化驗技術(shù)協(xié)會第八期培訓(xùn)資料2

1、*化驗技術(shù)術(shù)協(xié)會第第八期培培訓(xùn)資料料（微生物物檢定工工）*無菌檢查查法 無菌檢檢查是檢檢查要求求無菌的的藥品、醫(yī)療器器具、原原料、輔輔料及要要求無菌菌的其他他物品是是否染有有活菌的的一種方方法。事事實上，若若供試品品符合無無菌檢查查法的規(guī)規(guī)定，僅僅表明了了供試品品在該檢檢驗條件件下未發(fā)發(fā)現(xiàn)細菌菌和真菌菌污染。 無菌檢檢查法有有薄膜過過濾法、直接接接種法兩兩種方式式。細菌菌培養(yǎng)溫溫度322.52.5，真菌菌培養(yǎng)溫溫度255.52.5。1無菌檢檢查的環(huán)環(huán)境無菌檢查查的所有有操作均均需在嚴嚴格控制制微生物物污染的的環(huán)境下下進行，操操作環(huán)境境的無菌菌保證程程度將直接接影響無無菌檢查查結(jié)果，為為了保證證

2、無菌檢檢查用潔潔凈室(區(qū))環(huán)環(huán)境的穩(wěn)穩(wěn)定性，確確保檢查查結(jié)果的的可靠性性，對潔潔凈室(區(qū))的的環(huán)境質(zhì)質(zhì)量采取取合理的的控制措措施和評評價方法法是必要要的。無無菌檢查查應(yīng)在環(huán)環(huán)境潔凈凈度1000000級和局局部潔凈凈度1000級的的單向流流空氣區(qū)區(qū)域內(nèi)或或隔離系系統(tǒng)中進進行，其其全過程程必須嚴嚴格遵守守?zé)o菌操操作，防防止微生生物污染染。單向向流空氣氣區(qū)、工工作臺面面及環(huán)境境應(yīng)定期期按醫(yī)醫(yī)藥工業(yè)業(yè)潔凈室室(區(qū))懸浮粒粒子、浮浮游菌和和沉降菌菌的測試試方法的的現(xiàn)行國國家標準準進行潔潔凈度驗驗證。隔隔離系統(tǒng)統(tǒng)按相關(guān)關(guān)的要求求進行驗驗證，其其內(nèi)部環(huán)環(huán)境的潔潔凈度須須符合無無菌檢查查的要求求。 無菌室室應(yīng)

3、采光光良好、避免潮潮濕、遠遠離廁所所及污染染區(qū)。面面積一般般不超過過lOmm2，不小小于5mm2,高度不不超過22.4m。由12個緩緩沖間、操作間間組成(操作間間和緩沖沖間的門門不應(yīng)直直對)，操操作間與與緩沖間間之間應(yīng)應(yīng)具備滅滅菌功能能的樣品品傳遞箱箱。在緩緩沖間內(nèi)內(nèi)應(yīng)有洗洗手盆、毛巾、無菌衣衣褲放置置架及掛掛鉤、拖拖鞋等，不不應(yīng)放置置培養(yǎng)箱箱和其他他雜物；無菌室室內(nèi)應(yīng)六六面光滑滑平整，能能耐受清清洗消毒毒。墻壁壁與地面面、天花花板連接接處應(yīng)呈呈凹弧形形，無縫縫隙，不不留死角角。操作作間內(nèi)不不應(yīng)安裝裝下水道道。 無菌操操作室應(yīng)應(yīng)具有空空氣除菌菌過濾的的單向流流空氣裝裝置，操操作區(qū)潔潔凈度110

