人力資源HPLC培訓(xùn)教程

1、HPLCC培訓(xùn)教教程我國藥典典收載高高效液相相色譜法法項(xiàng)目和和數(shù)量比比較表：方法項(xiàng)目數(shù)量19855年版19900年版19955年版20000年版HPLCC法鑒別934150檢查1240160含量測定定760117387鑒于HPPLC應(yīng)應(yīng)用在藥藥品分析析中越來來越多，因因此每一一個藥品品分析人人員應(yīng)該該掌握并并應(yīng)用HHPLCC。I概論論一、液相相色譜理理論發(fā)展展簡況色譜法的的分離原原理是：溶于流流動相(mobbilee phhasee)中的的各組分分經(jīng)過固固定相時(shí)時(shí)，由于于與固定定相(sstattionnaryy phhasee)發(fā)生生作用（吸吸附、分分配、離離子吸引引、排阻阻、親和和）的大大小

2、、強(qiáng)強(qiáng)弱不同同，在固固定相中中滯留時(shí)時(shí)間不同同，從而而先后從從固定相相中流出出。又稱稱為色層層法、層層析法。色譜法最最早是由由俄國植植物學(xué)家家茨維特特（Tsswettt）在在19006年研研究用碳碳酸鈣分分離植物物色素時(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)的的，色譜譜法(CChroomattogrraphhy)因因之得名名。后來來在此基基礎(chǔ)上發(fā)發(fā)展出紙紙色譜法法、薄層層色譜法法、氣相相色譜法法、液相相色譜法法。液相色譜譜法開始始階段是是用大直直徑的玻玻璃管柱柱在室溫溫和常壓壓下用液液位差輸輸送流動動相，稱稱為經(jīng)典典液相色色譜法，此此方法柱柱效低、時(shí)間長長（常有有幾個小小時(shí)）。高效液液相色譜譜法(HHighh peerfoo

3、rmaancee LiiquiidChhrommatoograaphyy，HPPLC)是在經(jīng)經(jīng)典液相相色譜法法的基礎(chǔ)礎(chǔ)上，于于60年年代后期期引入了了氣相色色譜理論論而迅速速發(fā)展起起來的。它與經(jīng)經(jīng)典液相相色譜法法的區(qū)別別是填料料顆粒小小而均勻勻，小顆顆粒具有有高柱效效，但會會引起高高阻力，需需用高壓壓輸送流流動相，故故又稱高高壓液相相色譜法法(Hiigh Preessuure LiqquiddChrromaatoggrapphy，HHPLCC)。又又因分析析速度快快而稱為為高速液液相色譜譜法(HHighh Sppeedd LiiquiidChhrommatoograaphyy，HSSLP)。也

4、稱稱現(xiàn)代液液相色譜譜。二、HPPLC的的特點(diǎn)和和優(yōu)點(diǎn)HPLCC有以下下特點(diǎn)：高壓壓壓力可達(dá)達(dá)15003000Kgg/cmm2。色色譜柱每每米降壓壓為755 Kgg/cmm2以上上。高速流流速為00.110.0 mml/mmin。高效可可達(dá)50000塔塔板每米米。在一一根柱中中同時(shí)分分離成份份可達(dá)1100種種。高靈敏度度紫外外檢測器器靈敏度度可達(dá)00.011ng。同時(shí)消消耗樣品品少。HPLCC與經(jīng)典典液相色色譜相比比有以下下優(yōu)點(diǎn)：速度快通常分分析一個個樣品在在1530 minn，有些些樣品甚甚至在55 miin內(nèi)即即可完成成。分辨率高高可選選擇固定定相和流流動相以以達(dá)到最最佳分離離效果。靈敏度高

5、高紫外外檢測器器可達(dá)00.011ng，熒熒光和電電化學(xué)檢檢測器可可達(dá)0.1pgg。柱子可反反復(fù)使用用用一一根色譜譜柱可分分離不同同的化合合物。樣品量少少，容易易回收樣品經(jīng)經(jīng)過色譜譜柱后不不被破壞壞，可以以收集單單一組分分或做制制備。三、色譜譜法分類類按兩相的的物理狀狀態(tài)可分分為：氣氣相色譜譜法(GGC)和和液相色色譜法(LC)。氣相相色譜法法適用于于分離揮揮發(fā)性化化合物。GC根根據(jù)固定定相不同同又可分分為氣固固色譜法法(GSSC)和和氣液色色譜法(GLCC)，其其中以GGLC應(yīng)應(yīng)用最廣廣。液相相色譜法法適用于于分離低低揮發(fā)性性或非揮揮發(fā)性、熱穩(wěn)定定性差的的物質(zhì)。LC同同樣可分分為液固固色譜法法

6、(LSSC)和和液液色色譜法(LLCC)。此此外還有有超臨界界流體色色譜法(SFCC)，它它以超臨臨界流體體（界于于氣體和和液體之之間的一一種物相相）為流流動相（常常用COO2），因因其擴(kuò)散散系數(shù)大大，能很很快達(dá)到到平衡，故故分析時(shí)時(shí)間短，特特別適用用于手性性化合物物的拆分分。按原理分分為吸附附色譜法法(ACC)、分分配色譜譜法(DDC)、離子交交換色譜譜法(IIEC)、排阻阻色譜法法(ECC，又稱稱分子篩篩、凝膠膠過濾(GFCC)、凝凝膠滲透透色譜法法(GPPC）和和親和色色譜法。(此外還還有電泳泳。)按操作形形式可分分為紙色色譜法(PC)、薄層層色譜法法(TLLC)、柱色譜譜法。四、色譜譜

7、分離原原理高效液相相色譜法法按分離離機(jī)制的的不同分分為液固固吸附色色譜法、液液分分配色譜譜法（正正相與反反相）、離子交交換色譜譜法、離離子對色色譜法及及分子排排阻色譜譜法。1液固固色譜法法使用用固體吸吸附劑，被被分離組組分在色色譜柱上上分離原原理是根根據(jù)固定定相對組組分吸附附力大小小不同而而分離。分離過過程是一一個吸附附解吸吸附的平平衡過程程。常用用的吸附附劑為硅硅膠或氧氧化鋁，粒粒度510m。適適用于分分離分子子量2000110000的組分分，大多多數(shù)用于于非離子子型化合合物，離離子型化化合物易易產(chǎn)生拖拖尾。常常用于分分離同分分異構(gòu)體體。2液液液色譜法法使用用將特定定的液態(tài)態(tài)物質(zhì)涂涂于擔(dān)體體

8、表面，或或化學(xué)鍵鍵合于擔(dān)擔(dān)體表面面而形成成的固定定相，分分離原理理是根據(jù)據(jù)被分離離的組分分在流動動相和固固定相中中溶解度度不同而而分離。分離過過程是一一個分配配平衡過過程。涂布式固固定相應(yīng)應(yīng)具有良良好的惰惰性；流流動相必必須預(yù)先先用固定定相飽和和，以減減少固定定相從擔(dān)擔(dān)體表面面流失；溫度的的變化和和不同批批號流動動相的區(qū)區(qū)別常引引起柱子子的變化化；另外外在流動動相中存存在的固固定相也也使樣品品的分離離和收集集復(fù)雜化化。由于于涂布式式固定相相很難避避免固定定液流失失，現(xiàn)在在已很少少采用?，F(xiàn)在多多采用的的是化學(xué)學(xué)鍵合固固定相，如如C188、C88、氨基基柱、氰氰基柱和和苯基柱柱。液液色譜譜法按固固

