腫瘤細(xì)胞遷移實驗講義

1、（細(xì)胞劃痕法）實驗導(dǎo)讀瘤組織的增殖失控、瘤細(xì)胞的分化異樣、瘤細(xì)胞擁有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特點，而侵襲和轉(zhuǎn)移又是惡性腫瘤威迫患者健康以致生命的主要原由。所以研究腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的規(guī)律及其發(fā)活力制，對惡性腫瘤的防治有重要意義。腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位侵入淋巴管、血管或體腔，至靶組織或靶器官，長出與原發(fā)瘤不相連續(xù)而組織學(xué)種類同樣的腫瘤。前者稱為原發(fā)瘤，后者稱為轉(zhuǎn)移瘤或繼發(fā)瘤。圖1腫瘤轉(zhuǎn)移表示圖依據(jù)腫瘤異質(zhì)性理論，大部分惡性腫瘤最先雖屬單克隆發(fā)源，但它在不停增殖演進(jìn)至臨床顯然的腫瘤時，因為瘤細(xì)胞遺傳性狀的不穩(wěn)固性(來自基因突變或缺失等)而不停地變異，造成該腫瘤內(nèi)瘤細(xì)胞亞群表

2、型的多樣性，諸如瘤細(xì)胞的侵襲性、生長速率、轉(zhuǎn)移能力，核型以致對激素的反響性和抗腫瘤藥物的敏感性等，這些瘤細(xì)胞亞群擁有被此不一樣的特征即所謂異質(zhì)性。異質(zhì)性與腫瘤轉(zhuǎn)移直接相關(guān)的就是癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能有高低之分，擁有高轉(zhuǎn)移潛能的筋細(xì)胞易發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的運動性，根源于細(xì)胞運動“接觸克制”的觀點。經(jīng)過體外培育正常和惡性結(jié)締組織細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)正常纖維母細(xì)胞在挪動過程中惹起的皺棲腦膜與其余細(xì)胞的表面接觸時，常常產(chǎn)生細(xì)胞膜活動的克制和挪動中細(xì)胞的縮短，而后停止。當(dāng)纖維母細(xì)胞生長過程中在培養(yǎng)皿上交融形成一單層時，細(xì)胞運動即明顯遇到克制。間變的瘤子細(xì)胞則缺少接觸克制，瘤細(xì)胞的運動不會被正常纖維母細(xì)

3、胞所克制。針對腫瘤轉(zhuǎn)移這一復(fù)雜的過程，人們研制了各樣抗轉(zhuǎn)移藥物，如血小板凝聚克制劑、血管生成克制因子、內(nèi)皮穩(wěn)固因子、擾亂素以及其余化學(xué)藥物。細(xì)胞劃痕法是測定了腫瘤細(xì)胞的運動特征的方法之一。其借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實驗?zāi)Ｐ?，在體外培育的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，而后加入藥物察看其克制腫瘤細(xì)胞遷徙的能力。下列圖即為劃痕實驗的表示圖，圖中可見，在細(xì)胞層上出現(xiàn)一道空痕（A），當(dāng)加入藥物后，由于藥物的作用使細(xì)胞遷徙遇到克制(B)，而未加入藥物的細(xì)胞保持了原有的遷徙能力，在一段時間后經(jīng)過遷徙將劃痕掩飾(C)。ABC圖2實驗結(jié)果（A表示在單層細(xì)胞上劃出的一道痕；B表示加入克制劑，為陽性比較組；C表示未加入克制劑，

4、為陰性比較組）一、實驗?zāi)康?認(rèn)識腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基根源理2認(rèn)識測定細(xì)胞運動特征的方法細(xì)胞劃痕法二、實驗原理腫瘤細(xì)胞在體外仍擁有遷徙的能力，本實驗借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實驗?zāi)Ｐ停眉?xì)胞劃痕法測定了腫瘤細(xì)胞的運動特征。三、儀器和試劑1）細(xì)胞系及其培育：肝腫瘤細(xì)胞HepG22）24孔板，移液器，倒置顯微鏡，3）主要試劑：PBS，DMEM培育液，%胰酶，胎牛血清，5-氟尿嘧啶溶液（1ug/ml）四、實驗步驟5-氟尿嘧啶溶液的配制精細(xì)稱取10mg用滅菌蒸餾水溶解，定容于100ml容量瓶，精細(xì)移取1ml溶液，稀釋至100ml，即得1ug/ml5-氟尿嘧啶溶液。2制備單層細(xì)胞將細(xì)胞密度為510105個/mL的

5、HepG2細(xì)胞鋪于24孔板（每孔500uL）上，加入含10胎牛血清的培育液，培育1624h,使形成單層細(xì)胞。3劃痕以五氟尿嘧啶（5Fu）為例，第一配制1g/L的母液，取45L該母液用PBS稀釋至mL，獲得濃度為40g/ML的5Fu溶液。用10uL移液槍槍頭（或許無菌牙簽）在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，用PBS沖洗3次，而后加入上邊配好的5Fu溶液，平行兩個樣本，孵育24h后換成含10胎牛血清的培育液，孵育24h。4察看并攝影吸去培育液，用PBS沖洗3次后，在倒置熒光顯微鏡下察看并攝影。五、注意事項：1實驗時應(yīng)注意細(xì)胞生長情況，選擇適合的細(xì)胞接種濃度。對不一樣的細(xì)胞要察看細(xì)胞的貼壁率等，確立實驗時

6、細(xì)胞的接種數(shù)目和培育時間，保證培育停止時密度適合。2在用PBS緩沖液沖刷時，注意貼壁慢慢加入，免得沖散單層貼壁細(xì)胞，影響實驗攝影結(jié)果。3在藥物的挑選過程中，其對細(xì)胞遷徙能力的影響也是重要的一方面。實驗設(shè)計過程中需要選擇適合的陽性比較組和陰性比較組。六、思慮題怎樣用實驗考證化學(xué)物質(zhì)能恢復(fù)或許加強(qiáng)細(xì)胞的遷徙能力？怎樣防止化學(xué)物質(zhì)濃度過高造成的細(xì)胞毒性對實驗的影響？七、參照文件：1司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正；細(xì)胞培育；興界圖書第一版企業(yè)；2004年3月第1版2MaryBirch,StephenMitchell,andIanR.andCharacterizationofHumanMelanomaCellVariantsExpressingHighandLowLevelsofCD44.CANCERRESEARCH1991;51:6660-6667.3何賢峰，楊述華等.唑來膦酸對骨血瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.腫瘤