4、0級級或放置置同等級級別的超凈凈工作臺臺，室內(nèi)內(nèi)溫度控控制188266，相對對濕度44565。緩沖沖間及操操作室內(nèi)內(nèi)均應(yīng)設(shè)置能達達到空氣氣消毒效效果的紫紫外燈或或其他適適宜的消消毒裝置置，空氣氣潔凈級級別不同同的相鄰鄰房間之之間的靜靜壓差應(yīng)應(yīng)大于55Pa，潔潔凈室(區(qū))與與室外大大氣的靜靜壓差大大于lOOPa。無菌室室內(nèi)的照照明燈應(yīng)應(yīng)嵌裝在在天花板板內(nèi)，室室內(nèi)光照照應(yīng)分布布均勻，光光照度不不低于3300llx。緩緩沖間和和操作間間所設(shè)置置的紫外外線殺菌菌燈(222.5Wm3)，應(yīng)應(yīng)定期檢檢查輻射射強度，要要求在操操作面上上達400Wcm-22。不符符合要求求的紫外外殺菌燈燈應(yīng)及時時更換。 無菌

5、室室應(yīng)每周周和每次次操作前前用0.1新新潔爾滅滅或2甲酚液液或其他他適宜消消毒液擦擦拭操作作臺及可能能污染的的死角，開開啟無菌菌空氣過過濾器及及紫外燈燈殺菌11小時。在每次次操作完完畢，同同樣用上述消毒毒溶液擦擦拭工作作臺面，除除去室內(nèi)內(nèi)濕氣，用用紫外燈燈殺菌半半小時。無菌室的的潔凈度度檢查無無菌室在在消毒處處理后，無無菌試驗驗前及操操作過程程中需檢檢查空氣氣中菌落落數(shù)，以以此來判判斷無菌菌室是否否達到規(guī)規(guī)定的潔潔凈度，常常有沉降降菌和浮浮游菌測測定方法法。沉降菌檢檢測方法法及標準準以無菌菌方式將將3個營營養(yǎng)瓊脂脂平板帶帶入無菌菌操作室室，在操操作區(qū)臺臺面左、中、右右各放11個；打打開碟蓋蓋扣

6、置，平平板在空空氣中暴暴露300分鐘后后將碟蓋蓋蓋好，置置3252.5培養(yǎng)448小時時，取出出檢查，33個平板板上生長長的菌落落數(shù)平均均不超過過1個。浮游菌檢檢測方法法及標準準用專門門的采樣樣器，宜宜采用撞撞擊法機機理的采采樣器，一一般采用用狹縫式或離心心式采樣樣器，并并配有流流量計和和定時器器，嚴格格按儀器器說明書書的要求求操作并并定期校校驗，采采樣器和和培養(yǎng)皿皿進入被被測房間間前先用用消毒房房間的消消毒劑滅滅菌，使使用的培培養(yǎng)基為為營養(yǎng)瓊瓊脂培養(yǎng)養(yǎng)基或藥藥典認可可的其它它培養(yǎng)基基。使用用時，先先開動真真空泵抽抽氣，時時間不少少于5分分鐘，調(diào)調(diào)節(jié)流量量、轉(zhuǎn)盤盤、轉(zhuǎn)速速。關(guān)閉閉真空泵泵，放入入

7、培養(yǎng)皿皿，蓋上上采樣器器蓋子后后調(diào)節(jié)縫縫隙高度度。置采采樣口于于采樣點點后，依依次開啟啟采樣器器、真空空泵，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動定時時器，根根據(jù)采樣樣量設(shè)定定采樣時時間。全全部采樣樣結(jié)束后后，將培培養(yǎng)皿置置32.52.5培養(yǎng)448小時時，取出出檢查，浮浮游菌落落數(shù)平均均不得過過5個m3。每批培養(yǎng)養(yǎng)基應(yīng)選選定3只只培養(yǎng)皿皿做對照照培養(yǎng)。 無無菌操作作臺面或或超凈工工作臺還還應(yīng)定期期請有關(guān)關(guān)部門檢檢測其懸懸浮粒子子，應(yīng)達達到lOOO級(一般用塵埃粒粒子計數(shù)數(shù)儀)檢檢測塵埃埃粒徑0.5m的粒粒數(shù)不得得超過33.5個升，5m的粒粒數(shù)為00,空氣氣流速應(yīng)應(yīng)0.355mss，可根根據(jù)無菌菌狀況必必要時置置換過濾濾器。2

