WATERS公司的UPLC-TQD培訓(xùn)資料MS1LCMS基礎(chǔ)

1、WATERS公司的UPLC-TQD培訓(xùn)資料MS1LCMS基礎(chǔ)WATERS公司的UPLC-TQD培訓(xùn)資料MS1LCMS基礎(chǔ)什么是質(zhì)譜(Mass Spectrum)不同質(zhì)荷比的離子經(jīng)質(zhì)量分析器分離,而后被檢測并記錄下來的譜圖叫作質(zhì)譜圖.簡稱質(zhì)譜質(zhì)譜圖的橫坐標(biāo)是質(zhì)荷比(m/z)，縱坐標(biāo)是離子強度質(zhì)譜法(Mass Spectrometry)即質(zhì)譜分析法,一般亦簡稱為質(zhì)譜什么是質(zhì)譜(Mass Spectrum)不同質(zhì)荷比的離子經(jīng)質(zhì)氯霉素的質(zhì)譜圖氯霉素的質(zhì)譜圖MS 檢測的是離子質(zhì)量MS 檢測的是離子質(zhì)量質(zhì)譜基礎(chǔ)知識 質(zhì)譜中采用的質(zhì)量單位Da=Dalton (道爾頓 ) 質(zhì)量單位,等于一個碳原子(12C)質(zhì)

2、量的十二分之一，約為1.6610 -24克;一克約為610 23道爾頓amu=atomic mass unit ,原子質(zhì)量單位 1amu=1Da質(zhì)譜基礎(chǔ)知識 質(zhì)譜中采用的質(zhì)量單位質(zhì)譜基礎(chǔ)知識 同位素: 具有相同的原子序數(shù)而又具有不同的質(zhì)量數(shù) 的原子叫作同位素同位素豐度: 自然界中某同位素原子所占的百分?jǐn)?shù)叫做該同 位素的天然豐度 質(zhì)譜基礎(chǔ)知識 同位素:同位素表示法C126C136質(zhì)量數(shù) = 質(zhì)子 + 中子原子序數(shù) = 質(zhì)子數(shù)具有相同的元素符號,在元素符號的左上角表明其質(zhì)量數(shù)同位素表示法C126C136質(zhì)量數(shù) = 質(zhì)子 + 中子原子序天然同位素豐度 氮 14N 14.0031 99.64 15N

3、15.0001 0.36硫32S31.972195.033S32.97150.7634S33.96794.22氯35Cl34.968975.7737Cl36.9659 24.23溴79Br78.918350.6981Br80.916349.31 原子符號質(zhì)量, amu% 天然豐度天然同位素豐度 氮 14N 怎樣計算質(zhì)量數(shù)名義質(zhì)量數(shù)采用元素質(zhì)量數(shù)的整數(shù)進(jìn)行計算,例如:C=12,H=1,O=16單同位素質(zhì)量數(shù)或準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)用豐度最大的同位素準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)計算例如：C=12，1H=1.0078，16O=15.9948 平均質(zhì)量數(shù)或化學(xué)質(zhì)量數(shù)考慮到所有天然同位素豐度的該元素原子量來計算例如：C=12.001

4、，H=1.00794，O=15.9994質(zhì)譜獲得的單電荷離子的m/z值，是單同位素質(zhì)量數(shù)怎樣計算質(zhì)量數(shù)名義質(zhì)量數(shù)MS分子量的計算利血平, C33H40N2O9,的MW的計算 使用原子量: 使用單一同位素質(zhì)量:C: 33 x 12.011 = 396.363 C: 33 x 12.0000 = 396.000 H: 40 x 1.0079 = 40.316 H: 40 x 1.0078 = 40.312 N: 2 x 14.0067 = 28.013 N: 2 x 14.0031 = 28.006 O: 9 x 15.9994 = 143.995 O: 9 x 15.9949 = 143.954

5、 608.687 608.272MS分子量的計算利血平, C33H40N2O9,的MW的計算質(zhì)譜名詞與術(shù)語質(zhì)荷比(mass charge ratio): 離子的質(zhì)量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,叫作質(zhì)荷比,簡寫為m/z質(zhì)荷比是質(zhì)譜圖的橫坐標(biāo)質(zhì)荷比是質(zhì)譜定性分析的基礎(chǔ)質(zhì)譜名詞與術(shù)語質(zhì)荷比(mass charge ratio):離子豐度 (Abundance of ions): 檢測器檢測到的離子信號強度離子相對豐度 (Relative abundance of ions): 以質(zhì)譜圖中指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)最強峰(基峰)的強度為100, 其它離子峰對其歸一化所得的強度

