pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、 pcr擴(kuò)增試驗(yàn)報(bào)告篇一：DNA PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)報(bào)告PCR DNA 瓊脂糖凝膠電泳劉琳 1131428 環(huán)境科學(xué)一、試驗(yàn)?zāi)康腜CR 擴(kuò)增的根本原理與試驗(yàn)技術(shù)。對(duì)擴(kuò)增后的 DNA 進(jìn)展瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，并分析相應(yīng)結(jié)果。二、試驗(yàn)原理PCR 擴(kuò)增多聚酶鏈反響PCR技術(shù)的原理DNA 心管中參加適量緩沖液，參加微量模板DNA、四種脫氧核苷酸dNTP、耐熱 Taq DNA 的引物，而性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。降低溶液溫度，使合成引物在低溫1 與模板 DNA 是所謂退火階段。溶液反響溫度升至中72在TapDNA 的一條雙鏈在解鏈和退火之后延長為兩條雙鏈，這是延長階段。如此反復(fù)，在同一反響體系中可重

2、復(fù)高溫變性、低溫退火和 DNA 合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物 DNA重復(fù)合成，并在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物 DNA 可作為后一循環(huán)的模板DNA DNA DNA 個(gè)循環(huán)，DNA擴(kuò)增即可完成。DNA瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)DNA 分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。在肯定決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。不同構(gòu)型的 DNA 方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA2 應(yīng)，到達(dá)分別混合物的目的。三、試驗(yàn)材料儀器：PCR 擴(kuò)增儀、薄壁管、離心管、移液槍、槍頭、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、制膠版、紫外透射儀。試劑： TapDNA 聚合酶、dNTP、 ddH2O

3、DNA 、TBE、瓊脂糖、EB、顯色劑。四、 試驗(yàn)步驟PCR 擴(kuò)增16S rDNA V3 區(qū)片段進(jìn)展擴(kuò)增。依據(jù)計(jì)算， 首先取離心管依據(jù)10Buffer 1uldNTPul341GCul534、 ul Taq、 ddH2O 的比例配置足量PCR反響體系。9 24 ul8 種不同的模版，并于第 9個(gè)薄壁管中參加無菌ddH2O作為陰性比照。3 3040次。程序如下：預(yù)變性： 94 3min5530s72 30s末次延長：72 5minPCR 擴(kuò)增完成后，將樣品取出并保15環(huán)境中。DNA瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)參加適量的TBE60左右，在膠液內(nèi)參加適量。取有機(jī)玻璃制膠板槽，在一端插好的膠液，使之形成均勻水平

4、的膠面。待膠凝固后，留神拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。在槽內(nèi)參加TBE 4 1l 5l 待測(cè)DNA樣品混合后，用移液槍滴加至凝膠的加樣孔中。開頭電泳。點(diǎn)樣端放陰極端。依據(jù)閱歷調(diào)整電壓使分帶清楚。觀看溴酚蘭的帶藍(lán)色的移動(dòng)。 電泳。一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門，翻開紫外燈，通過觀看孔進(jìn)展觀看。五、試驗(yàn)結(jié)果與爭(zhēng)辯如下圖：從左至右，分別是模版1-8 9 列為陰性比照。8 列均有明顯的條帶消滅，而陰很好。圖中有上下兩條線，上面一條線所5 掩蓋的條帶根本可以代表擴(kuò)增的產(chǎn)生的片段位置，參照?qǐng)D可以看出擴(kuò)增片段200bp 9 個(gè)陰性比照的第帶，并非是消滅假陰性，而是由

5、于二聚物而產(chǎn)生的條帶。通過該條帶與最右側(cè)的marker比照可知該片段消滅在100bp左右，并非由于試驗(yàn)操作等問題而產(chǎn)生的污染。試驗(yàn)的照片顯示試驗(yàn)結(jié)果有拖尾 試驗(yàn)過程中由于有些試劑加到了管壁上面，并沒有完全參加，可能會(huì)消滅一些6 誤1 列條帶中消滅了其他的亮帶，可能是由于在前期的擴(kuò)增試驗(yàn)中滴加試劑時(shí)由于量過少而進(jìn)展的搖勻和融合等操作產(chǎn)生了非特異性擴(kuò)增，也有可能是由于膠板制作過程中梳子的位置不適宜或者膠板制作時(shí)邊緣處不夠均勻?qū)е庐a(chǎn)生污染。但總體而言，試驗(yàn)結(jié)果較為滿足。六、試驗(yàn)留意事項(xiàng)PCR 技術(shù)格外敏感，可使一個(gè) DNA 分子得以擴(kuò)增，裝有 PCR 試劑的離心管翻開之前，應(yīng)先在微量離心機(jī)PCR擴(kuò)增