8、 儀儀器及用用具 2.11 無無菌室內(nèi)內(nèi)應(yīng)準備備好盛有有消毒用用5甲甲酚或其其他適宜宜消毒溶溶液的玻玻璃缸、乙醇燈燈、火柴、鑷鑷子、775乙乙醇棉、碘伏棉棉等。 恒溫溫培養(yǎng)箱箱及生化化培養(yǎng)箱箱。離心機、生物顯顯微鏡、真空架架、高壓壓蒸汽滅滅菌器、標準ppH比色色器(00.02酚磺酞酞指示液和和溴麝香香草酚藍藍指示液液)、恒恒溫烤箱箱、開放放或全封封閉過濾濾系統(tǒng)。2.4 玻璃璃器皿 試管管、量筒筒、三角角瓶、移移液管、刻度吸吸管(11、5、10mml)、注注射器(2、55、lOmll)、雙雙碟等，用用玻璃洗洗滌劑或或清潔液液浸泡，水水洗3次次。如使使用過程程中與細細菌接觸觸(已污污染)，應(yīng)應(yīng)先滅

9、菌菌倒出內(nèi)內(nèi)容物后后再清洗洗，晾干干。凡無無菌操作作過程中中所用的的器皿，都都應(yīng)用牛牛皮紙包包扎嚴密密，滅菌菌。移液液管、刻刻度吸管管在管內(nèi)內(nèi)上端，塞塞少許原原棉，以以手感不不松不緊緊為宜，然然后放于于吸管筒筒內(nèi)或牛牛皮紙袋袋內(nèi)，封封嚴，滅滅菌待用用；試管管、離心心管、三三角瓶等等在管(瓶)口口塞上海海棉膠(或硅膠膠)專用用塞或紗紗布棉塞塞，塞子子應(yīng)塞進進管口內(nèi)內(nèi)2/33處，用用牛皮紙紙將管口口(包括括塞子)包扎嚴嚴，滅菌菌待用；將注射射器、針針頭(99號、111號、122號)配配對，檢檢查針頭頭是否暢暢通后，將將注射芯芯、管和和針頭分分別放在在雙層紗紗布(或或布)內(nèi)內(nèi)，包扎扎嚴密，置置帶蓋容

10、容器(瓷瓷盤或鋁鋁制飯盒盒)內(nèi)，蓋蓋嚴，用用牛皮紙紙包扎后后，滅菌菌待用。長柄取取樣匙，放放于不銹銹鋼長筒筒內(nèi)，蓋蓋嚴，干干熱滅菌菌待用。手術(shù)鑷鑷、手術(shù)術(shù)剪洗凈凈、擦干干。用雙雙層紗布布將1把把剪刀與與1把鑷鑷子間隔隔包扎在在一起，放放于帶蓋蓋的容器器（瓷盒盒或鋁制制飯盒)內(nèi)，蓋蓋嚴，用用牛皮紙紙包扎，滅滅菌(參參照附錄錄XV滅滅菌法)待用。高壓蒸蒸汽滅菌菌的物品品取出時時切勿立立即置冷冷處，避避免因急急速冷卻卻，使滅滅菌物品品內(nèi)蒸汽汽冷凝造造成負壓壓，易染染菌，取取出后應(yīng)應(yīng)置恒溫溫培養(yǎng)箱箱(或干干燥箱)中烘干干，待用用。2.5 無菌菌衣、褲褲、帽、口罩等等洗凈晾晾干，配配套，用用牛皮紙紙包嚴

