青蒿素分析方法的確定2021優(yōu)秀課件

1、青蒿素分析方法的確定青蒿素分析方法的確定青蒿 青篙為菊科一年生草本植物黃花篙干燥地上部分，性寒，味苦、辛，歸肝膽經(jīng)，可清熱解暑、除蒸、截瘧，主要分布于重慶、四川、云南、廣西等地。目前青篙素系列藥物已取代奎寧成為治療瘧疾的最安全有效的藥物。青蒿素是青蒿抗瘧的有效成分，也是合成青蒿素系列藥物的起始原料，它的需求量很大。青蒿 青篙為菊科一年生草本植物黃花篙干燥地上部分，性寒為什么要測定青蒿素的含量 不同產(chǎn)地的青蒿藥材中青篙素的含量差異較大，而青蒿素是青篙截瘧的主要有效成分，因此對(duì)藥材中青篙素含量的準(zhǔn)確測定十分必要。提取青蒿素的溶劑：青蒿素C15H22O5 在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或苯中易溶, 在甲

2、醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解, 在水中幾乎不溶解; 在冰醋酸中易溶。為什么要測定青蒿素的含量 不同產(chǎn)地的青蒿藥材中青篙素的含量差青蒿素的有效成分 青蒿素是從黃花蒿中提取分離得到的含過氧基團(tuán)的新型半萜內(nèi)酯。其多種衍生物均是治療瘧疾的有效單體，國內(nèi)外公認(rèn)的首創(chuàng)新藥。將青蒿素結(jié)構(gòu)中的C-10為羰基還原成羥基得雙氫青蒿素，進(jìn)一步烷基氧化得蒿甲醚，而進(jìn)行酯化可得到青蒿琥酯。青蒿素 artemisinin青蒿素的有效成分 青蒿素是從黃花蒿中提取分離得到的含過氧雙氫青蒿素為天然抗瘧藥青篙素經(jīng)鈉硼氫還原而產(chǎn)生的半縮醛化合物, 其12 位的羥基具有差向異構(gòu), 差向異構(gòu)體a 與 在一定溶劑中有相互轉(zhuǎn)化并達(dá)

3、到平衡的過程。DHA 分子結(jié)構(gòu)中無共扼結(jié)構(gòu)和發(fā)色基團(tuán), 不宜用分光光度法或HPLC法測定含量。雙氫青蒿素dihydroartemisinin雙氫青蒿素雙氫青蒿素為天然抗瘧藥青篙素經(jīng)鈉硼氫還原而產(chǎn)生的半縮醛化合物定性分析定量分析紫外分光光度法IR、MS、NMRHPLC(UV、ELSD、SPD.)UPLCLC-MS/LC-MS-MS高效毛細(xì)管電泳CETLC定性分析定量分析紫外分光光度法IR、MS、NMRHPLCUP1.1 青蒿素的IR定性分析雙氫青蒿素dihydroartemisinin1.1 青蒿素的IR定性分析雙氫青蒿素dihydroarte3376 O-H;1227 C-O ;1025 C-

4、O-C;2925 -CH3;總結(jié)：IR專屬性強(qiáng)，一般做標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照法3376 O-H;1227 C-O ;1.2紫外分光光度法原理：1.由于青蒿素藥物分子結(jié)構(gòu)中母核不具有共軛體系，其紫外吸收光譜的主要是末端吸收。但C-10位由于取代基不同具有一定的吸收特征。2.青蒿素由于具有過氧橋和縮醛結(jié)構(gòu), 對(duì)酸堿不穩(wěn)定, 對(duì)強(qiáng)堿極不穩(wěn)定, 熱至熔點(diǎn)以上即迅速分解。采用0.2%氫氧化鈉50水浴加熱30min 進(jìn)行水解, 水解后的波長掃描結(jié)果顯示青蒿素在紫外區(qū)有最大吸收峰Kmax=290.5nm, 由此確定最適波長為292nm。（青蒿素衍生化，酸化后亦可作HPLC-UV檢測）1.2紫外分光光度法原理：2.青蒿

5、素由于具有過氧橋和縮醛結(jié)構(gòu)1.青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品0.1g+95%稀釋成0.001%的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品0.1g+95%稀釋成0.001%的標(biāo)準(zhǔn)品溶2.0.001%標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 ml加入95% 乙醇4.5ml, 再加入0.2% NaOH 20ml定容至25ml, 50水浴加熱30min, 取出快速冷卻。2.0.001%標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 ml加入95% 乙醇4.5m3.分別取0.5、1.0、2.0ml 的.001%青蒿素標(biāo)準(zhǔn)溶液, 分別加入95%乙醇4.5、4.0、3.0ml, 再各加入0.2% NaOH 20ml定容至25ml, 配成濃度分別為210- 5%、410- 5%、810- 5%的標(biāo)

