”所致。 后來，西方的一些科學家發(fā)現(xiàn)這類病人的肺內(nèi)有一個個堅實的團塊，摸上去像土豆或花生這類植物的根上塊莖，就將該病稱之為Tuberculosis，即結(jié)節(jié)的意思，這就是結(jié)核病命名的由來。結(jié)核病第2頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三 紅樓夢：香魂一縷隨風散，愁緒三更入夢遙

2、。 雖然說紅樓夢與醫(yī)學無關(guān)，但其作者筆下的“癆病”代表林黛玉卻驚動全世界。 上世紀50年代，美國細菌學家杜博斯所寫的The White Plague(白色瘟疫)，就曾提到了林黛玉的肺結(jié)核，可見在當時紅樓夢中林黛玉的病癥已是結(jié)核病的典型癥狀。 黃帝內(nèi)經(jīng)素問：“大骨枯稿，大肉陷下。胸中氣滿，喘息不便，內(nèi)痛引肩項，身熱，脫肉破腘?！苯Y(jié)核病第3頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三 2011年全球結(jié)核病發(fā)病率 （世界衛(wèi)生組織2012年結(jié)核病報告）結(jié)核病目前仍然是一個全球性的嚴重的公共衛(wèi)生問題。結(jié)核病第4頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三流行過程傳染源 痰涂片

3、陽性的肺結(jié)核病人傳播途徑 空氣傳播易感人群 普遍易感第二節(jié) 流行病特征影響流行的因素自然因素 季節(jié)、環(huán)境、居室通風社會因素 社會、經(jīng)濟、醫(yī)療服務其他因素 HIV-TB，MDR/XDR-TB結(jié)核病第5頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三結(jié)核病防控的三大手段臨床診斷常常結(jié)合 痰涂片，胸片，癥狀和體征結(jié)核病世界防治結(jié)核病日3月24日第6頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的。Robert Koch（1843-1910）1882年發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌，1905年獲得諾貝爾生理或醫(yī)學獎。Friedrich Neelsen (1854-18

4、98)Franz Ziehl（1857-1926） Ziehl-Neelsen 染色法（分枝桿菌抗酸染色的基礎）結(jié)核分枝桿菌第7頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三結(jié)核分枝桿菌（一）生物學性狀1.形態(tài)與染色 細長略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽性第8頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三2. 培養(yǎng)與生長特性 特點 專性需氧 生長緩慢 營養(yǎng)要求高，常用羅氏培養(yǎng)基 生長現(xiàn)象 液體：表面生長（菌膜） 固體：顆粒、結(jié)節(jié)、花菜狀菌落 乳白或米黃，不透明3. 生化反應 不發(fā)酵糖類 ，觸酶試驗陽性，而熱觸酶試驗陰性結(jié)核分枝桿菌第9頁，共23頁，2022年，5月2

5、0日，11點56分，星期三4. 抵抗力四不怕干燥堿性染料青霉素等抗生素對酸或堿有抵抗力（3% HCl或6% H2SO4、4% NaOH）四怕乙醇濕熱紫外線抗癆藥物（異煙肼、利福平等）5. 變異性形態(tài)結(jié)構(gòu)變異： 結(jié)核桿菌的L型：顆粒狀、絲狀毒力變異： 卡介苗BCG：Calmette和Gurin 牛分枝桿菌 13年230次 耐藥性變異： 耐異煙肼及其他抗結(jié)核藥物的結(jié)核菌株日益增多結(jié)核分枝桿菌第10頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三致病物質(zhì)（二）致病性莢膜與細胞表面受體結(jié)合（粘附與入侵作用）含多種酶（分解利用營養(yǎng)物質(zhì)）保護（阻止有害物質(zhì)的進入菌體）脂質(zhì)索狀因子（破壞細胞，引起

6、肉芽腫）磷脂（形成結(jié)核結(jié)節(jié)）硫酸腦苷脂（抑制吞噬體與溶酶體結(jié)合）蠟質(zhì)D（引起遲發(fā)性過敏反應）蛋白質(zhì)引起遲發(fā)性過敏反應感染方式 呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入機體所致疾病 結(jié)核病，以肺結(jié)核常見結(jié)核分枝桿菌第11頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三（三）免疫性 1. 機體抗結(jié)核免疫特點：傳染、免疫、超敏反應共存 2. 屬于感染免疫(infection immunity)，又稱有菌免疫 3. 細胞免疫為主，遲發(fā)型超敏反應同時存在 4. 郭霍現(xiàn)象: 注射結(jié)核桿菌于豚鼠皮下 初次注射 局部反應小 全身擴散 無免疫無超敏反應 再次注射 局部反應大 不擴散 有免疫有超敏反應 5. 結(jié)核菌

