酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)堿性磷酸酶值測(cè)定PPT

1、關(guān)于酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)堿性磷酸酶值測(cè)定第一張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 影響酶促反應(yīng)速度的因素酶促反應(yīng)速度CFDEA底物濃度酶濃度pH值抑制劑激活劑B溫度第二張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響正比例關(guān)系底物濃度酶濃度酶被底物飽和第三張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快。另一方面,溫度升高,酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。 在最適溫度條件下,反應(yīng)速度最大。第四張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pH 對(duì)反應(yīng)速度的影響在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常稱此pH

2、 為最適 pH。第五張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月激活劑對(duì)反應(yīng)速度的影響必需激活劑，大多為金屬離子，Mg2，K，Mn2，等酶的激活劑非必需激活劑第六張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抑制劑通常以非共價(jià)鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶活性降低或消失。抑制劑通常以共價(jià)鍵與酶活性中心或活性中心以外的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活。不可逆性抑制作用可逆性抑制作用抑制劑對(duì)反應(yīng)速度的影響第七張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月競(jìng)爭(zhēng)性非競(jìng)爭(zhēng)性反競(jìng)爭(zhēng)性Km, Vmax降低競(jìng)爭(zhēng)性非競(jìng)爭(zhēng)性反競(jìng)爭(zhēng)性Vmax降低競(jìng)爭(zhēng)性非競(jìng)爭(zhēng)性反競(jìng)爭(zhēng)性Km增大可逆性抑制作用第八張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于20

3、22年6月底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響底物濃度的增高高低反應(yīng)速度和底物濃度成正比關(guān)系酶活性中心被底物飽和反應(yīng)速度增幅下降第九張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)酶促反應(yīng)速率一般在規(guī)定反應(yīng)條件下，用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量來表示。反應(yīng)速率取其初速率，即底物的消耗量很小(5%)時(shí)的反應(yīng)速率。底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度。研究前提第十張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月矩形雙曲線 第十一張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十二張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Km 即為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速度當(dāng)反應(yīng)速度等于最大速度一半時(shí),即V = 1/2

4、Vmax, Km = S 上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。米曼氏方程式第十三張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月米氏常數(shù)Km的意義不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測(cè)定的，不同條件下具有不同的Km值。Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。 第十四張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 Vmax定義：Vm是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。意義：Vmax=

5、K3 E如果酶的總濃度已知，可從Vmax計(jì)算 酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(turnover number)，即動(dòng)力學(xué)常數(shù)K3。第十五張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月米氏常數(shù)的求法1V=KmVmaxS11+Vmax V表示酶促反應(yīng)速度 Vmax表示酶促反應(yīng)最大速度 S表示底物濃度 Km表示米氏常數(shù)第十六張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙倒數(shù)作圖法第十七張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月底物濃度對(duì)酶活性的影響堿性磷酸酶Km值的測(cè)定第十八張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中的一個(gè)相當(dāng)重要的常數(shù)，通過實(shí)驗(yàn)，可理解并掌握利用實(shí)驗(yàn)求出Km的方法。第十九張，PPT

6、共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)原理磷酸苯二鈉堿性磷酸酶H2OpH=10.0，37酚Na2HPO4酚試劑（磷鉬鎢酸）OH藍(lán)色化合物650nm吸光度表示不同底物濃度時(shí)的酶反應(yīng)速度。以吸光度的倒數(shù)作縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)，按Lineweaver-Burk作圖法求出Km值。第二十張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1酚試劑22.5mmolL磷酸苯二鈉基質(zhì)液 3堿性緩沖液(pH-10.0)4堿性磷酸酶液試劑第二十一張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月試劑(ml)123456782.5mM磷酸苯二鈉0.20.30.40.50.60.81.01.0蒸餾水0.80.70.60.50

7、.40.2-堿性緩沖液1.01.01.01.01.01.01.01.0混勻后，370C水浴 5 min堿性磷酸酶液0.10.10.10.10.10.10.1-混勻后，370C水浴 15 min（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）酚試劑1.01.01.01.01.01.01.01.0堿性磷酸酶液-0.110 Na2CO33.03.03.03.03.03.03.03.0操作取8支試管，按下表加入試劑。 混勻后，37水浴15min，以第8管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在650nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，讀取各管A值。第二十二張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月管號(hào)A6501/A650S1/S1234567處理結(jié)果以1/A650對(duì)1/s按Lineweaver-Burk作圖法作圖，求出堿性磷酸酶的Km第二十三張，PPT共二十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 在競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，酶不能同時(shí)和底物、抑制劑結(jié)合，即不能形成EIS，I競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶活性中心，其動(dòng)力學(xué)特征是：米氏常數(shù)的表觀值Km增加，酶的最大反應(yīng)速度Vm不變。 在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，抑制劑、底物都能同時(shí)和酶結(jié)合形成EIS， I結(jié)合酶活性中心以外部位，不影響E與S之間的結(jié)合，但是EIS不能進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，其動(dòng)力學(xué)特征是：Vm降低而Km不變。 在反競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，抑制劑必須在