6、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖均以離子相對豐度值為縱坐標(biāo) 譜峰的離子豐度與物質(zhì)的含量相關(guān),因此是質(zhì)譜定量的基礎(chǔ)質(zhì)譜名詞與術(shù)語 離子豐度 (Abundance of ions): 質(zhì)譜名詞MS是高真空技術(shù)質(zhì)譜儀之所以在高真空下工作是為了 .盡量減少離子-分子之間的碰撞 (即,得到最大平均自由程)碰撞可能導(dǎo)致離子偏離所期望的由離子源到檢測器的通道碰撞可能導(dǎo)致產(chǎn)生意外的離子或反應(yīng)平均自由程:1 atm10 -6 m ; 10-4 torr 0.5 m防止在高電壓 (用于某些離子聚焦)下生成電弧減少污染/化學(xué)噪音MS是高真空技術(shù)質(zhì)譜儀之所以在高真空下工作是為了 .MS的歷史1910年 世界上第一臺現(xiàn)代意義質(zhì)譜儀在英國劍橋

7、 Cavendish實驗室出現(xiàn)1917年 電噴霧(Electrospray) 物理現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn) (并非 為了 MS)1918年 世界上第一臺實際意義質(zhì)譜儀在美國芝加哥 大學(xué)實驗室出現(xiàn)(扇型磁場MS)1943年 世界上第一臺商業(yè)質(zhì)譜儀1953年 四極桿質(zhì)量分析器質(zhì)譜儀1955年 飛行時間質(zhì)量分析器質(zhì)譜儀1960s 開發(fā)GC/MSMS的歷史1910年 世界上第一臺現(xiàn)代意義質(zhì)譜儀在英國MS的歷史60s-70s 大氣壓電離(APcI)源被發(fā)現(xiàn)(但并未被廣泛 應(yīng)用)70s-80s 開始廣泛研究 LC/MS1979年 傳送帶式 LC/MS 接口成為商業(yè)產(chǎn)品1982年 離子束LC/MS接口出現(xiàn)1984年 第一

8、臺電噴霧 MS儀宣告誕生 1988年 電噴霧離子源 MS 首次應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分析.MS的歷史60s-70s 大氣壓電離(APcI)源被質(zhì)譜的分類 按離子源的種類分EI (電子轟擊源)質(zhì)譜(常用于GC-MS系統(tǒng))API (大氣壓電離源)質(zhì)譜(常用于LC-MS系統(tǒng))MALDI(基質(zhì)輔助激光解吸電離源)質(zhì)譜(常用于生物大分子分析)按質(zhì)量分析器的種類分四極桿(Quadrupole)質(zhì)譜離子阱(Ion Trap)質(zhì)譜飛行時間(Time of Flight,TOF)質(zhì)譜扇形磁場(Magnetic Sector)質(zhì)譜質(zhì)譜的分類 按離子源的種類分什么是液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS)LC/MS=LC+MS什么是液質(zhì)聯(lián)用

9、(LC/MS)LC/MS=LC+MSLC/MS中的液相色譜High Performance Liquid Chromatography(HPLC) -高效液相色譜Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC) -超高效液相色譜液質(zhì)聯(lián)用的前提和基礎(chǔ)=進(jìn)樣+分離根據(jù)化合物的化學(xué)特性分離樣品(比如極性化合物，非極性化合物，酸性化合物，堿性化合物等等)LC的特點:分離技術(shù)分離效率高流動相參與分離連續(xù)流出,峰寬有限有時需要使用緩沖鹽提高分離度高壓環(huán)境工作( 1000 psi)LC/MS中的液相色譜High Performance Li LC/MS中的質(zhì)譜Mas

10、s Spectrometry-質(zhì)譜質(zhì)量是物質(zhì)固有特征之一，不同的物質(zhì)有不同的質(zhì)量譜分析物被轉(zhuǎn)化為氣相離子而被分析這些離子按其質(zhì)荷比 (m/z)被分離而被檢測質(zhì)譜圖即是相關(guān)的離子流對m/z的圖MS的特點靈敏度高定性/定量本領(lǐng)高脈沖掃描采集數(shù)據(jù)高真空環(huán)境工作溶劑參與反應(yīng)(API電離源) LC/MS中的質(zhì)譜Mass Spectrometry-質(zhì)LC/MS 數(shù)據(jù)形式 TIC色譜 m/z1001502002503003509110712314517519132379201341402384366M -18M+M -36M -79M -162241保留時間TICLC/MS 數(shù)據(jù)形式 TIC色譜 m/z10