9、定相和和流動相相的極性性不同可可分為正正相色譜譜法(NNPC)和反相相色譜法法(RPPC)。正相色譜譜法采采用極性性固定相相(如聚乙乙二醇、氨基與與腈基鍵鍵合相)；流動動相為相相對非極極性的疏疏水性溶溶劑(烷烴類類如正已已烷、環(huán)環(huán)已烷），常常加入乙乙醇、異異丙醇、四氫呋呋喃、三三氯甲烷烷等以調(diào)調(diào)節(jié)組分分的保留留時(shí)間。常用于于分離中中等極性性和極性性較強(qiáng)的的化合物物(如酚類類、胺類類、羰基基類及氨氨基酸類類等）。反相色譜譜法一一般用非非極性固固定相（如如C188、C88）；流流動相為為水或緩緩沖液，常常加入甲甲醇、乙乙腈、異異丙醇、丙酮、四氫呋呋喃等與與水互溶溶的有機(jī)機(jī)溶劑以以調(diào)節(jié)保保留時(shí)間間。

10、適用用于分離離非極性性和極性性較弱的的化合物物。RPPC在現(xiàn)現(xiàn)代液相相色譜中中應(yīng)用最最為廣泛泛，據(jù)統(tǒng)統(tǒng)計(jì)，它它占整個個HPLLC應(yīng)用用的800%左右右。隨著柱填填料的快快速發(fā)展展，反相相色譜法法的應(yīng)用用范圍逐逐漸擴(kuò)大大，現(xiàn)已已應(yīng)用于于某些無無機(jī)樣品品或易解解離樣品品的分析析。為控控制樣品品在分析析過程的的解離，常常用緩沖沖液控制制流動相相的pHH值。但但需要注注意的是是，C118和CC8使用用的pHH值通常常為2.577.5（228），太太高的ppH值會會使硅膠膠溶解，太太低的ppH值會會使鍵合合的烷基基脫落。有報(bào)告告新商品品柱可在在pH 1.55100范圍操操作。正相色譜譜法與反反相色譜譜法

11、比較較表正相色譜譜法反相相色譜法法固定相極極性高中中低流動相極極性低中中高組分洗脫脫次序極極性小先先洗出極極性大先先洗出從上表可可看出，當(dāng)當(dāng)極性為為中等時(shí)時(shí)正相色色譜法與與反相色色譜法沒沒有明顯顯的界線線（如氨氨基鍵合合固定相相）。3離子子交換色色譜法固定相相是離子子交換樹樹脂，常常用苯乙乙烯與二二乙烯交交聯(lián)形成成的聚合合物骨架架，在表表面未端端芳環(huán)上上接上羧羧基、磺磺酸基（稱稱陽離子子交換樹樹脂）或或季氨基基（陰離離子交換換樹脂）。被分離離組分在在色譜柱柱上分離離原理是是樹脂上上可電離離離子與與流動相相中具有有相同電電荷的離離子及被被測組分分的離子子進(jìn)行可可逆交換換，根據(jù)據(jù)各離子子與離子子交

12、換基基團(tuán)具有有不同的的電荷吸吸引力而而分離。緩沖液常常用作離離子交換換色譜的的流動相相。被分分離組分分在離子子交換柱柱中的保保留時(shí)間間除跟組組分離子子與樹脂脂上的離離子交換換基團(tuán)作作用強(qiáng)弱弱有關(guān)外外，它還還受流動動相的ppH值和和離子強(qiáng)強(qiáng)度影響響。pHH值可改改變化合合物的解解離程度度，進(jìn)而而影響其其與固定定相的作作用。流流動相的的鹽濃度度大，則則離子強(qiáng)強(qiáng)度高，不不利于樣樣品的解解離，導(dǎo)導(dǎo)致樣品品較快流流出。離子交換換色譜法法主要用用于分析析有機(jī)酸酸、氨基基酸、多多肽及核核酸。4離子子對色譜譜法又又稱偶離離子色譜譜法，是是液液色色譜法的的分支。它是根根據(jù)被測測組分離離子與離離子對試試劑離子子形

13、成中中性的離離子對化化合物后后，在非非極性固固定相中中溶解度度增大，從從而使其其分離效效果改善善。主要要用于分分析離子子強(qiáng)度大大的酸堿堿物質(zhì)。分析堿性性物質(zhì)常常用的離離子對試試劑為烷烷基磺酸酸鹽，如如戊烷磺磺酸鈉、辛烷磺磺酸鈉等等。另外外高氯酸酸、三氟氟乙酸也也可與多多種堿性性樣品形形成很強(qiáng)強(qiáng)的離子子對。分析酸性性物質(zhì)常常用四丁丁基季銨銨鹽，如如四丁基基溴化銨銨、四丁丁基銨磷磷酸鹽。離子對色色譜法常常用ODDS柱（即即C188），流流動相為為甲醇-水或乙乙腈-水水，水中中加入33100 mmmol/L的離離子對試試劑，在在一定的的pH值值范圍內(nèi)內(nèi)進(jìn)行分分離。被被測組分分保時(shí)間間與離子子對性質(zhì)質(zhì)

14、、濃度度、流動動相組成成及其ppH值、離子強(qiáng)強(qiáng)度有關(guān)關(guān)。5排阻阻色譜法法固定定相是有有一定孔孔徑的多多孔性填填料，流流動相是是可以溶溶解樣品品的溶劑劑。小分分子量的的化合物物可以進(jìn)進(jìn)入孔中中，滯留留時(shí)間長長；大分分子量的的化合物物不能進(jìn)進(jìn)入孔中中，直接接隨流動動相流出出。它利利用分子子篩對分分子量大大小不同同的各組組分排阻阻能力的的差異而而完成分分離。常常用于分分離高分分子化合合物，如如組織提提取物、多肽、蛋白質(zhì)質(zhì)、核酸酸等。被分離組組分在柱柱中的洗洗脫原理理II基基本概念念和理論論一、基本本概念和和術(shù)語1色譜譜圖和峰峰參數(shù)色譜圖(chrromaatoggramm)樣品流流經(jīng)色譜譜柱和檢檢測器

15、，所所得到的的信號-時(shí)間曲曲線，又又稱色譜譜流出曲曲線(eeluttionn prrofiile)?；€(bbasee liine)經(jīng)流流動相沖沖洗，柱柱與流動動相達(dá)到到平衡后后，檢測測器測出出一段時(shí)時(shí)間的流流出曲線線。一般般應(yīng)平行行于時(shí)間間軸。噪音(nnoisse)基線線信號的的波動。通常因因電源接接觸不良良或瞬時(shí)時(shí)過載、檢測器器不穩(wěn)定定、流動動相含有有氣泡或或色譜柱柱被污染染所致。漂移(ddrifft)基線線隨時(shí)間間的緩緩緩變化。主要由由于操作作條件如如電壓、溫度、流動相相及流量量的不穩(wěn)穩(wěn)定所引引起，柱柱內(nèi)的污污染物或或固定相相不斷被被洗脫下下來也會會產(chǎn)生漂漂移。色譜峰(peaak)組分分

16、流經(jīng)檢檢測器時(shí)時(shí)響應(yīng)的的連續(xù)信信號產(chǎn)生生的曲線線。流出出曲線上上的突起起部分。正常色色譜峰近近似于對對稱形正正態(tài)分布布曲線（高高斯Gaausss曲線）。不對稱稱色譜峰峰有兩種種：前延延峰(lleaddingg peeak)和拖尾尾峰(ttaillingg peeak)。前者者少見。拖尾因子子(taailiing facctorr，T)TT，用用以衡量量色譜峰峰的對稱稱性。也也稱為對對稱因子子(syymmeetryy faactoor)或或不對稱稱因子(asyymmeetryy faactoor)。中國國藥典規(guī)規(guī)定T應(yīng)應(yīng)為0.951.005。TT0.95為為前延峰峰，T1.005為拖拖尾峰。峰底