6、準(zhǔn)溶液, 50水浴加熱30min, 取出快速冷卻, 在已經(jīng)確立的最適波長下分別測吸光度。3.分別取0.5、1.0、2.0ml 的.001%青蒿素標(biāo)準(zhǔn)4.樣液的制備取青蒿待測樣品研細(xì)粉末0.5g, 加入95%乙醇10ml 浸泡, 50水浴加熱60min 進(jìn)行提取, 取出樣品振搖、冷卻、過濾, 取濾液1ml, 加入95%乙醇14ml, 再加入0.2% NaOH 10ml, 配制成青蒿素樣品溶液,50水浴加熱30min。在已經(jīng)確立的最適波長下分別測吸光度,對(duì)濃度作圖, 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.樣液的制備青蒿素含量=( 青蒿素樣品濃度標(biāo)準(zhǔn)濃度單位原始體積) / 青蒿研細(xì)粉末質(zhì)量朗伯比爾定律：A=-lgT=b

7、cb，一定，吸光度A和溶液濃度c成正比青蒿素含量=( 青蒿素樣品濃度標(biāo)準(zhǔn)濃度單位原始體積) UV法總結(jié)UV法測定青蒿素是依據(jù)青蒿素在堿性條件下生成的青蒿素衍生物 Q292在292 nm波長處有較強(qiáng)的紫外吸收來定量的，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，對(duì)儀器設(shè)備的要求不高，其缺點(diǎn)是不能排除青蒿素類似物等物質(zhì)的干擾。因此，UV法測定青蒿中青蒿素的含量實(shí)際反映的是藥材中青蒿素及其類似物的總量。陳靖等5報(bào)道，青蒿中青蒿素類似物青蒿酸、青蒿素B、3-羥基-1-去氧青蒿素的平均含量分別為0.47 、0.05、0.005，對(duì)青蒿中青蒿素含量的測定影響較大，使得測定結(jié)果偏高。UV法總結(jié)UV法測定青蒿素是依據(jù)青蒿素在堿性條件下

8、生成的青蒿1.3 HPLC法常見檢測器:1. UV2. DAD（二極管陣列檢測器）3. FD（熒光檢測器）4. RID(示差折光率檢測器)5. ECD(電化學(xué)檢測器)6. ELSD（蒸發(fā)光散射器檢測器）原理：利用流動(dòng)相與組分間的親和力，通過組分、流動(dòng)相和固定相三者間的相互作用來實(shí)現(xiàn)分離。1.3 HPLC法常見檢測器:原理：利用流動(dòng)相與組分間的親和文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)測定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法有HPLC-UV-ECD法（高效液相色譜紫外電化學(xué)檢測法）、HPLC-MS/MS法,采用ELSD法（蒸發(fā)光散射檢測法）檢測僅有很弱紫外吸收的青蒿素、UV法檢測青蒿中含量較低的青蒿乙素和青蒿酸。文獻(xiàn)報(bào)道

9、同時(shí)測定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法有HPL蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD) 為通用型的質(zhì)量檢測器, 對(duì)結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)可給出幾乎相同的響應(yīng)因子,響應(yīng)值大小取決于物質(zhì)濃度及檢測條件下物質(zhì)顆粒的大小, 而不依賴于紫外吸收, 因此適合于青蒿素及雙氫青蒿素的含量測定。1.3.1 HPLC-ELSD法蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD) 為通用型的質(zhì)量檢測器, 對(duì)結(jié)構(gòu)青蒿素分析方法的確定2021優(yōu)秀課件SPD(二極管陣列檢測器)與ELSD 同時(shí)檢測, 發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素轉(zhuǎn)化平衡后SPD圖中。a異構(gòu)體與異構(gòu)體峰面積之比為4: 1 , 而ELSD 檢測得。a異構(gòu)體與異構(gòu)體峰面積之比為8 : 1。因?yàn)镋 L SD 對(duì)結(jié)