6、反響的條件，要把握好溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。DNA。配瓊脂糖時(shí)應(yīng)使其完全溶化前方可制膠。具有致癌作用，配制及使用時(shí)應(yīng)帶7 七、試驗(yàn)收獲通過本次試驗(yàn)學(xué)習(xí)并把握了 PCR反響的根本原理、試驗(yàn)過程及技術(shù)。DNA 的原理和方法。八、思考題1某個(gè)酶的基因，你如何進(jìn)展相關(guān)試驗(yàn)？PCR 擴(kuò)增出想要的片段，然后通過凝膠電泳試驗(yàn)進(jìn)展回收，并與適宜的載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過PCR 驗(yàn)證，測(cè)序最終驗(yàn)證，保存菌種2.一 對(duì) 引 物 序 列 為 55-AACCGTGGCGACACCGCTAATm 值及選擇適宜的退火溫度，假設(shè)按你算的退火溫度做PCR 時(shí)沒有得到相應(yīng)的產(chǎn)物，你怎么解決？5-GACTCCAGTCGAA

7、TCTACCA-3Tm值=4G+C+2-8 =43+7+26+4-=60-=50555-AACCGTGGCGACACCGCTAATm值=4G+C+2 -=4+2 -=64-=5459因此退火溫度可以選擇在 55可以通過分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反響以提高特異性。開頭低于估算Tm52為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)削減引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最正確結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。Tm引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表Tm 不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的 Tm 5 或者為了提高特異性，可以在依據(jù)Tm 5 個(gè)Tm 設(shè)計(jì)的退火9 貝。篇二：PCR試驗(yàn)報(bào)告一般生物學(xué)試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)

8、名稱：用PCR擴(kuò)增的方法鑒別不同物種來源的肌肉一、特異性目的片段 DNA 的擴(kuò)增一試驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒错慞olymerase ChainReaction,PCR 是體外酶促合成特異DNA 片段的一種方法，其根本原理為DNAPCR技術(shù)由高溫3 步反響組成一個(gè)循環(huán)，DNA 得以快速DNA 置于高溫下93-94，使其變性解成單鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其適宜的復(fù)性溫度下分別與目的基DNA 聚10 53的方向延長，合成互補(bǔ)鏈。本試驗(yàn)承受物種特異性引物擴(kuò)增的3 種不同物種來源的肌肉。以不同物種來源的動(dòng)物 DNA 在模板和引物的物種相對(duì)應(yīng)的狀況下才會(huì)有特異性條帶的消滅。應(yīng)用此方法，可以特異性地檢測(cè)樣

9、品中痕量的特定DNA成分。二試驗(yàn)步驟不同反響體系的配制按下表將各成分分別參加一做好標(biāo) PCR反響體系，留意酶要最終加，加完后將PCR管放置在冰上。將上述混合液稍加離心，約 10s左右。取下后馬上置于PCR儀中，蓋緊熱蓋，定好PCR儀的反響程序，執(zhí)行擴(kuò)增程序。反響程序?yàn)椋侯A(yù)變性 945min11 變性 94 5s 退火 50 5s 延伸 72 20s 反響完畢后，終止程序，將 PCR30 次二、水平式瓊脂糖凝膠電泳法鑒定PCR產(chǎn)物一試驗(yàn)原理核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液pH )中，其堿基不解離，而磷酸集團(tuán)全部解離，核酸瓊脂糖主要是從海洋植物瓊脂中提取而來并經(jīng)糖基化修飾，為一種