17、基基線上峰峰的起點(diǎn)點(diǎn)至終點(diǎn)點(diǎn)的距離離。峰高(ppeakk heeighht，hh)峰峰的最高高點(diǎn)至峰峰底的距距離。峰寬（ppeakk wiidthh，W)峰兩兩側(cè)拐點(diǎn)點(diǎn)處所作作兩條切切線與基基線的兩兩個交點(diǎn)點(diǎn)間的距距離。WW4半峰寬（peaak wwidtth aathaalf-heiightt，Whh/2)峰高高一半處處的峰寬寬。Whh/22.3355標(biāo)準(zhǔn)偏差差（staandaard devviattionn，)正態(tài)態(tài)分布曲曲線x1時(shí)時(shí)（拐點(diǎn)點(diǎn)）的峰峰寬之半半。正常常峰的拐拐點(diǎn)在峰峰高的00.6007倍處處。標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏差的的大小說說明組分分在流出出色譜柱柱過程中中的分散散程度。小，分分散程度度

18、小、極極點(diǎn)濃度度高、峰峰形瘦、柱效高高；反之之，大大，峰形形胖、柱柱效低。峰面積(peaak aareaa，A)峰與與峰底所所包圍的的面積。Ahh2.5077h1.0064 Wh/2h2定性性參數(shù)（保保留值）死時(shí)間(deaad ttimee，t00)不保留留組分的的保留時(shí)時(shí)間。即即流動相相（溶劑劑）通過過色譜柱柱的時(shí)間間。在反反相HPPLC中中可用苯苯磺酸鈉鈉來測定定死時(shí)間間。死體積(deaad vvoluume，VV0)由進(jìn)樣樣器進(jìn)樣樣口到檢檢測器流流動池未未被固定定相所占占據(jù)的空空間。它它包括44部分：進(jìn)樣器器至色譜譜柱管路路體積、柱內(nèi)固固定相顆顆粒間隙隙（被流流動相占占據(jù)，VVm）、柱出

19、口口管路體體積、檢檢測器流流動池體體積。其其中只有有Vm參參與色譜譜平衡過過程，其其它3部部分只起起峰擴(kuò)展展作用。為防止止峰擴(kuò)展展，這33部分體體積應(yīng)盡盡量減小小。V00Ft0（F為為流速）保留時(shí)間間(rettenttionn tiime，ttR)從進(jìn)樣樣開始到到某個組組分在柱柱后出現(xiàn)現(xiàn)濃度極極大值的的時(shí)間。保留體積積(rettenttionn voolumme，VVR)從進(jìn)樣樣開始到到某組分分在柱后后出現(xiàn)濃濃度極大大值時(shí)流流出溶劑劑的體積積。又稱稱洗脫體體積。VVRFFtRR調(diào)整保留留時(shí)間(adjjustted rettenttionn結(jié)構(gòu)tiime，ttR)扣除死死時(shí)間后后的保留留時(shí)間。也

20、稱折折合保留留時(shí)間(redduceed rreteentiionttimee)。在在實(shí)驗(yàn)條條件（溫溫度、固固定相等等）一定定時(shí)，ttR只決定定于組分分的性質(zhì)質(zhì)，因此此，tR（或ttR）可用用于定性性。tRtRt0調(diào)整保留留體積(adjjustted rettenttionnvollumee，VR)扣除死死體積后后的保留留體積。VRRVRV0或VRFtRR3柱效效參數(shù)理論塔板板數(shù)(theeoreeticcal plaatennumbber，NN)用于定定量表示示色譜柱柱的分離離效率（簡簡稱柱效效）。N取決于于固定相相的種類類、性質(zhì)質(zhì)（粒度度、粒徑徑分布等等）、填填充狀況況、柱長長、流動動相的種種

21、類和流流速及測測定柱效效所用物物質(zhì)的性性質(zhì)。如如果峰形形對稱并并符合正正態(tài)分布布，N可可近似表表示為：N()216()25.554()2N為常量量時(shí)，WW隨tRR成正比比例變化化。在一一張多組組分色譜譜圖上，如如果各組組分含量量相當(dāng)，則則后洗脫脫的峰比比前面的的峰要逐逐漸加寬寬，峰高高則逐漸漸降低。用半峰寬寬計(jì)算理理論塔數(shù)數(shù)比用峰峰寬計(jì)算算更為方方便和常常用，因因?yàn)榘敕宸鍖捀滓诇?zhǔn)確測測定，尤尤其是對對稍有拖拖尾的峰峰。N與柱長長成正比比，柱越越長，NN越大。用N表表示柱效效時(shí)應(yīng)注注明柱長長，如果果未注明明，則表表示柱長長為1米米時(shí)的理理論塔板板數(shù)。（一一般HPPLC柱柱的N在在10000以上

22、上。）若用調(diào)整整保留時(shí)時(shí)間(ttR)計(jì)算算理論塔塔板數(shù)，所所得值稱稱為有效效理論塔塔板數(shù)(N有效效或Nefff)。理論塔板板高度(theeoreeticcal plaatehheigght，HH)每單位位柱長的的方差。H。實(shí)際應(yīng)應(yīng)用時(shí)往往往用柱柱長L和和理論塔塔板數(shù)計(jì)計(jì)算：HH，HH有效。4相平平衡參數(shù)數(shù)分配系數(shù)數(shù)(disstriibuttionncoeeffiicieent，KK)在一定定溫度下下，化合合物在兩兩相間達(dá)達(dá)到分配配平衡時(shí)時(shí)，在固固定相與與流動相相中的濃濃度之比比。K。分配系數(shù)數(shù)與組分分、流動動相和固固定相的的熱力學(xué)學(xué)性質(zhì)有有關(guān)，也也與溫度度、壓力力有關(guān)。在不同同的色譜譜分離機(jī)機(jī)

23、制中，KK有不同同的概念念：吸附附色譜法法為吸附附系數(shù)，離離子交換換色譜法法為選擇擇性系數(shù)數(shù)(或稱交交換系數(shù)數(shù))，凝膠膠色譜法法為滲透透參數(shù)。但一般般情況可可用分配配系數(shù)來來表示。在條件(流動相相、固定定相、溫溫度和壓壓力等)一定，樣樣品濃度度很低時(shí)時(shí)(Cs、Cm很很小)時(shí)，KK只取決決于組分分的性質(zhì)質(zhì)，而與與濃度無無關(guān)。這這只是理理想狀態(tài)態(tài)下的色色譜條件件，在這這種條件件下，得得到的色色譜峰為為正常峰峰；在許許多情況況下，隨隨著濃度度的增大大，K減減小，這這時(shí)色譜譜峰為拖拖尾峰；而有時(shí)時(shí)隨著溶溶質(zhì)濃度度增大，KK也增大大，這時(shí)時(shí)色譜峰峰為前延延峰。因因此，只只有盡可可能減少少進(jìn)樣量量，使組組

24、分在柱柱內(nèi)濃度度降低，KK恒定時(shí)時(shí)，才能能獲得正正常峰。在同一色色譜條件件下，樣樣品中KK值大的的組分在在固定相相中滯留留時(shí)間長長，后流流出色譜譜柱；KK值小的的組分則則滯留時(shí)時(shí)間短，先先流出色色譜柱?；旌衔镂镏懈鹘M組分的分分配系數(shù)數(shù)相差越越大，越越容易分分離，因因此混合合物中各各組分的的分配系系數(shù)不同同是色譜譜分離的的前提。在HPLLC中，固固定相確確定后，KK主要受受流動相相的性質(zhì)質(zhì)影響。實(shí)踐中中主要靠靠調(diào)整流流動相的的組成配配比及ppH值，以以獲得組組分間的的分配系系數(shù)差異異及適宜宜的保留留時(shí)間，達(dá)達(dá)到分離離的目的的。容量因子子(cappaciity facctorr，k)化化合物在在兩

