藥物分析方法開發(fā)中如何做好加標(biāo)回收率

1、藥物分析方法開發(fā)中如何做好加標(biāo)回收率加標(biāo)回收率，是指在沒有被測物質(zhì)的樣品基質(zhì)中加入定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按樣品的處理步驟分析，得到的結(jié)果與理論值的比值。加標(biāo)回收率的大小不僅反應(yīng)了分析人員的操作技術(shù)水平，更重要的是它反應(yīng)了分析方法是否適合被測基體，幫助分析人員及時地發(fā)現(xiàn)分析中存在的問題，確保分析數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠。一、影響加標(biāo)回收率值的因素1）分析方法及實驗條件有的項目由于分析方法有局限，而造成加標(biāo)回收率值較低；由于實驗條件(裝置、儀器等)較差，對加標(biāo)回收值的影響也較大，例如：水中硫化物的測定。2）樣品中的本底值一般在分析方法適用濃度范圍的中、高濃度水平，加標(biāo)回收率與濃度水平關(guān)系不大。但是，在低濃度區(qū)加標(biāo)

2、回收率要受樣品中本底值的影響。通常，樣品中本底值越低，加標(biāo)回收率越低。3）加標(biāo)量對加標(biāo)回收率的影響a、加入過多或過少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，均不能保證加標(biāo)樣品和樣品中所含待測物濃度在相同的精密度范圍內(nèi)；b、當(dāng)樣品中待測物含量較高時，加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)過高，使加標(biāo)后測定值接近方法的檢出上限，這樣測得加標(biāo)樣中待測物的誤差較大，加標(biāo)后引起的濃度增量在方法測定上限濃度C 的0.40.6倍之間為宜；c、當(dāng)樣品中待測物含量較低時，加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)太少，測得回收率值較差；加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)太多則會改變待測物質(zhì)在加標(biāo)樣品和樣品中的測定背景；d、當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是有機(jī)溶劑時，加標(biāo)量過多，則會造成溶劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)難以在水中溶解，從而因溶解度問題造

3、成對加標(biāo)回收率的影響。二、如何進(jìn)行加標(biāo)回收率的測定 加標(biāo)回收率的測定可以和平行樣的測定相同，一般多按隨機(jī)抽取10%20%的樣品量做加標(biāo)回收率測定。 例如，有10個樣品待測定，則可以從中隨機(jī)抽出2個樣品做加標(biāo)回收率測定。抽出的2個樣品各取4份，其中兩份做平行本底測定，另兩份做平行加標(biāo)回收率測定。 加標(biāo)回收率的測定往往由于樣品中待測物質(zhì)含量未知，難以估計加標(biāo)量，需預(yù)先測定樣品含量，再作回收率測定。由于加標(biāo)回收率受加標(biāo)量大小的影響，因此，必須對加標(biāo)量有所規(guī)定： (1)加標(biāo)物質(zhì)的形態(tài)應(yīng)該和待測物的形態(tài)相同。 (2)加標(biāo)樣品和樣品中待測物濃度應(yīng)控制在精密度相當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。一般情況下規(guī)定： a. 加標(biāo)量應(yīng)盡

4、量與樣品中待測物質(zhì)含量相等或相近，并應(yīng)注意對樣品容積的影響； b. 當(dāng)樣品中待測物質(zhì)含量接近方法檢出限時，加標(biāo)量應(yīng)控制在校準(zhǔn)曲線的低濃度范圍；當(dāng)樣品中待測物含量小于方法檢出限時，以檢出限的量作為待測物質(zhì)的含量加標(biāo)； c. 一般加標(biāo)量不得大于待測物含量的3倍； d. 加標(biāo)后的測定值不應(yīng)超出方法的測定上限的90%； e. 當(dāng)樣品中待測物濃度高于校準(zhǔn)曲線的中間濃度時，加標(biāo)量應(yīng)控制在待測物濃度的半量。三、加標(biāo)回收測定結(jié)果判讀 結(jié)果判斷的一般方法加標(biāo)回收率測定所得結(jié)果一般按方法規(guī)定的水平進(jìn)行判斷，或在質(zhì)量控制圖中檢驗。在沒有這兩項依據(jù)時，可按95%105%的域限做判斷標(biāo)準(zhǔn)，超出此域限的，再按測定結(jié)果的標(biāo)

5、準(zhǔn)差、自由度、給定的置信限和加標(biāo)量計算加標(biāo)回收率的可按受域P。計算公式為：四、加標(biāo)回收率的種類 加標(biāo)回收率分為：分空白加標(biāo)回收率和樣品加標(biāo)回收率兩種?？瞻准訕?biāo)回收 在沒有被測物質(zhì)的空白樣品基質(zhì)中加入定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按樣品的處理步驟分析，得到的結(jié)果與理論值的比值即為空白加標(biāo)回收率。樣品加標(biāo)回收 相同的樣品取兩份，其中一份加入定量的待測成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；兩份同時按相同的分析步驟分析，加標(biāo)的一份所得的結(jié)果減去未加標(biāo)一份所得的結(jié)果，其差值同加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的理論值之比即為樣品加標(biāo)回收率。 加標(biāo)回收率的測定，是實驗室內(nèi)經(jīng)常用以自控的一種質(zhì)量控制技術(shù)，對于它的計算方法，給定了一個理論公式：加標(biāo)回收率=(加標(biāo)試樣測