10、聚合鏈線性分子。使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，發(fā)揮分子篩功能，使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率消滅較大差異，從而到達(dá)分別的目的。二試驗(yàn)步驟制膠12 250ml 的錐形瓶120ml1TAE 緩沖液，微波爐40s 直至沸騰，搖動(dòng)，使瓊2 次，直至溶液澄清透亮。待瓊脂糖溫度降到 60左右時(shí)1:20220 的濃度參加 Golden View,混 輕的垂直拔出梳子，將凝膠取出，放入1TAE緩沖液至剛好沒過凝膠有樣品孔的一端靠近負(fù)極。加樣上樣緩沖液混勻，參加到凝膠樣品孔中。每加完一個(gè)樣品應(yīng)更換一個(gè)吸頭。加樣前，要登記加樣的挨次。在每排樣品孔中留5l marker。電泳加樣后的凝膠板馬上通電進(jìn)展電1/

11、3 時(shí)，停頓電泳。13 拍照成像系統(tǒng)拍照保存。三、試驗(yàn)小結(jié)一試驗(yàn)結(jié)果PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果1 和樣品 6200bp 1 DNA，DNA 3二試驗(yàn)爭(zhēng)辯冰浴中，不行握在手中。防止污染，應(yīng)更換吸頭。直，緩慢地拔出，以免破壞膠孔。留少量溶液。14 不要插入太深，以免破壞樣品孔。顯，應(yīng)當(dāng)是加樣時(shí)樣品的量不夠充分，以后應(yīng)留意。篇三：PCR試驗(yàn)報(bào)告PCR試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)?zāi)康模毫私釶CR技術(shù)原理，把握PCR試驗(yàn)步驟。+ DNA 試驗(yàn)原理：? PCR 全稱聚合酶鏈反響，是體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA 序列最常用的方法。? 在接近沸點(diǎn)的溫度下2 DNA 分子，DNA 聚合酶以單鏈 DNA 為模板并利用反響混合物中的四

12、種脫氧核苷三磷酸合DNA 互補(bǔ)鏈。PCR 反響時(shí)，只 15 四種核苷酸及適當(dāng)濃度的 Mg2+，DNA聚合酶就能在數(shù)小時(shí)內(nèi)將目標(biāo)序列擴(kuò)增100萬倍以上。雙鏈模板 DNA 分子首先在高溫下解開成長的單鏈，短鏈引物分子馬上DNA兩端的特定序列相結(jié)合，產(chǎn)生雙鏈區(qū)。DNA聚合酶從引物處開頭復(fù)制其互補(bǔ)鏈，快速產(chǎn)生與目標(biāo)序列完全一樣的復(fù)制品。在后續(xù)反響中，無論是起始DNA DNA 雙鏈，都會(huì)在高溫下解次與其互補(bǔ)序列相結(jié)合，聚合酶也再度DNA。 對(duì)引物，是依據(jù)與擴(kuò)增區(qū)域兩端序列彼此互補(bǔ)的原則設(shè)計(jì)從引物的退火結(jié)合位點(diǎn)開頭并朝反方向16 DNA 鏈上都有的引物結(jié)合位點(diǎn)。 DNA 變性DNA 結(jié)合退火、DNA合成鏈

13、的延長三步可以被不斷重復(fù)。經(jīng)屢次循環(huán)之后，反響混合物中所含有的雙鏈 DNA 結(jié)合位點(diǎn)之間的 DNA 論 上 的 最 高 值 應(yīng) 該 是 217 ，能進(jìn)一步滿足遺傳分析的需要。? 試劑作用：1DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，針對(duì)復(fù)制 DNA 5引物3引物Taq DNA dNTPs與模板結(jié)合。Taq DNA 聚合酶供給一個(gè)最適酶催反響條件。Mg2+PCR 擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。DNA 鏈。石蠟油：防止PCR加熱過程DNA 蒸發(fā)。? 試劑配置體積：1 熱啟動(dòng)：94，510min2 變性：94，4560s。18 Tm51T解鏈溫度=4G+C+2A+。4 延長：72，1。52530個(gè)周期72，10min? 產(chǎn)物檢測(cè)：凝膠電泳。試驗(yàn)步驟：20l 體系各試劑配比：20l 體積配6 管試管量，實(shí)際參加量如下表6 pcr 管中，15l 1-6 號(hào)碼。1-4 PCR 管中參加模5 C3H 模板作作為陰性參照。在加完模板的6管試劑中各參加20l 石蠟油PCR 管放入19 PCR 儀，按之前設(shè)定的加熱溫度與時(shí)間設(shè)置此