25、相間間達(dá)到分分配平衡衡時(shí)，在在固定相相與流動動相中的的量之比比。k。因此此容量因因子也稱稱質(zhì)量分分配系數(shù)數(shù)。分配系數(shù)數(shù)、容量量因子與與保留時(shí)時(shí)間之間間有如下下關(guān)系：kK，tRk t0。上式式說明容容量因子子的物理理意義：表示一一個組分分在固定定相中停停留的時(shí)時(shí)間（ttR）是不不保留組組分保留留時(shí)間（tt0）的幾幾倍。kk0時(shí)時(shí)，化合合物全部部存在于于流動相相中，在在固定相相中不保保留，ttR0；k越大大，說明明固定相相對此組組分的容容量越大大，出柱柱慢，保保留時(shí)間間越長。容量因子子與分配配系數(shù)的的不同點(diǎn)點(diǎn)是：KK取決于于組分、流動相相、固定定相的性性質(zhì)及溫溫度，而而與體積積Vs、Vm無無關(guān)；k

26、k除了與與性質(zhì)及及溫度有有關(guān)外，還還與Vss、Vmm有關(guān)。由于ttR、t0較Vss、Vmm易于測測定，所所以容量量因子比比分配系系數(shù)應(yīng)用用更廣泛泛。選擇性因因子(sellecttiviity facctorr，)相相鄰兩組組分的分分配系數(shù)數(shù)或容量量因子之之比。（設(shè)設(shè)k2k1）。因ktRR/t0，則，所所以又又稱為相相對保留留時(shí)間（美美國藥典典）。要使兩組組分得到到分離，必必須使1。與化化合物在在固定相相和流動動相中的的分配性性質(zhì)、柱柱溫有關(guān)關(guān)，與柱柱尺寸、流速、填充情情況無關(guān)關(guān)。從本本質(zhì)上來來說，的大小小表示兩兩組分在在兩相間間的平衡衡分配熱熱力學(xué)性性質(zhì)的差差異，即即分子間間相互作作用力的的差

27、異。5分離離參數(shù)分離度(ressoluutioon，RR)相鄰兩兩峰的保保留時(shí)間間之差與與平均峰峰寬的比比值。也也叫分辨辨率，表表示相鄰鄰兩峰的的分離程程度。RR。當(dāng)當(dāng)W1W2時(shí)時(shí)，R。當(dāng)RR1時(shí)時(shí)，稱為為4分分離，兩兩峰基本本分離，裸裸露峰面面積為995.44%，內(nèi)內(nèi)側(cè)峰基基重疊約約2%。R11.5時(shí)時(shí)，稱為為6分分離，裸裸露峰面面積為999.77%。RR1.5稱為為完全分分離。中國藥藥典規(guī)規(guī)定R應(yīng)應(yīng)大于11.5?；痉蛛x離方程分離離度與三三個色譜譜基本參參數(shù)有如如下關(guān)系系:R其中稱為為柱效項(xiàng)項(xiàng)，為柱柱選擇性性項(xiàng)，為為柱容量量項(xiàng)。柱柱效項(xiàng)與與色譜過過程動力力學(xué)特性性有關(guān)，后后兩項(xiàng)與與色譜過過

28、程熱力力學(xué)因素素有關(guān)。從基本分分離方程程可看出出，提高高分離度度有三種種途徑：增加加塔板數(shù)數(shù)。方法法之一是是增加柱柱長，但但這樣會會延長保保留時(shí)間間、增加加柱壓。更好的的方法是是降低塔塔板高度度，提高高柱效。增加加選擇性性。當(dāng)1時(shí)時(shí)，R0，無無論柱效效有多高高，組分分也不可可能分離離。一般般可以采采取以下下措施來來改變選選擇性：a. 改變流流動相的的組成及及pH值值；b. 改變變柱溫；c. 改變固固定相。改變變?nèi)萘恳蛞蜃?。這這常常是是提高分分離度的的最容易易方法，可可以通過過調(diào)節(jié)流流動相的的組成來來實(shí)現(xiàn)。k2趨趨于0時(shí)時(shí)，R也也趨于00；k22增大，RR也增大大。但kk2不能能太大，否否則不但

29、但分離時(shí)時(shí)間延長長，而且且峰形變變寬，會會影響分分離度和和檢測靈靈敏度。一般kk2在11100范圍內(nèi)內(nèi)，最好好為25，窄窄徑柱可可更小些些。二、塔板板理論1塔板板理論的的基本假假設(shè)塔板理論論是Maartiin和SSyngger首首先提出出的色譜譜熱力學(xué)學(xué)平衡理理論。它它把色譜譜柱看作作分餾塔塔，把組組分在色色譜柱內(nèi)內(nèi)的分離離過程看看成在分分餾塔中中的分餾餾過程，即即組分在在塔板間間隔內(nèi)的的分配平平衡過程程。塔板板理論的的基本假假設(shè)為：1） 色色譜柱內(nèi)內(nèi)存在許許多塔板板，組分分在塔板板間隔（即即塔板高高度）內(nèi)內(nèi)完全服服從分配配定律，并并很快達(dá)達(dá)到分配配平衡。2） 樣樣品加在在第0號號塔板上上，樣

30、品品沿色譜譜柱軸方方向的擴(kuò)擴(kuò)散可以以忽略。3） 流流動相在在色譜柱柱內(nèi)間歇歇式流動動，每次次進(jìn)入一一個塔板板體積。4） 在在所有塔塔板上分分配系數(shù)數(shù)相等，與與組分的的量無關(guān)關(guān)。雖然以上上假設(shè)與與實(shí)際色色譜過程程不符，如如色譜過過程是一一個動態(tài)態(tài)過程，很很難達(dá)到到分配平平衡；組組分沿色色譜柱軸軸方向的的擴(kuò)散是是不可避避免的。但是塔塔板理論論導(dǎo)出了了色譜流流出曲線線方程，成成功地解解釋了流流出曲線線的形狀狀、濃度度極大點(diǎn)點(diǎn)的位置置，能夠夠評價(jià)色色譜柱柱柱效。2色譜譜流出曲曲線方程程及定量量參數(shù)（峰峰高h(yuǎn)和和峰面積積A）根據(jù)塔板板理論，流流出曲線線可用下下述正態(tài)態(tài)分布方方程來描描述：CCe或或Cee

31、由色譜流流出曲線線方程可可知：當(dāng)當(dāng)tttR時(shí)，濃濃度C有有極大值值，Cmmax。Cmmax就就是色譜譜峰的峰峰高。因因此上式式說明：當(dāng)實(shí)實(shí)驗(yàn)條件件一定時(shí)時(shí)（即一定），峰峰高h(yuǎn)與與組分的的量C00（進(jìn)樣樣量）成成正比，所所以正常常峰的峰峰高可用用于定量量分析。當(dāng)進(jìn)進(jìn)樣量一一定時(shí)，越小（柱柱效越高高），峰峰高越高高，因此此提高柱柱效能提提高HPPLC分分析的靈靈敏度。由流出曲曲線方程程對V(0)求積積分，即即得出色色譜峰面面積ACmaaxCC0。可見見A相當(dāng)當(dāng)于組分分進(jìn)樣量量C0，因此此是常用用的定量量參數(shù)。把Cmmaxh和WWh/222.3555代入入上式，即即得A1.0064Wh/2hh，此為

32、為正常峰峰的峰面面積計(jì)算算公式。三、速率率理論（又又稱隨機(jī)機(jī)模型理理論）1液相相色譜速速率方程程19566年荷蘭蘭學(xué)者VVan Deeemteer等人人吸收了了塔板理理論的概概念，并并把影響響塔板高高度的動動力學(xué)因因素結(jié)合合起來，提提出了色色譜過程程的動力力學(xué)理論論速速率理論論。它把把色譜過過程看作作一個動動態(tài)非平平衡過程程，研究究過程中中的動力力學(xué)因素素對峰展展寬（即即柱效）的的影響。后來Giiddiingss和Snnydeer等人人在Vaan DDeemmterr方程（HHAB/uuCuu，后稱稱氣相色色譜速率率方程）的的基礎(chǔ)上上，根據(jù)據(jù)液體與與氣體的的性質(zhì)差差異，提提出了液液相色譜譜速率