10、構(gòu)相似物質(zhì)能給出幾乎一致的響應(yīng)因子, 屬于質(zhì)量響應(yīng)型檢測器, 因此得到的峰面積比即為轉(zhuǎn)化平衡后a異構(gòu)體與異構(gòu)體的實(shí)際物質(zhì)量比。從而也可得知a與異構(gòu)體對(duì)U V 的響應(yīng)因子不同, 如用UV 檢測則不能直接采用二者峰面積之和定量。例：HPLC-ELSD 法測定復(fù)方雙氫青篙素片中雙氫青篙素的含量SPD(二極管陣列檢測器)與ELSD 同時(shí)檢測, 發(fā)現(xiàn)雙氫青青蒿素分析方法的確定2021優(yōu)秀課件2.對(duì)照品溶液:取復(fù)方雙氫青篙素片10 片, 剝?nèi)ケ∧ひ? 精密稱定, 研細(xì), 精密稱取適量, 置25 m L量瓶中, 加乙睛適量,40 超聲處理5 min。放冷至室溫, 定容。搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液2 mL 加水

11、稀釋至10 mL。例：復(fù)方雙氫青篙素片（含雙氫青篙素32 m g , 磷酸呱哇0.32g , 甲氧芐啶90 m g )中青蒿素含量的測定1.對(duì)照品溶液:精密稱取D H A 對(duì)照品適量, 置50 m L 量瓶中, 加乙睛適量,40 超聲處理5 min。放冷至室溫, 定容, 即得1.28 m g/m L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密量取此儲(chǔ)備液適量, 用水稀釋制成256 mg/m L的對(duì)照品溶液。2.對(duì)照品溶液:取復(fù)方雙氫青篙素片10 片, 剝?nèi)ケ∧ひ? ELSD檢測器檢測時(shí)少量溶解的甲氧芐啶峰及a異構(gòu)體峰與異構(gòu)體峰均能達(dá)到完全分離, 三者的分離度分別為2、8 和4, a異構(gòu)體與異構(gòu)體保留時(shí)間分別約為5

12、. 7 m in和7 m in , 理論板數(shù)按a異構(gòu)體或異構(gòu)體峰計(jì)均不低于6000。SPD掃描圖譜顯示最先流出的成分為甲氧芐啶, 與后面的a異構(gòu)體及異構(gòu)體完全分離, 不影響測定。ELSD檢測器檢測時(shí)少量溶解的甲氧芐啶峰及a異構(gòu)體峰與異構(gòu)1.3.2 HPLC-UV-ELSD同時(shí)測定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法青蒿素只有很弱的末端紫外吸收,一般不用UV法進(jìn)行精確定量分析,故選擇用ELSD法檢測。用ELSD法也可檢測青蒿乙素和青蒿酸,但由于其靈敏度低,對(duì)這兩個(gè)成分含量低的青蒿藥材來說,該法同時(shí)測定3種成分較困難,故采用靈敏度較高的UV法對(duì)青蒿乙素和青蒿酸進(jìn)行定量測定。UV檢測器對(duì)所測成分性質(zhì)

13、無任何影響, 據(jù)此可使用HPLC-UV-ELSD同時(shí)測定青蒿中3種成分。1.3.2 HPLC-UV-ELSD同時(shí)測定青蒿中青蒿素、青色譜分析條件色譜柱: Nucleodur C18 ( 250mm 416 mm, 5m D) ; 流動(dòng)相: 乙腈-0.1%乙酸(50 50) ; 流速: 110 mL/min ; 柱溫: 25 青蒿乙素和青蒿酸用UV檢測器檢測, 波長為209nm; 青蒿素用ELSD檢測器檢測, 漂移管溫度50 , 載氣(N2 )壓力30 p si ( 1 p si 619 kPa) , 增益值為50; 進(jìn)樣體積為10或30L。色譜分析條件色譜柱: Nucleodur C18 (

14、25HPLC chromatograms of reference (A, B) and the extract from Herba Artemisiae Annuae (C, D).A, C: UV； B, D: ELSD; 1: Arteannuin B; 2: Artemisinin; 3: Artemisinic acidHPLC chromatograms of referenc1.2.2 RP-HPLC1.常規(guī)的液相方法將青蒿素進(jìn)行柱前衍生,將其與堿反應(yīng)后, 產(chǎn)生一化合物( Q292), 該物質(zhì)在292 nm處有最大吸收, 然而, 由于反應(yīng)后有無機(jī)堿存在, 易損壞色譜柱, 不適宜