11、，滅滅菌待用用或用一一次性的無菌物物品代替替。 2.66除菌濾濾器及濾濾膜 有多種種開放式式及封閉閉式濾器器用于過過濾除菌菌。微孔孔濾膜直直徑500mm、孔孔徑約00.45m。新新購入封封閉式濾濾器或濾濾膜，需需進行孔孔徑大小小的測試試，一般般有三種種方法，其中一種種方法即即可。氣泡法 先將將濾膜浸浸入水中中，使完完全濕潤潤，然后后用鑷子子夾住一一片濾膜膜放于氣氣泡點測測定裝置置或濾膜膜孔徑測測定儀上上，膜上上放一塊塊與濾膜膜大小相相同的尼尼龍篩網(wǎng)網(wǎng)，再加加上多孔孔板，將將螺旋固固定圈旋旋緊，在在多扎板板上加335mmm深的的水(注注意排除除氣泡)關(guān)閉放放氣閥，啟啟動空壓壓機或氮氮氣瓶閥閥，使

12、壓壓力緩緩緩上升，注注意觀察察水面上上產(chǎn)生第第一個氣氣泡時，記記錄壓力力表的壓壓力，氣氣泡點壓壓力不應(yīng)應(yīng)小于22.2kkg/ccm2(0.2MPPa)。水流量法法 將將濾膜裝裝于除菌菌濾器上上，開動動真空泵泵，壓力力在7000mmmHg(93kkPa)下，抽抽濾已濾清的水水約5000mll，計算算出每llminn的濾速速。20005年年版中國國藥典對對濾膜的的濾速未未明確規(guī)規(guī)定，而而USPP規(guī)定在在7000mmHHg(993kPPa)壓壓力下，濾濾膜直徑徑47mmm；流流速555755mlminn。細菌過濾濾法 常用的的細菌為為粘質(zhì)沙沙雷氏菌菌，將該該菌的新新鮮營養(yǎng)養(yǎng)瓊脂斜斜面培養(yǎng)養(yǎng)物，接接種

13、于營養(yǎng)肉湯湯培養(yǎng)基基中，332.52.5，培養(yǎng)養(yǎng)1820小小時，用用0.9無無菌氯化化鈉溶液液稀釋至至10-3 (約相當(dāng)當(dāng)于71055cfuum11)，取取此菌液液1mll加至550mll 0.9無無菌氯化化鈉溶液液中，按按薄膜過過濾法過過濾，取取該濾液液5mll接種于于營養(yǎng)肉肉湯培養(yǎng)養(yǎng)基400ml中中，322.52.5培養(yǎng)244小時,應(yīng)無菌菌生長。不符合合規(guī)定的的濾膜不不得使用用。3 菌菌種及菌菌液制備備菌種的傳傳代次數(shù)數(shù)不得超超過5代代(從菌菌種保藏藏中心獲獲得的冷冷凍干燥燥的菌種種為第00代；冷冷凍干燥燥的原始始菌種開開啟后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)種，為為第一代代)。原始菌種種購到后后，應(yīng)由由專人負負責(zé)，接

14、接收菌種種時應(yīng)檢檢查安瓿瓿的數(shù)量量和菌種種的名稱稱及每一一支安瓿的完完整性。并在相相應(yīng)的菌菌種接收收登記表表上記錄錄所有關(guān)關(guān)于菌種種的信息息。將安安瓿存于于-200，使用用時首先先需要復(fù)復(fù)活凍干干菌種(按菌種種保藏中中心提供供相關(guān)資資料操作作)，一一般包括括以下步步驟：冷凍菌種種的復(fù)活活 清清潔安瓿瓿(可用用75的酒精精或碘伏伏)后，用用砂輪在在安瓿上上部三分分之一處劃痕，用用干燥的的無菌紗紗布包裹裹安瓿，將將安瓿掰掰開，用用一無菌菌吸管吸吸取適量量0.50.8ml的液體體培養(yǎng)基基(生孢孢梭菌用用液體硫硫乙醇酸酸鹽培養(yǎng)養(yǎng)基；金金黃色葡葡萄球菌菌、大腸腸埃希菌菌、銅綠綠假單胞胞菌和枯枯草芽孢孢桿