33、方方程（即即Gidddinngs方方程）：H22dppsuup5(2psup55(2ppssupp5(22f2影響響柱效的的因素1）渦流流擴(kuò)散（eeddyy diiffuusioon）。由于色色譜柱內(nèi)內(nèi)填充劑劑的幾何何結(jié)構(gòu)不不同，分分子在色色譜柱中中的流速速不同而而引起的的峰展寬寬。渦流流擴(kuò)散項(xiàng)項(xiàng)A22dpp，dpp為填料料直徑，為填充充不規(guī)則則因子，填填充越不不均勻越大。HPLLC常用用填料粒粒度一般般為310m，最最好35mm，粒度度分布RRSD5%。但粒度度太小難難于填充充均勻（大），且且會使柱柱壓過高高。大而而均勻（球球形或近近球形）的的顆粒容容易填充充規(guī)則均均勻，越小?？偟恼f說來，應(yīng)

34、應(yīng)采用細(xì)細(xì)而均勻勻的載體體，這樣樣有助于于提高柱柱效。毛毛細(xì)管無無填料，AA0。2）分子子擴(kuò)散（mmoleecullar difffussionn）。又又稱縱向向擴(kuò)散。由于進(jìn)進(jìn)樣后溶溶質(zhì)分子子在柱內(nèi)內(nèi)存在濃濃度梯度度，導(dǎo)致致軸向擴(kuò)擴(kuò)散而引引起的峰峰展寬。分子擴(kuò)擴(kuò)散項(xiàng)BB/u2DDm/uu。u為為流動相相線速度度，分子子在柱內(nèi)內(nèi)的滯留留時(shí)間越越長（uu?。拐箤捲絿?yán)嚴(yán)重。在在低流速速時(shí)，它它對峰形形的影響響較大。Dm為為分子在在流動相相中的擴(kuò)擴(kuò)散系數(shù)數(shù)，由于于液相的的Dm很很小，通通常僅為為氣相的的10-4110-55，因此此在HPPLC中中，只要要流速不不太低的的話，這這一項(xiàng)可可以忽略略不計(jì)

35、。是考考慮到填填料的存存在使溶溶質(zhì)分子子不能自自由地軸軸向擴(kuò)散散，而引引入的柱柱參數(shù)，用用以對Dmm進(jìn)行校校正。一般在在0.660.7左右右，毛細(xì)細(xì)管柱的的11。3）傳質(zhì)質(zhì)阻抗（mmasss trranssferrressisttancce）。由于溶溶質(zhì)分子子在流動動相、靜靜態(tài)流動動相和固固定相中中的傳質(zhì)質(zhì)過程而而導(dǎo)致的的峰展寬寬。溶質(zhì)質(zhì)分子在在流動相相和固定定相中的的擴(kuò)散、分配、轉(zhuǎn)移的的過程并并不是瞬瞬間達(dá)到到平衡，實(shí)實(shí)際傳質(zhì)質(zhì)速度是是有限的的，這一一時(shí)間上上的滯后后使色譜譜柱總是是在非平平衡狀態(tài)態(tài)下工作作，從而而產(chǎn)生峰峰展寬。液相色色譜的傳傳質(zhì)阻抗抗項(xiàng)Cuu又分為為三項(xiàng)。流動相相傳質(zhì)阻阻抗

36、HmmCmmd2ppu/DDm，CCm為常常數(shù)。這這是由于于在一個個流路中中流路中中心和邊邊緣的流流速不等等所致?？拷钐畛漕w粒粒的流動動相流速速較慢，而而中心較較快，處處于中心心的分子子還未來來得及與與固定相相達(dá)到分分配平衡衡就隨流流動相前前移，因因而產(chǎn)生生峰展寬寬。靜態(tài)流流動相傳傳質(zhì)阻抗抗HsmmCssmd22pu/Dm，CCsm為為常數(shù)。這是由由于溶質(zhì)質(zhì)分子進(jìn)進(jìn)入處于于固定相相孔穴內(nèi)內(nèi)的靜止止流動相相中，晚晚回到流流路中而而引起峰峰展寬。Hsmm對峰展展寬的影影響在整整個傳質(zhì)質(zhì)過程中中起著主主要作用用。固定定相的顆顆粒越小小，微孔孔孔徑越越大，傳傳質(zhì)阻力力就越小小，傳質(zhì)質(zhì)速率越越高。所所

37、以改進(jìn)進(jìn)固定相相結(jié)構(gòu)，減減小靜態(tài)態(tài)流動相相傳質(zhì)阻阻力，是是提高液液相色譜譜柱效的的關(guān)鍵。Hm和HHsm都都與固定定相的粒粒徑平方方d2pp 成正正比，與與擴(kuò)散系系數(shù)Dmm成反比比。因此此應(yīng)采用用低粒度度固定相相和低粘粘度流動動相。高高柱溫可可以增大大Dm，但但用有機(jī)機(jī)溶劑作作流動相相時(shí)，易易產(chǎn)生氣氣泡，因因此一般般采用室室溫。固定相相傳質(zhì)阻阻抗HssCssd2ffu/DDs（液液液分配配色譜），CCs為常常數(shù)，ddf為固固定液的的液膜厚厚度，DDs為分分子在固固定液中中的擴(kuò)散散系數(shù)。在分配配色譜中中Hs與與df的的平方成成正比，在在吸附色色譜中HHs與吸吸附和解解吸速度度成反比比。因此此只有在

38、在厚涂層層固定液液、深孔孔離子交交換樹脂脂或解吸吸速度慢慢的吸附附色譜中中，Hss才有明明顯影響響。采用用單分子子層的化化學(xué)鍵合合固定相相時(shí)Hss可以忽忽略。從速率方方程式可可以看出出，要獲獲得高效效能的色色譜分析析，一般般可采用用以下措措施：進(jìn)樣時(shí)時(shí)間要短短。填填料粒度度要小。改善善傳質(zhì)過過程。過過高的吸吸附作用用力可導(dǎo)導(dǎo)致嚴(yán)重重的峰展展寬和拖拖尾，甚甚至不可可逆吸附附。適適當(dāng)?shù)牧髁魉?。以以H對uu作圖，則則有一最最佳線速速度uoopt，在在此線速速度時(shí)，HH最小。一般在在液相色色譜中，uuoptt很小（大大約0.030.11mm/s），在在這樣的的線速度度下分析析樣品需需要很長長時(shí)間，一一

39、般來說說都選在在1mmm/s的的條件下下操作。較小小的檢測測器死體體積。3柱外外效應(yīng)速率理論論研究的的是柱內(nèi)內(nèi)峰展寬寬因素，實(shí)實(shí)際在柱柱外還存存在引起起峰展寬寬的因素素，即柱柱外效應(yīng)應(yīng)（色譜譜峰在柱柱外死空空間里的的擴(kuò)展效效應(yīng)）。色譜峰峰展寬的的總方差差等于各各方差之之和，即即：22柱內(nèi)內(nèi)22柱外2其其它柱外外效應(yīng)主主要由低低劣的進(jìn)進(jìn)樣技術(shù)術(shù)、從進(jìn)進(jìn)樣點(diǎn)到到檢測池池之間除除柱子本本身以外外的所有有死體積積所引起起。為了了減少柱柱外效應(yīng)應(yīng)，首先先應(yīng)盡可可能減少少柱外死死體積，如如使用“零零死體積積接頭”連連接各部部件，管管道對接接宜呈流流線形，檢檢測器的的內(nèi)腔體體積應(yīng)盡盡可能小小。研究究表明柱柱