15、直接進(jìn)樣測定。但化合物Q292在pH值5. 58 6. 04 條件下, 又可定量地轉(zhuǎn)化為化合物Q260, 該物質(zhì)在260nm 處有最大吸收, 可用于做HPLC 測定12。2.又青蒿素在203 nm 處有弱吸收峰的性質(zhì)，HPLC 法在203 nm 直接測定, 大多采用甲醇作溶劑稀釋對(duì)照品, 使其在紫外區(qū)203 nm處有極弱的吸收, 其靈敏度及重復(fù)性均較差,(選用丙酮作溶劑, 在203nm 處有較強(qiáng)的吸收11)。1.2.2 RP-HPLC1.常規(guī)的液相方法將青蒿素進(jìn)行柱前1.衍生化法13：色譜條件：色譜柱: LichrospherC18 ( 4. 6mm250mm, 5 Lm) ; 流動(dòng)相: 甲醇

16、-緩沖液(體積比50：50; 0. 01mo l/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液) ; 流速: 0. 8mL /m in; 柱溫: 30 e ; 靈敏度: 2. 000 AUFS; 檢測波長: 260 nm; 進(jìn)樣量: 20L。1.衍生化法13：2.末端吸收14色譜條件：色譜柱Kromasil ODSC18(416mm250mm, 5 m); 流動(dòng)相為乙腈-水( 60：40); 流速為1.0mL/min; 檢測波長為203nm; 柱溫30。理論塔板數(shù)2000.2.末端吸收141.2.4 LC-MS-MS體內(nèi)藥物分析是測定體液(主要是血漿、血清或全血)中藥物或其他代謝物濃度。由于血液樣品

17、試樣提供量少，基質(zhì)復(fù)雜，在此混合物中分析某種微量成分(通常為(g/mL或ng/mL水平)并加以鑒別，常常是對(duì)分析化學(xué)家的挑戰(zhàn)。藥物的是用來預(yù)防、診斷及治療疾病的一類特殊物質(zhì)，與人們的健康和生命安危有極其密切的關(guān)系，雜質(zhì)檢查及其限度控制是保證藥品質(zhì)量的一個(gè)重要方面。使用LC-MSMS可以簡便地對(duì)藥物中雜質(zhì)加以監(jiān)控.LC-MS雖然有足夠的靈敏度，但遇到LC難以分離的組分，其應(yīng)用受到限制。使用LC-MSMS可以克服背景干擾，通過MSMS的選擇反應(yīng)控制模式(SRM)或多反應(yīng)檢測模式(SRM)，提高信噪比，因此對(duì)復(fù)雜樣品仍可達(dá)到很高的靈敏度。1.2.4 LC-MS-MS體內(nèi)藥物分析是測定體液(主要是血分

18、析條件色譜條件色譜柱為RESTEK Pinnacle C18 柱(150 mm 2. 1 mm , 5m) ; 流動(dòng)相為甲醇-水-10 mmol/L乙酸胺( 80: 10 :10 ) ; 流速200l/min ;柱溫:室溫。質(zhì)譜條件電噴霧ESI 源; 噴霧電壓IS 為4 000 V;霧化溫度400 ; 霧化氣NEB ( GAS1) 為12 Lmin - 1 ;加熱輔助氣AUX( GAS2) 為7 L/min ;簾氣CUR 為6 Lmin - 1 ;碰撞氣CAD 3Lmin - 1 ;檢測方式為正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM) ,用于定量分析的離子分別為m/z 302. 3 m/z 163. 3

19、(DHA) 和m/z 300. 2 m/z 209. 3(內(nèi)標(biāo)ART)高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定人血漿雙氫青蒿素濃度24分析條件高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定人血漿雙氫青蒿素濃度24在選定的檢測條件下,DHA 和內(nèi)標(biāo)ART 生成的基峰離子為其加NH4+ 離子M +NH3 + ,將其基峰離子作為母離子進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描分析,得到二者的全掃描及子離子掃描圖。在選定的檢測條件下,DHA 和內(nèi)標(biāo)ART 生成的基峰離子為根據(jù)DHA 離子掃描圖,在選定的檢測條件下,離子對(duì)mPz 302. 3 m/z 267. 1響應(yīng)明顯高于m/z 302. 3 mPz 163. 3 ,但該離子對(duì)的測定易受到血漿內(nèi)源性物質(zhì)的輕度