15、菌用用營養(yǎng)肉肉湯；白白色念珠珠菌、黑黑曲霉菌菌用液體體真菌培培養(yǎng)基)滴加到到安瓿中中，輕輕輕旋轉(zhuǎn)安安瓿并吹吹打，使使凍干菌菌種和液液體培養(yǎng)養(yǎng)基充分分混和并并完全溶溶解，再再將安瓿瓿內(nèi)的菌菌懸液全全部吸出出，轉(zhuǎn)移移至相應(yīng)應(yīng)的培養(yǎng)養(yǎng)基試管管中，根根據(jù)菌種種類型采采用適宜宜的培養(yǎng)養(yǎng)條件(細菌培培養(yǎng)溫度度32.52.5，188244小時；真菌培培養(yǎng)溫度度25.52.5，35天)下培養(yǎng)養(yǎng)，觀察察培養(yǎng)基基是否渾渾濁，(如不渾渾濁，細細菌應(yīng)延延長培養(yǎng)養(yǎng)時間至至7天以以上，真真菌應(yīng)延延長培養(yǎng)養(yǎng)時間至至14天天以上，仍仍未渾濁濁，按相相關(guān)規(guī)定定滅菌處處理。)渾濁說說明菌種種復(fù)活生生長，在在應(yīng)用前前，還應(yīng)應(yīng)確認菌

16、菌種的純純度和特特性。菌種確認認 用用無菌接接種環(huán)取取上述培培養(yǎng)物，在在相應(yīng)的的培養(yǎng)基基平板上上劃線分分離單個個菌落，適適宜條件下下培養(yǎng)。培養(yǎng)后后觀察是是否具有有典型的的菌落形形態(tài)，然然后挑取取單一的的純菌落落，進行行革蘭染染色、鏡鏡檢，觀觀察其染染色特性性及菌形形。并作作生化實實驗或使使用菌種種鑒定系系統(tǒng)進一一步鑒定定該菌種種。對已已通過確確認鑒定定后的菌菌種可以以使用或或傳代保保藏。菌種傳代代保藏方方法很多多，各單單位可根根據(jù)情況況采用，但但無論應(yīng)應(yīng)用何種種方法，都都應(yīng)對采采用的方法進行行驗證，確確保在相相應(yīng)保存存條件下下的菌種種不會變變異且性性能穩(wěn)定定，同時時也應(yīng)兼兼顧到方方法的經(jīng)經(jīng)濟和

17、簡簡便。常常用的有有甘油冷冷凍管保保藏法、斜面低低溫保藏藏法等，此此類方法法簡單易易行。甘油冷凍凍管保藏藏法 將待保保藏菌接接種平板板或瓊脂脂斜面，適適宜溫度度下培養(yǎng)養(yǎng)適宜時時間后(細菌2448小小時的培培養(yǎng)物，白白色念珠珠菌722小時的的培養(yǎng)物物)，用用無菌接接種環(huán)輕輕輕刮取取菌苔，并并通過接接種環(huán)與與試管壁壁之間的的輕輕摩摩擦使細細菌充分分擴散到到預(yù)先裝裝于試管管中的無無菌蒸餾餾水中，調(diào)調(diào)整菌液液濃度，向向已制備備好的菌菌懸液中中加入等等體積、濃度為為20的無菌菌甘油，輕輕輕振搖搖小管，使使內(nèi)容物物充分混混和，分分裝于無無菌小管管，制好好的甘油油冷凍管管最好在在-300貯存。斜面低溫溫保藏

18、法法 將將工作用用菌種的的典型菌菌落接種種在適宜宜的固體體斜面培培養(yǎng)基，按按規(guī)定的的溫度和時間間培養(yǎng)，待待菌生長長充分以以后，把把培養(yǎng)好好的新鮮鮮菌種管管用牛皮皮紙包好好，轉(zhuǎn)移移至4左右冰冰箱保存存，如菌菌種保藏藏管的塞塞子是橡橡膠塞，并并采用半半固體高高層培養(yǎng)養(yǎng)基穿刺刺培養(yǎng)，則則可以保保存時間間較長。銅綠假假單胞菌菌不宜用用本法保保存。3.1 菌種種(1)金金黃色葡葡萄球菌菌(Sttaphhyloococccuaaureeus)CMMCC(B)2260003(2)枯枯草芽孢孢桿菌(Baccilllusssubttiliis)CMCCC(BB)6335011(3)大大腸埃希希菌(EEschhe