40、外死體體積之和和應(yīng)VVR/。其次，希希望將樣樣品直接接進(jìn)在柱柱頭的中中心部位位，但是是由于進(jìn)進(jìn)樣閥與與柱間有有接頭，柱柱外效應(yīng)應(yīng)總是存存在的。此外，要要求進(jìn)樣樣體積VR/2。柱外效應(yīng)應(yīng)的直觀觀標(biāo)志是是容量因因子k小小的組分分（如kk2）峰峰形拖尾尾和峰寬寬增加得得更為明明顯；kk大的組組分影響響不顯著著。由于于HPLLC的特特殊條件件，當(dāng)柱柱子本身身效率越越高（NN越大），柱柱尺寸越越小時(shí)，柱柱外效應(yīng)應(yīng)越顯得得突出。而在經(jīng)經(jīng)典LCC中則影影響相對對較小。IIIHPLLC系統(tǒng)統(tǒng)HPLCC系統(tǒng)一一般由輸輸液泵、進(jìn)樣器器、色譜譜柱、檢檢測器、數(shù)據(jù)記記錄及處處理裝置置等組成成。其中中輸液泵泵、色譜譜柱

41、、檢檢測器是是關(guān)鍵部部件。有有的儀器器還有梯梯度洗脫脫裝置、在線脫脫氣機(jī)、自動進(jìn)進(jìn)樣器、預(yù)柱或或保護(hù)柱柱、柱溫溫控制器器等，現(xiàn)現(xiàn)代HPPLC儀儀還有微微機(jī)控制制系統(tǒng)，進(jìn)進(jìn)行自動動化儀器器控制和和數(shù)據(jù)處處理。制制備型HHPLCC儀還備備有自動動餾分收收集裝置置。最早的液液相色譜譜儀由粗粗糙的高高壓泵、低效的的柱、固固定波長長的檢測測器、繪繪圖儀，繪繪出的峰峰是通過過手工測測量計(jì)算算峰面積積。后來來的高壓壓泵精度度很高并并可編程程進(jìn)行梯梯度洗脫脫，柱填填料從單單一品種種發(fā)展至至幾百種種類型，檢檢測器從從單波長長至可變變波長檢檢測器、可得三三維色譜譜圖的二二極管陣陣列檢測測器、可可確證物物質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)的

42、質(zhì)譜譜檢測器器。數(shù)據(jù)據(jù)處理不不再用繪繪圖儀，逐逐漸取而而代之的的是最簡簡單的積積分儀、計(jì)算機(jī)機(jī)、工作作站及網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)處理理系統(tǒng)。目前常見見的HPPLC儀儀生產(chǎn)廠廠家國外外有Waaterrs公司司、Aggileent公公司（原原HP公公司）、島津公公司等，國國內(nèi)有大大連依利利特公司司、上海海分析儀儀器廠、北京分分析儀器器廠等。一、輸液液泵1泵的的構(gòu)造和和性能輸液泵是是HPLLC系統(tǒng)統(tǒng)中最重重要的部部件之一一。泵的的性能好好壞直接接影響到到整個系系統(tǒng)的質(zhì)質(zhì)量和分分析結(jié)果果的可靠靠性。輸輸液泵應(yīng)應(yīng)具備如如下性能能：流流量穩(wěn)定定，其RRSD應(yīng)應(yīng)0.5%，這這對定性性定量的的準(zhǔn)確性性至關(guān)重重要；流量范范圍寬

43、，分分析型應(yīng)應(yīng)在0.1110 mml/mmin范范圍內(nèi)連連續(xù)可調(diào)調(diào)，制備備型應(yīng)能能達(dá)到1100 ml/minn；輸輸出壓力力高，一一般應(yīng)能能達(dá)到11503000kg/cm22；液液缸容積積??；密封性性能好，耐耐腐蝕。泵的種類類很多，按按輸液性性質(zhì)可分分為恒壓壓泵和恒恒流泵。恒流泵泵按結(jié)構(gòu)構(gòu)又可分分為螺旋旋注射泵泵、柱塞塞往復(fù)泵泵和隔膜膜往復(fù)泵泵。恒壓壓泵受柱柱阻影響響，流量量不穩(wěn)定定；螺旋旋泵缸體體太大，這這兩種泵泵已被淘淘汰。目目前應(yīng)用用最多的的是柱塞塞往復(fù)泵泵。柱塞往復(fù)復(fù)泵的液液缸容積積小，可可至0.1mll，因此此易于清清洗和更更換流動動相，特特別適合合于再循循環(huán)和梯梯度洗脫脫；改變變電

44、機(jī)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速能方方便地調(diào)調(diào)節(jié)流量量，流量量不受柱柱阻影響響；泵壓壓可達(dá)4400kg/ccm2。其主要要缺點(diǎn)是是輸出的的脈沖性性較大，現(xiàn)現(xiàn)多采用用雙泵系系統(tǒng)來克克服。雙雙泵按連連接方式式可分為為并聯(lián)式式和串聯(lián)聯(lián)式，一一般說來來并聯(lián)泵泵的流量量重現(xiàn)性性較好（RRSD為為0.11%左右右，串聯(lián)聯(lián)泵為00.20.33%），但但出故障障的機(jī)會會較多（因因多一單單向閥），價(jià)價(jià)格也較較貴。各品牌輸輸液泵的的基本參參數(shù)：項(xiàng)目Wateers 5155型HP 111000型LC-110ATTvp型型Elitte PP2000 III型檢定要求求流速范圍圍0.00011100.00011100.000199.99990

45、.0114.99調(diào)節(jié)精度度0.00010.00010.00010.011流量精密密度RSD00.1%0.155%（0.33%）0.3%0.5%1.5%流量準(zhǔn)確確度2.00%5.00%2.00%最高壓力力40000 Pssi40 MMPa39.22MPaa40.00MPaa密封圈壽壽命流動相的的脈沖2泵的的使用和和維護(hù)注注意事項(xiàng)項(xiàng)為了延長長泵的使使用壽命命和維持持其輸液液的穩(wěn)定定性，必必須按照照下列注注意事項(xiàng)項(xiàng)進(jìn)行操操作：防止任任何固體體微粒進(jìn)進(jìn)入泵體體，因?yàn)闉閴m?；蚧蚱渌稳魏坞s質(zhì)質(zhì)微粒都都會磨損損柱塞、密封環(huán)環(huán)、缸體體和單向向閥，因因此應(yīng)預(yù)預(yù)先除去去流動相相中的任任何固體體微粒。流動相相最好

46、在在玻璃容容器內(nèi)蒸蒸餾，而而常用的的方法是是濾過，可可采用MMilllipoore濾濾膜（00.2&miccro;m或00.455&miicroo;m）等等濾器。泵的入入口都應(yīng)應(yīng)連接砂砂濾棒（或或片）。輸液泵泵的濾器器應(yīng)經(jīng)常常清洗或或更換。流動相相不應(yīng)含含有任何何腐蝕性性物質(zhì)，含含有緩沖沖液的流流動相不不應(yīng)保留留在泵內(nèi)內(nèi)，尤其其是在停停泵過夜夜或更長長時(shí)間的的情況下下。如果果將含緩緩沖液的的流動相相留在泵泵內(nèi)，由由于蒸發(fā)發(fā)或泄漏漏，甚至至只是由由于溶液液的靜置置，就可可能析出出鹽的微微細(xì)晶體體，這些些晶體將將和上述述固體微微粒一樣樣損壞密密封環(huán)和和柱塞等等。因此此，必須須泵入純純水將泵泵充分清