11、01502002為什么使用 LC/MS? 豐富的結(jié)構(gòu)信息(1)Min12141618202224262830 124357500600700800695100200300400500600700800219.0696.7EI HOCH CH O222COCH CH 22NHCONaugardAPI為什么使用 LC/MS? 豐富的結(jié)構(gòu)信息(1)Min121為什么使用 LC/MS? 極高的靈敏度 (2)為什么使用 LC/MS? 極高的靈敏度 (2)5 個數(shù)量級的動態(tài)線性范圍 (0.1pg - 1000pg)實驗系數(shù)= 0.9975,樣品:磺胺二甲氧噠嗪上柱分析為什么使用 LC/MS? 極佳的定量結(jié)

12、果(3)5 個數(shù)量級的動態(tài)線性范圍 (0.1pg - 1000pg)為什么使用 LC/MS? 進(jìn)一步增加HPLC的分離能力(4)如果讓您來選擇，您滿意那一種分離度?為什么使用 LC/MS? 進(jìn)一步增加HPLC的分離能力(為什么使用 LC/MS? 解決無UV吸收樣品分析問題(5)LC_MS_OK5.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.00Time0100%0100%TaiyuanLC_MS52: Diode Array 254 1.00Da1.71e6x36TaiyuanLC_MS51: Scan AP+ BPI8.29e45.844.812.912.272.0

13、44.007.229.1211.599.9814.8713.1519.1217.4025.1621.4222.5233.7833.3228.8426.8235.0438.2639.52為什么使用 LC/MS? 解決無UV吸收樣品分析問題(5)兩種 LC/MS 系統(tǒng)示意圖液質(zhì)聯(lián)用接口 至真空離子源質(zhì)量分析器 檢測器離子源液質(zhì)聯(lián)用接口至真空質(zhì)量分析器檢測器高真空部分高真空部分樣品引入樣品引入EI電離源API電離源兩種 LC/MS 系統(tǒng)示意圖液質(zhì)聯(lián)用接口 至真空離子源質(zhì)量分 LC/MS聯(lián)用的難點 進(jìn)樣方式比較 對真空泵的要求 * (liters/sec) 毛細(xì)管 GC, 1mL/min (氣體) 4

14、00 微柱 LC, 10 L/min 5,000 填充柱 LC, 1 mL/min 50,000 *為了保持 3 x 10-6 torr (4 x 10-6 mbar)的真空LC/MS 接口必須使LC流出的液流達(dá)到 MS 可接受的壓力(10-5 - 10-6 torr) 同時以極小的譜帶展寬盡可能多地輸送樣品離子到MS LC/MS聯(lián)用的難點 進(jìn)樣方式比LC/MS聯(lián)用關(guān)鍵技術(shù)接口液相色譜的出口情況: 從液相色譜流出的組分存在于大氣壓條件下的溶液之中 質(zhì)譜的入口情況: 在高真空工作條件下的質(zhì)譜僅接受氣相離子 因此液質(zhì)聯(lián)用的接口必須完成三個轉(zhuǎn)變:物態(tài)轉(zhuǎn)變: 液態(tài) - 氣態(tài)帶電狀態(tài): “中性” - 離

15、子真空變化: 760 torr - 10-5-10-8 torr(乇)要求:霧化,去溶劑和電離同時完成LC/MS聯(lián)用關(guān)鍵技術(shù)接口液相色譜的出口情況: 從液相色譜API LC/MS 的 Z-Spray接口API LC/MS 的 Z-Spray接口Z-Spray 接口技術(shù)第 1 次進(jìn)樣第 509次進(jìn)樣25小時苯海拉明, 10mM 磷酸鹽緩沖液Z-Spray 接口技術(shù)第 1 次進(jìn)樣苯海拉明, 10mM MS的電離技術(shù)質(zhì)量過濾器樣品引入MS的電離技術(shù)質(zhì)量過濾器樣品引入質(zhì)譜的種類及相關(guān)聯(lián)用技術(shù)GCLCCEFlow InjProbePB/EIESIAPCITSPFABMALDIQuadrupoleMagn

16、etic SectorTime of FlightIon TrapFT-MSElectron MultiplierPhotomultiplierMicrochannel PlateTurbo Mechanical離子分離模式質(zhì)量分析器離子檢測數(shù)據(jù)的采集及處理樣品的引入模式溶劑的去除或抽 真空方式質(zhì)子化模式質(zhì)譜的種類及相關(guān)聯(lián)用技術(shù)GCLCCEFlow InjProb同一個樣品的質(zhì)譜圖可能不一樣同一個樣品的質(zhì)譜圖可能不一樣傳統(tǒng)的樣品電離方式：EI源EI源：電子轟擊電離源可得經(jīng)典的質(zhì)譜譜圖可查詢質(zhì)譜庫，質(zhì)譜結(jié)果可用工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，是絕對的化合物鑒定相對易得，耐受性好譜圖可解析,闡明結(jié)構(gòu)信息但是,電