7、素試驗（OT試驗）： 應用結(jié)核菌素進行皮膚試驗來測定機體對結(jié)核分枝桿菌是否能引起遲發(fā)型超敏反應（型變態(tài)反應）的一種試驗結(jié)核分枝桿菌第12頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三 標本處理：濃縮集菌（氫氧化鈉處理） 直接鏡檢：抗酸染色 分離培養(yǎng)：培養(yǎng)基、時間（24周后見結(jié)果）痰液等實驗室診斷新技術(shù)分離培養(yǎng)（一）傳統(tǒng)微生物學檢查直接涂片第13頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三實驗室診斷新技術(shù)（二）TB-Beads技術(shù)Liu J, Sun ZQ, Pei H, et al. Increased case finding of tuberculosis fro

8、m sputum and sputum deposits after magnetic bead concentration of mycobacteria. J Microbiol Methods, 2013, 93(2): 144-147.第14頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三（三）核酸分子診斷技術(shù)-Xpert MTB/RIF和TB-SAT靶基因菌種鑒定16SrRNA IS6110異煙肼katG、inhA、ahpC、oxyR、KasA、ndh 利福平rpoB乙胺丁醇embB吡嗪酰胺 pncA鏈霉素 rpsL、rrs喹諾酮類藥物 gyrA、gyrB Zhang Y,

9、 et al. Nature, 1992, 358(6387): 591-593.Scorpio A, Zhang Y. Nat Med, 1996, 2(6): 662-667.實驗室診斷新技術(shù)第15頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三基因水平-PCR技術(shù)1. Xpert MTB/RIFIndorsed by WHO in 2010.實驗室診斷新技術(shù)第16頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三2. TB-SAT技術(shù)Simultaneous Amplification and Testing（RNA仁度）RNA作為臨床分子診斷靶標的優(yōu)點 RNA 拷貝數(shù)

10、 DNA拷貝數(shù) 更具臨床意義 生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍 RNA遠不如DNA穩(wěn)定 病原體死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.較好的愈后指標實驗室診斷新技術(shù)第17頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三恒溫擴增-SAT技術(shù)TB-SAT技術(shù)原理實驗室診斷新技術(shù)第18頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三TB-RNA提取恒溫擴增實時檢測60C 10 min42C 5 min超聲儀（300W）15 min痰液預處理42C 40 min50 ul 稀釋液TB-SAT操作步驟實驗室診斷新技術(shù)第19頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三培

11、養(yǎng)鑒定結(jié)果+PCR結(jié)果合計TB-SAT檢測結(jié)果陽性陰性陽性2317238陰性12318330合計243325568敏感度=231/243100%=95.06%特異性=318/325100%=97.85%準確度=(231+318)/568 100%=96.65%恒溫擴增-SAT技術(shù)TB-SAT檢測的敏感度和特異性實驗室診斷新技術(shù)第20頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三（四）蛋白分子診斷技術(shù)-干擾素釋放實驗結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-）由于效應T細胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否

12、正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的產(chǎn)品目前已被美國、加拿大、英國、德國、法國、日本等二十余個國家寫入本國的結(jié)核診療指南中（IGRA，interferon- gamma release assay）實驗室診斷新技術(shù)第21頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三檢測過程與結(jié)果判斷陰性結(jié)果陽性結(jié)果空白對照抗原 A抗原 B陽性對照（PHA）實驗室診斷新技術(shù)第22頁，共23頁，2022年，5月20日，11點56分，星期三美國FDA認證臨床實驗數(shù)據(jù) 經(jīng)培養(yǎng)確診的結(jié)核病患者樣本183例 敏感度 95.6%(175/183) 306例入伍新兵 特異性 97.1%(297/306)T.SPOT.TB 檢測的敏感度和特異性國內(nèi)臨床實驗數(shù)據(jù)T-S