6、定值試樣測定值)加標(biāo)量100%五、樣品加標(biāo)理論 加標(biāo)回收率的解釋是:“在測定樣品的同時,于同一樣品的子樣中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測定,將其測定結(jié)果扣除樣品的測定值，以計算回收率?！?因此，使用理論公式時應(yīng)當(dāng)滿足以下2個條件： 同一樣品的子樣取樣體積必須相等； 各類子樣的測定過程必須按相同的操作步驟進(jìn)行；理論公式使用的約束條件 加標(biāo)量不能過大，一般為待測物含量的0.52.0倍，且加標(biāo)后的總含量不應(yīng)超過方法的測定上限；加標(biāo)物的濃度宜較高，加標(biāo)物的體積應(yīng)很小，一般以不超過原始試樣體積的1%為好。理論公式的不足之處 各文獻(xiàn)對公式中“加標(biāo)量”一詞的定義，均未準(zhǔn)確給定，使其含義不是十分明確。從公式的分子

7、上分析，加標(biāo)量應(yīng)為濃度單位；從公式的分母上理解，應(yīng)為加入一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值，為質(zhì)量單位。 若公式中的加標(biāo)量為濃度單位，此時的加標(biāo)量并不是指標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，而應(yīng)該是加標(biāo)體積所含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值除以試樣體積（或除以試樣體積與加標(biāo)體積之和）所得的濃度值。這里存在著濃度換算，而在理論公式中并沒有明確予以表現(xiàn)出來。六、計算方法及數(shù)學(xué)表達(dá)式【以濃度值計算加標(biāo)回收率理論公式】P=（C2C1）/C3100%式中：P為加標(biāo)回收率；C1為試樣濃度, 即，試樣測定值，C1=m1/V1；C2為加標(biāo)試樣濃度，即，加標(biāo)試樣測定值，C2=m2/V2；C3為加標(biāo)量，C3= C0V0/V2：m=C0V0；m1

8、為試樣中的物質(zhì)含量；m2為加標(biāo)試樣中的物質(zhì)含量；m為加標(biāo)體積中的物質(zhì)含量；V1為試樣體積；V2為加標(biāo)試樣體積，V2=V1+V0；V0為加標(biāo)體積；C0為加標(biāo)用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。【以吸光度值計算加標(biāo)回收率】 本方法僅限于用光度法分析樣品時使用，在光度法分析過程中，會用到校準(zhǔn)曲線Y=bx+a，導(dǎo)出量值公式為：x=Ya/b計算結(jié)果不受加標(biāo)體積影響的情況 （1）樣品分析過程中有蒸發(fā)或消解等可使溶液體積縮小的操作技術(shù)時，盡管因加標(biāo)而增大了試樣體積，但是，樣品經(jīng)處理后重新定容并不會對分析結(jié)果產(chǎn)生影響，比如，采用酚二磺酸分光光度法分析水中的硝酸鹽氮(GB7480287)，樣品及加標(biāo)樣品經(jīng)水浴蒸干后，需要重新定容到

9、50mL再行測定。 （2)樣品分析過程中可以預(yù)先留出加標(biāo)體積的項目，比如，采用離子選擇電極法分析水中的氟化物(GB7484287)，當(dāng)樣品取樣量為35mL、加標(biāo)樣取5.0mL以內(nèi)時，仍可定容在50mL，對分析結(jié)果沒有影響。 （3)當(dāng)加標(biāo)體積遠(yuǎn)小于試樣體積時，可不考慮加標(biāo)體積的影響，比如，采用4-氨基安替比林萃取光度法分析水中的揮發(fā)酚(GB7490287)，加標(biāo)體積若為1.0mL，而取樣體積為250mL時，加標(biāo)體積引起的誤差可以忽略不計。七、標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入方法 加標(biāo)回收率是控制樣品前處理好壞的依據(jù)，應(yīng)該在樣品處理前加入。相同的樣品取兩份，其中一份加入定量的待測成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，兩份同時按相同的分析步驟分析。加標(biāo)回收率=(加標(biāo)樣品的結(jié)果-未加標(biāo)樣品)/加標(biāo)理論值。注意事項 1.加標(biāo)物的形態(tài)應(yīng)和待測物的形態(tài)相同。 2.加標(biāo)量應(yīng)和樣品中所含待測物的測量精密度控制在相同的范圍內(nèi)。一般情況下作如下規(guī)定： （1）加標(biāo)量應(yīng)盡量與樣品中待測物含量相等或相近，并應(yīng)注意對樣品容積的影響； （2）當(dāng)樣品中待測物含量接近方法檢出限時，加標(biāo)量應(yīng)控制在校準(zhǔn)曲線的低濃度范圍； （3）在任何情況下加標(biāo)量均不得大于待測物含量的