20、干擾,為定量準(zhǔn)確,選擇離子對(duì)m/z 302. 3 m/z 163. 3 用于定量分析,不受基質(zhì)效應(yīng)的影響。根據(jù)DHA 離子掃描圖,在選定的檢測條件下,離子對(duì)mPz 3LC-MS/MS 測定血漿雙氫青蒿素(DHA) 的色譜圖A:空白血漿LC-MS/MS 測定血漿雙氫青蒿素(DHA) 的色譜圖AB :空白血漿加DHA(3. 03 ngml - 1) 和內(nèi)標(biāo)1 :DHA雙氫青蒿素; 2 :內(nèi)標(biāo)ART青蒿素B :空白血漿加DHA(3. 03 ngml - 1) 和C:受試者藥后血漿樣品加內(nèi)標(biāo)C:受試者藥后血漿樣品加內(nèi)標(biāo)1.3.5 UPLC與傳統(tǒng)的HPLC 相比，UPLC 的速度、靈敏度及分離度都比HP

21、LC 要高。例：UPLC-UV測定青蒿素的含量26色譜條件：色譜柱: Agilent Eclipse Plus C18( 2. 1 mm 50mm，1. 8 m) ; 流動(dòng)相: 乙腈 水( 45 55) ; 流速:1. 0 mL /min; 柱溫: 28; 檢測波長: 200 nm; 進(jìn)樣體積: 1 L。1.3.5 UPLC與傳統(tǒng)的HPLC 相比，UPLC 的速度青蒿素分析方法的確定2021優(yōu)秀課件1.4 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳法(CE) 具有高效、快速、樣品用量小、耗費(fèi)少等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于藥物分析。CE 電化學(xué)檢測具有裝置簡便易行、價(jià)廉、檢測靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn)，它的性能在分離許多生化物質(zhì)上要優(yōu)

22、于一般的色譜法。帶電粒子與aq中電荷結(jié)合帶電水解帶電E定向運(yùn)動(dòng)電滲流1.4 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳法(CE) 具有高效、快速、樣品CE工作原理3-毛細(xì)管 4-檢測器CE工作原理3-毛細(xì)管 4-檢測器分離條件：分離介質(zhì)4. 0 mmol/ L 三乙胺-2. 0 mmol/ L H3BO3-15. 0 % C2H5O H ,分離電壓22. 0 kV ,20. 0 cm 位差虹吸進(jìn)樣15. 0 s。在該實(shí)驗(yàn)條件下,可在5 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)雙氫青蒿素的分離檢測,雙氫青蒿素的峰面積與含量在3. 0165g/ mL 范圍線性關(guān)系良好,檢出限為1. 0g/ mL 。例：復(fù)方雙氫青蒿素片中雙氫青蒿素的測定28復(fù)

23、方制劑中的其他成分在該條件下并不出峰,故不干擾測定,可能是在優(yōu)化條件下難以電離的緣故采用毛細(xì)管電泳非接觸高頻電導(dǎo)法對(duì)雙氫青蒿素進(jìn)行了快速分析。分離條件：例：復(fù)方雙氫青蒿素片中雙氫青蒿素的測定28復(fù)雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品1. DQHS ; 2. C2H5OH雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品1. DQHS ; 雙氫青蒿素復(fù)方片劑樣品雙氫青蒿素復(fù)方片劑樣品配制一系列不同濃度的雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化條件下考察線性范圍和檢出限。求得雙氫青蒿素的峰面積Y與濃度X的線性回歸方程。配制一系列不同濃度的雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化條件下考察線性文獻(xiàn)引用1廖巧，龍世平，楊春賢.青蒿素提取與檢測工藝的研究進(jìn)展;安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012，

24、40( 28) : 13736 13739.2李春莉, 王莎莉, 王亞平, 柯大智.紫外分光光度法測定青蒿素的含量;重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2007 ,32 (4 ),41.3馬玉樊, 盧婷利 , 陳 濤等.紫外分光光度法測定OPW 型青蒿素脂肪乳劑中青蒿素的含量；分析試驗(yàn)室2007，26增刊，184.4魏增云，陳金娥等.正交設(shè)計(jì)-紫外分光光度法測定青蒿中的青蒿素；光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28（3），1297.5陳靖，趙瑞，陳俊，等.HPLC-UV-ELSD 聯(lián)用測定黃花蒿葉片中青蒿素及相關(guān)倍半萜的含量J.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25（11）897.6李美琴, 范琦 , 張曉松藥物分析雜志.H PL C 一E L SD 法測定復(fù)方雙氫青篙素片中雙氫青篙素的含量;2006, 2 6 (8 ),1163