17、離效率較差，測定的分子量范圍、流速范圍有限；可測的化合物類型有限M樣品進(jìn)入燈絲集電極離子聚焦透鏡離子去分析器-擋板+傳統(tǒng)的樣品電離方式：EI源EI源：電子轟擊電離源M樣品進(jìn)入燈EI 譜庫:幾十年積累的寶貴財富High Res Mass Spec, Brown, Kamano, Pettit, Org. Mass Spec., 1972Waters Integrity LC/MS System, Pfizer, 2019EI 譜庫:幾十年積累的寶貴財富High Res Mass 大氣壓電離 (API) 技術(shù)電噴霧電離Electrospray Ionization ESI大氣壓化學(xué)電離Atmosp

18、heric Pressure Chemical Ionization - APCI大氣壓電離 (API) 技術(shù)電噴霧電離電噴霧(ESI) 離子化過程電噴霧離子化可分為三個過程:形成帶電小液滴溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂最終形成氣相離子電噴霧(ESI) 離子化過程電噴霧離子化可分為三個過程: ESI的特點低分子量化合物一般產(chǎn)生單電荷離子(失去或得到一個質(zhì)子) 高分子量生物大分子和聚合物產(chǎn)生多電荷離子幾乎沒有碎片離子可能生成加合物和/或多聚體常見的是溶劑加合物和NH4+(M+18), Na+(M+23),和K+(M+39) 加合物靈敏度取決于化合物本身和基質(zhì) ESI的特點低分子量化合物一般產(chǎn)生單電荷離子(

19、失去或得到一ESI+ 電離模式滅多蟲MW 162產(chǎn)生 M+H+ 準(zhǔn)分子離子峰ESI+ 電離模式滅多蟲產(chǎn)生 M+H+ 準(zhǔn)分子離子峰大氣壓化學(xué)電離 (APCI)過程大氣壓化學(xué)電離可分為以下兩個步驟:快速蒸發(fā)氣相化學(xué)電離(電暈放電)大氣壓化學(xué)電離 (APCI)過程大氣壓化學(xué)電離可分為以下兩個APCI的特點一般而言, 只生成單電荷離子幾乎沒有碎片離子可能生成加合物和/或多聚體; 一般是溶劑加合物及NH4+ (M+18), Na+ (M+23), 和 K+(M+39)加合物 基質(zhì)影響較小 (相對于ESI), 質(zhì)譜圖不受緩沖鹽及其緩沖力變化的影響APCI的特點一般而言, 只生成單電荷離子API與傳統(tǒng)電離技

20、術(shù)的區(qū)別液質(zhì)聯(lián)用接口 至真空離子源質(zhì)量分析器 檢測器離子源液質(zhì)聯(lián)用接口至真空質(zhì)量分析器檢測器高真空部分高真空部分樣品引入樣品引入EI電離源API電離源API與傳統(tǒng)電離技術(shù)的區(qū)別液質(zhì)聯(lián)用接口 至真空離子源質(zhì)量分析不同電離技術(shù)的適用范圍 分子量化合物極性API(APcI-ESI)ParticleBeam(EI-CI)GC/MS(EI-CI)非極性極性(離子)102103104105APPI不同電離技術(shù)的適用范圍 分子量化合物極性APIP液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的質(zhì)量分析器質(zhì)量過濾器樣品引入液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的質(zhì)量分析器質(zhì)量過濾器樣品引入A. 磁質(zhì)譜通過磁場和電場來傳輸和選擇離子+離子源電場磁場A. 磁質(zhì)譜通過磁場和電場來傳輸和選擇離子+離子源電場磁B. 飛行時間質(zhì)譜所有離子一同起跑質(zhì)量小的跑得快時間分辨 +離子源B. 飛行時間質(zhì)譜所有離子一同起跑+離子源SourceDetectorNonresonant IonResonant Iondc and Rf voltagesC. 四極桿質(zhì)量分析器被分析離子由DC和RF電壓控制SourceDetectorNonresonant IonRD. 離子阱原理與四極桿類似 離子被 RF & DC 電場所儲存掃描電場可以釋放特定的m/z離子D. 離子阱原理與四極桿類似 分析器 m/z范圍 分辨率 質(zhì)量精度 動態(tài)范圍 真空 四極桿 103