47、清洗后，再再換成適適合于色色譜柱保保存和有有利于泵泵維護(hù)的的溶劑（對對于反相相鍵合硅硅膠固定定相，可可以是甲甲醇或甲甲醇-水水）。泵工作作時(shí)要留留心防止止溶劑瓶瓶內(nèi)的流流動相被被用完，否否則空泵泵運(yùn)轉(zhuǎn)也也會磨損損柱塞、缸體或或密封環(huán)環(huán)，最終終產(chǎn)生漏漏液。輸液泵泵的工作作壓力決決不要超超過規(guī)定定的最高高壓力，否否則會使使高壓密密封環(huán)變變形，產(chǎn)產(chǎn)生漏液液。流動相相應(yīng)該先先脫氣，以以免在泵泵內(nèi)產(chǎn)生生氣泡，影影響流量量的穩(wěn)定定性，如如果有大大量氣泡泡，泵就就無法正正常工作作。如果輸液液泵產(chǎn)生生故障，須須查明原原因，采采取相應(yīng)應(yīng)措施排排除故障障：沒有流流動相流流出，又又無壓力力指示。原因可可能是泵泵內(nèi)有

48、大大量氣體體，這時(shí)時(shí)可打開開泄壓閥閥，使泵泵在較大大流量（如如5mll/miin）下下運(yùn)轉(zhuǎn)，將將氣泡排排盡，也也可用一一個500ml針針筒在泵泵出口處處幫助抽抽出氣體體。另一一個可能能原因是是密封環(huán)環(huán)磨損，需需更換。壓力和和流量不不穩(wěn)。原原因可能能是氣泡泡，需要要排除；或者是是單向閥閥內(nèi)有異異物，可可卸下單單向閥，浸浸入丙酮酮內(nèi)超聲聲清洗。有時(shí)可可能是砂砂濾棒內(nèi)內(nèi)有氣泡泡，或被被鹽的微微細(xì)晶粒?；蜃躺奈⑸锊糠址侄氯?，這這時(shí)，可可卸下砂砂濾棒浸浸入流動動相內(nèi)超超聲除氣氣泡，或或?qū)⑸盀V濾棒浸入入稀酸（如如4mool/LL硝酸）內(nèi)內(nèi)迅速除除去微生生物，或或?qū)Ⅺ}溶溶解，再再立即清清洗。壓力過過

49、高的原原因是管管路被堵堵塞，需需要清除除和清洗洗。壓力力降低的的原因則則可能是是管路有有泄漏。檢查堵堵塞或泄泄漏時(shí)應(yīng)應(yīng)逐段進(jìn)進(jìn)行。3梯度度洗脫HPLCC有等強(qiáng)強(qiáng)度(iisoccrattic)和梯度度(grradiientt)洗脫脫兩種方方式。等等度洗脫脫是在同同一分析析周期內(nèi)內(nèi)流動相相組成保保持恒定定，適合合于組分分?jǐn)?shù)目較較少，性性質(zhì)差別別不大的的樣品。梯度洗洗脫是在在一個分分析周期期內(nèi)程序序控制流流動相的的組成，如如溶劑的的極性、離子強(qiáng)強(qiáng)度和ppH值等等，用于于分析組組分?jǐn)?shù)目目多、性性質(zhì)差異異較大的的復(fù)雜樣樣品。采采用梯度度洗脫可可以縮短短分析時(shí)時(shí)間，提提高分離離度，改改善峰形形，提高高檢測

50、靈靈敏度，但但是常常常引起基基線漂移移和降低低重現(xiàn)性性。梯度洗脫脫有兩種種實(shí)現(xiàn)方方式：低低壓梯度度（外梯梯度）和和高壓梯梯度（內(nèi)內(nèi)梯度）。兩種溶劑劑組成的的梯度洗洗脫可按按任意程程度混合合，即有有多種洗洗脫曲線線：線性性梯度、凹形梯梯度、凸凸形梯度度和階梯梯形梯度度。線性性梯度最最常用，尤尤其適合合于在反反相柱上上進(jìn)行梯梯度洗脫脫。在進(jìn)行梯梯度洗脫脫時(shí)，由由于多種種溶劑混混合，而而且組成成不斷變變化，因因此帶來來一些特特殊問題題，必須須充分重重視：要注意意溶劑的的互溶性性，不相相混溶的的溶劑不不能用作作梯度洗洗脫的流流動相。有些溶溶劑在一一定比例例內(nèi)混溶溶，超出出范圍后后就不互互溶，使使用時(shí)更

51、更要引起起注意。當(dāng)有機(jī)機(jī)溶劑和和緩沖液液混合時(shí)時(shí)，還可可能析出出鹽的晶晶體，尤尤其使用用磷酸鹽鹽時(shí)需特特別小心心。梯度洗洗脫所用用的溶劑劑純度要要求更高高，以保保證良好好的重現(xiàn)現(xiàn)性。進(jìn)進(jìn)行樣品品分析前前必須進(jìn)進(jìn)行空白白梯度洗洗脫，以以辨認(rèn)溶溶劑雜質(zhì)質(zhì)峰，因因?yàn)槿跞苋軇┲械牡碾s質(zhì)富富集在色色譜柱頭頭后會被被強(qiáng)溶劑劑洗脫下下來。用用于梯度度洗脫的的溶劑需需徹底脫脫氣，以以防止混混合時(shí)產(chǎn)產(chǎn)生氣泡泡。混合溶溶劑的粘粘度常隨隨組成而而變化，因因而在梯梯度洗脫脫時(shí)常出出現(xiàn)壓力力的變化化。例如如甲醇和和水粘度度都較小小，當(dāng)二二者以相相近比例例混合時(shí)時(shí)粘度增增大很多多，此時(shí)時(shí)的柱壓壓大約是是甲醇或或水為流流動

52、相時(shí)時(shí)的兩倍倍。因此此要注意意防止梯梯度洗脫脫過程中中壓力超超過輸液液泵或色色譜柱能能承受的的最大壓壓力。每次梯梯度洗脫脫之后必必須對色色譜柱進(jìn)進(jìn)行再生生處理，使使其恢復(fù)復(fù)到初始始狀態(tài)。需讓110330倍柱柱容積的的初始流流動相流流經(jīng)色譜譜柱，使使固定相相與初始始流動相相達(dá)到完完全平衡衡。二、進(jìn)樣樣器早期使用用隔膜和和停流進(jìn)進(jìn)樣器，裝裝在色譜譜柱入口口處?，F(xiàn)現(xiàn)在大都都使用六六通進(jìn)樣樣閥或自自動進(jìn)樣樣器。進(jìn)進(jìn)樣裝置置要求：密封性性好，死死體積小小，重復(fù)復(fù)性好，保保證中心心進(jìn)樣，進(jìn)進(jìn)樣時(shí)對對色譜系系統(tǒng)的壓壓力、流流量影響響小。HHPLCC進(jìn)樣方方式可分分為：隔隔膜進(jìn)樣樣、停流流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣樣、自動

53、動進(jìn)樣。1隔膜膜進(jìn)樣。用微量量注射器器將樣品品注入專專門設(shè)計(jì)計(jì)的與色色譜柱相相連的進(jìn)進(jìn)樣頭內(nèi)內(nèi)，可把把樣品直直接送到到柱頭填填充床的的中心，死死體積幾幾乎等于于零，可可以獲得得最佳的的柱效，且且價(jià)格便便宜，操操作方便便。但不不能在高高壓下使使用（如如10MMPa以以上）；此外隔隔膜容易易吸附樣樣品產(chǎn)生生記憶效效應(yīng)，使使進(jìn)樣重重復(fù)性只只能達(dá)到到122%；加加之能耐耐各種溶溶劑的橡橡皮不易易找到，常常規(guī)分析析使用受受到限制制。2停流流進(jìn)樣。可避免免在高壓壓下進(jìn)樣樣。但在在HPLLC中由由于隔膜膜的污染染，停泵泵或重新新啟動時(shí)時(shí)往往會會出現(xiàn)“鬼鬼峰”；另一缺缺點(diǎn)是保保留時(shí)間間不準(zhǔn)。在以峰峰的始末末信