19、riichiiacooli)CMMCC(B)4441002(4)銅銅綠假單單胞菌(Pseeudoomonnasaaeruuginnosaa)CCMCCC(B)101104(5)生生孢梭菌菌(Cllosttriddiummspooroggenees)CMCCC(BB)6449411(6)白白色念珠珠菌(CCanddidaaalbbicaans)CMMCC(F)9980001(7)黑黑曲霉(Aspperggilllusnnigeer)CMCCC(FF)98800333.2 菌液液制備制備的菌菌液，一一般當(dāng)日日使用。取金黃色色葡萄球球菌、枯枯草芽孢孢桿菌、大腸埃埃希菌、銅綠假假單胞菌菌的新鮮鮮培養(yǎng)物

20、物少許接接種至營養(yǎng)肉肉湯培養(yǎng)養(yǎng)基中，生生孢梭菌菌的新鮮鮮培養(yǎng)物物少許接接種至硫硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)基基中，332.52.55培養(yǎng)118224小時時；白色色念珠菌菌的新鮮鮮培養(yǎng)物物接種至至改良馬馬丁培養(yǎng)養(yǎng)基或改改良馬丁丁瓊脂培培養(yǎng)基中中，255.52.5培養(yǎng)224448小時時，上述述培養(yǎng)物物用0.9無無菌氯化化鈉溶液液制成每每毫升含含菌小于于1000菌落形形成單位位(cffu)的的菌懸液液。將黑曲霉霉菌斜面面的新鮮鮮培養(yǎng)物物接種至至改良馬馬丁瓊脂脂斜面培培養(yǎng)基上上，255.52.5培養(yǎng)57天天，使大大量的孢孢子成熟熟。加入入355ml 0.9無無菌氯化化鈉溶液液，用玻玻棒或白白金餌輕輕輕振搖搖

21、將孢子子洗脫。然后，用用管口帶帶有能過過濾菌絲絲的裝置置(如薄薄層無菌菌棉花或或紗布的的無菌毛毛細吸管管)的吸吸管吸出出胞子懸懸液至無無菌試管管內(nèi)，用用0.9無無菌氯化化鈉溶液液將其稀稀釋至每每毫升含含小于1100ccfu的的孢子懸懸液(可可采用比比濁法)。以上菌液液在供試試驗的同同時，金金黃色葡葡萄球菌菌、銅綠綠假單胞胞菌、大大腸埃希希菌、枯枯草芽孢孢桿菌用營養(yǎng)養(yǎng)瓊脂，白白色念球球菌和黑黑曲霉用用改良馬馬丁培養(yǎng)養(yǎng)基注皿皿(1mm1)或或平板涂涂布(00.1m11)，按按規(guī)定條條件培養(yǎng)養(yǎng)后，計計數(shù)。4 培培養(yǎng)基4.1 一般采采用商品品脫水培培養(yǎng)基，臨臨用時按按照使用用說明書書進行配配制，配配制

22、培養(yǎng)養(yǎng)基時稱稱量要迅速以免免吸潮而而影響稱稱量的準準確性，同同時為避避免增加加培養(yǎng)基基中的金金屬離子子及其他他微量化化學(xué)元素而影響響微生物物的生長長、鑒別別、所用用器具應(yīng)應(yīng)為潔凈凈玻璃器器皿，所所用溶解解用水為為純水。4.2 培養(yǎng)養(yǎng)基的ppH值應(yīng)應(yīng)符合規(guī)規(guī)定，否否則必須須校正。調(diào)節(jié)ppH值：測定ppH值的的標準溫溫度為252，調(diào)節(jié)節(jié)pH值值可用無無菌的llmollL(1N)氫氧化化鈉或110碳碳酸鈉溶溶液、llmollL鹽鹽酸溶液液或155%冰醋醋酸溶液液。分裝裝好的培培養(yǎng)基及及時密封封后必須須在配制制當(dāng)天(2小時時內(nèi)最佳佳)進行行滅菌處處理。4.3 新鮮鮮配制的的培養(yǎng)基基，應(yīng)按按中國藥藥典規(guī)