54、號控控制餾分分收集的的制備色色譜中，效效果較好好。3閥進(jìn)進(jìn)樣。一一般HPPLC分分析常用用六通進(jìn)進(jìn)樣閥（以以美國RRheoodynne公司司的77725和和77225i型型最常見見），其其關(guān)鍵部部件由圓圓形密封封墊（轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子）和和固定底底座（定定子）組組成。由由于閥接接頭和連連接管死死體積的的存在，柱柱效率低低于隔膜膜進(jìn)樣（約約下降55100%左右右），但但耐高壓壓（355400MPaa），進(jìn)進(jìn)樣量準(zhǔn)準(zhǔn)確，重重復(fù)性好好（0.5%），操操作方便便。六通閥的的進(jìn)樣方方式有部部分裝液液法和完完全裝液液法兩種種。用用部分裝裝液法進(jìn)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)進(jìn)樣量應(yīng)應(yīng)不大于于定量環(huán)環(huán)體積的的50%（最多多75），并并要求

55、每每次進(jìn)樣樣體積準(zhǔn)準(zhǔn)確、相相同。此此法進(jìn)樣樣的準(zhǔn)確確度和重重復(fù)性決決定于注注射器取取樣的熟熟練程度度，而且且易產(chǎn)生生由進(jìn)樣樣引起的的峰展寬寬。用用完全裝裝液法進(jìn)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)進(jìn)樣量應(yīng)應(yīng)不小于于定量環(huán)環(huán)體積的的5110倍（最最少3倍倍），這這樣才能能完全置置換定量量環(huán)內(nèi)的的流動相相，消除除管壁效效應(yīng)，確確保進(jìn)樣樣的準(zhǔn)確確度及重重復(fù)性。六通閥使使用和維維護(hù)注意意事項(xiàng)：樣品品溶液進(jìn)進(jìn)樣前必必須用00.455&miicroo;m濾濾膜過濾濾，以減減少微粒粒對進(jìn)樣樣閥的磨磨損。轉(zhuǎn)動閥閥芯時(shí)不不能太慢慢，更不不能停留留在中間間位置，否否則流動動相受阻阻，使泵泵內(nèi)壓力力劇增，甚甚至超過過泵的最最大壓力力；再轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)

56、到進(jìn)樣樣位時(shí)，過過高的壓壓力將使使柱頭損損壞。為防止止緩沖鹽鹽和樣品品殘留在在進(jìn)樣閥閥中，每每次分析析結(jié)束后后應(yīng)沖洗洗進(jìn)樣閥閥。通常?？捎盟疀_洗，或或先用能能溶解樣樣品的溶溶劑沖洗洗，再用用水沖洗洗。4自動動進(jìn)樣。用于大大量樣品品的常規(guī)規(guī)分析。三、色譜譜柱色譜是一一種分離離分析手手段，分分離是核核心，因因此擔(dān)負(fù)負(fù)分離作作用的色色譜柱是是色譜系系統(tǒng)的心心臟。對對色譜柱柱的要求求是柱效效高、選選擇性好好，分析析速度快快等。市市售的用用于HPPLC的的各種微微粒填料料如多孔孔硅膠以以及以硅硅膠為基基質(zhì)的鍵鍵合相、氧化鋁鋁、有機(jī)機(jī)聚合物物微球（包包括離子子交換樹樹脂）、多孔碳碳等，其其粒度一一般為3

57、3,5,7,110mm等，柱柱效理論論值可達(dá)達(dá)5116萬/米。對對于一般般的分析析只需550000塔板數(shù)數(shù)的柱效效；對于于同系物物分析，只只要5000即可可；對于于較難分分離物質(zhì)質(zhì)對則可可采用高高達(dá)2萬萬的柱子子，因此此一般110330cmm左右的的柱長就就能滿足足復(fù)雜混混合物分分析的需需要。柱效受柱柱內(nèi)外因因素影響響，為使使色譜柱柱達(dá)到最最佳效率率，除柱柱外死體體積要小小外，還還要有合合理的柱柱結(jié)構(gòu)（盡盡可能減減少填充充床以外外的死體體積）及及裝填技技術(shù)。即即使最好好的裝填填技術(shù)，在在柱中心心部位和和沿管壁壁部位的的填充情情況總是是不一樣樣的，靠靠近管壁壁的部位位比較疏疏松，易易產(chǎn)生溝溝流，

58、流流速較快快，影響響沖洗劑劑的流形形，使譜譜帶加寬寬，這就就是管壁壁效應(yīng)。這種管管壁區(qū)大大約是從從管壁向向內(nèi)算起起30倍倍粒徑的的厚度。在一般般的液相相色譜系系統(tǒng)中，柱柱外效應(yīng)應(yīng)對柱效效的影響響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大大于管壁壁效應(yīng)。1柱的的構(gòu)造色譜柱由由柱管、壓帽、卡套（密密封環(huán)）、篩板（濾濾片）、接頭、螺絲等等組成。柱管多多用不銹銹鋼制成成，壓力力不高于于70 kg/cm22時(shí)，也也可采用用厚壁玻玻璃或石石英管，管管內(nèi)壁要要求有很很高的光光潔度。為提高高柱效，減減小管壁壁效應(yīng)，不不銹鋼柱柱內(nèi)壁多多經(jīng)過拋拋光。也也有人在在不銹鋼鋼柱內(nèi)壁壁涂敷氟氟塑料以以提高內(nèi)內(nèi)壁的光光潔度，其其效果與與拋光相相同。還還有使用

59、用熔融硅硅或玻璃璃襯里的的，用于于細(xì)管柱柱。色譜譜柱兩端端的柱接接頭內(nèi)裝裝有篩板板，是燒燒結(jié)不銹銹鋼或鈦鈦合金，孔孔徑0.2220&mmicrro;mm(510&miccro;m)，取取決于填填料粒度度，目的的是防止止填料漏漏出。色譜柱按按用途可可分為分分析型和和制備型型兩類，尺尺寸規(guī)格格也不同同：常常規(guī)分析析柱（常常量柱），內(nèi)內(nèi)徑25mmm（常用用4.66mm，國國內(nèi)有44mm和和5mmm），柱柱長100300cm；窄徑徑柱（nnarrrow borre，又又稱細(xì)管管徑柱、半微柱柱semmi-mmicrrocoolummn），內(nèi)內(nèi)徑12mmm，柱長長1020ccm；毛細(xì)管管柱（又又稱微柱柱m

60、iccroccoluumn），內(nèi)內(nèi)徑0.200.5mmm；半制備備柱，內(nèi)內(nèi)徑55mm；實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室制備備柱，內(nèi)內(nèi)徑200400mm，柱柱長100300cm；生產(chǎn)產(chǎn)制備柱柱內(nèi)徑可可達(dá)幾十十厘米。柱內(nèi)徑徑一般是是根據(jù)柱柱長、填填料粒徑徑和折合合流速來來確定，目目的是為為了避免免管壁效效應(yīng)。2柱的的發(fā)展方方向因強(qiáng)調(diào)分分析速度度而發(fā)展展出短柱柱，柱長長3110cmm，填料料粒徑223&miccro;m。為為提高分分析靈敏敏度，與與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而而發(fā)展出出窄徑柱柱、毛細(xì)細(xì)管柱和和內(nèi)徑小小于0.2mmm的微徑徑柱（mmicrroboore）。細(xì)管徑徑柱的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)省省流動相相；靈靈敏度增增加；樣品量量