23、定定的處方方，對培培養(yǎng)基的的原材料料要進行行挑選，化化學(xué)藥品品均需用用CP試試劑規(guī)格格。4.3.1 除除葡萄糖糖和指示示液外，將將處方中中各成分分加水后后置有石石棉網(wǎng)的的電爐、可調(diào)電電磁爐或或其它適宜宜的加熱熱設(shè)備中中，微溫溫溶解。用lmmol/L氫氧氧化鈉溶溶液調(diào)節(jié)節(jié)pH，使使其比規(guī)規(guī)定的ppH值略略高0.40.66，煮沸沸，用棉棉(紙)漿減壓壓抽濾或或以脫脂脂棉，濾濾紙等濾濾材過濾濾，使培培養(yǎng)基澄澄清。4.3.2 加入葡葡萄糖和和指示液液，搖勻勻，補足足水量，調(diào)調(diào)節(jié)pHH值(比比規(guī)定的的pH值值略高00.20.4)，使滅滅菌后為為7.10.22，分裝裝，裝量量不宜超超過容器器的23，以以免

24、滅菌菌時溢出出。4.3.3 硫乙醇醇酸鹽流流體培養(yǎng)養(yǎng)基I，分分裝至適適宜的容容器中，其其裝量與與容器高高度的比比例應(yīng)符合培養(yǎng)養(yǎng)結(jié)束后后培養(yǎng)基基的氧化化層(粉粉紅色)不超過過培養(yǎng)基基深度的的122，滅菌菌。在供供試品接接種前，培培養(yǎng)基氧氧化層的的顏色不不得超過過培養(yǎng)基基深度的的l55，否則則，須經(jīng)經(jīng)1000水浴或或流通蒸蒸汽加熱熱至粉紅紅色消失失(不超超過200分鐘)，迅速速冷卻。培養(yǎng)基基只限加加熱一次次，并防防止被污污染。4.3.4 滅菌應(yīng)應(yīng)采用驗驗證合格格的滅菌菌程序進進行。培培養(yǎng)基應(yīng)應(yīng)只能進進行一次次蒸汽滅滅菌處理理。固體培養(yǎng)養(yǎng)基使用用前的融融化，不不宜使用用蒸汽滅滅菌柜融融化瓊脂脂培養(yǎng)基

25、基，宜選選用沸水水浴融化化培養(yǎng)基基。4.4 未開開封脫水水培養(yǎng)基基應(yīng)避光光儲存于于25以下陰陰涼干燥燥處，已已開封的的脫水培培養(yǎng)基應(yīng)應(yīng)蓋緊，避光光儲存于于25以下陰陰涼干燥燥處。制制備好的的培養(yǎng)基基應(yīng)保存存在225避光的的環(huán)境，有有條件置置冰箱448冷藏儲儲存較好好。培養(yǎng)養(yǎng)基若保保存于非非密閉容容器中，應(yīng)應(yīng)在三周周內(nèi)使用用；若保保存于密密閉容器器中，可可在一年年內(nèi)使用用。 4.55 培培養(yǎng)基的的裝量對于采用用直接接接種法檢檢查的液液體樣品品，培養(yǎng)養(yǎng)基的裝裝量與供供試品的的裝量相相關(guān)，供供試品的裝裝量小于于20mml的樣樣品，培培養(yǎng)基裝裝量155ml；供試品品的裝量量大于或或等于220mll小于

26、550mll的樣品品，培養(yǎng)養(yǎng)基裝量量40mml；供試試品的裝裝量大于于或等于于50mml小于于1000ml的樣品品，培養(yǎng)養(yǎng)基裝量量80mml；4.5.2 對于采采用直接接接種法法檢查的的固體樣樣品(含含藥品及及外科用用輔料棉棉花及紗紗布)，培培養(yǎng)基的裝量量均為1100mml；對對于縫合合線、一一次性醫(yī)醫(yī)用材料料及醫(yī)療療器具，如如果醫(yī)療療器具體體積過大大，培養(yǎng)養(yǎng)基的裝裝量可在在20000mll以上，以以將其完完全浸沒沒為準。4.5.3 對于采采用薄膜膜過濾法法檢查的的樣品，若若用封閉閉式薄膜膜濾器操操作的，培培養(yǎng)基裝裝量100mml；若若用開放放式薄膜膜濾器操操作的，培培養(yǎng)基裝裝量500ml。

27、4.6 培養(yǎng)養(yǎng)基的適適用性檢檢查培養(yǎng)基的的檢查包包括無菌菌檢查和和靈敏度度檢查；符合規(guī)規(guī)定者方方可用于于供試品品的無菌菌檢查。培養(yǎng)基的的無菌檢檢查可在在供試品品的無菌菌檢查前前或與供供試品的的無菌檢檢查同時時進行，但但是所用用培養(yǎng)基不不符合無無菌要求求，供試試品的無無菌檢查查結(jié)果應(yīng)應(yīng)視為無無效。培養(yǎng)基的的靈敏度度檢查應(yīng)應(yīng)對購進進的每個個批號的的脫水培培養(yǎng)基進進行靈敏敏度檢查查，檢查查合格后后方可使用，但但當(dāng)培養(yǎng)養(yǎng)基的配配制方法法和滅菌菌程序發(fā)發(fā)生變更更時，應(yīng)應(yīng)再次對對培養(yǎng)基基的靈敏敏度進行行檢查。4.6.1 培養(yǎng)基基無菌檢檢查的操操作及結(jié)結(jié)果判定定每批培養(yǎng)養(yǎng)基隨機機取不少少于5支支(瓶)，按規(guī)

28、規(guī)定溫度度培養(yǎng)114天，應(yīng)應(yīng)無菌生生長。4.6.2 培養(yǎng)基基靈敏度度檢查的的操作及及結(jié)果判判定取每管裝裝量為112mll的硫乙乙醇酸鹽鹽流體培培養(yǎng)基99支，分分別接種種金黃色色葡萄球球菌、銅銅綠假單胞菌、枯草芽芽孢桿菌菌、生孢孢梭菌各各2支，每每支接種種菌量為為lmll(含菌菌小于1100ccfu)，另11支不接接種作為為空白對對照，培培養(yǎng)3天天；取每每管裝量量為9mml的改改良馬丁丁培養(yǎng)基基5支，分分別接種種白色念念珠菌、黑曲霉霉各2支支，每支支接種菌菌量為llml(含菌小小于1000cffu)，另另1支不不接種作作為空白白對照，培培養(yǎng)5天天，逐日日觀察結(jié)結(jié)果?？湛瞻讓φ照展軕?yīng)無無菌生長長，

29、若加加菌的培培養(yǎng)基管管均生長長良好，判判該培養(yǎng)養(yǎng)基的靈靈敏度檢檢查符合合規(guī)定。對于配制制后的選選擇性培培養(yǎng)基的的靈敏度度檢查試試驗同上上。5 方方法驗證證試驗為保證檢檢驗質(zhì)量量，對所所用的檢檢驗方法法必須經(jīng)經(jīng)過驗證證，才能能確保檢檢驗結(jié)果果的準確確可靠。當(dāng)建立藥品品的無菌菌檢查法法時，應(yīng)應(yīng)進行方方法的驗驗證，以以確認供供試品在在該實驗驗條件下下無抑菌菌活性或或其抑菌菌活性可可以忽略略不計。若供試試品的生生產(chǎn)工藝藝，原、輔料組組分或檢檢驗條件件發(fā)生改改變時，檢檢查方法法應(yīng)進行行重新驗驗證。針對藥品品的無菌菌檢查試試驗，在在確定產(chǎn)產(chǎn)品的無無菌檢查查試驗方方法時或或建立新新的檢查查方法時時，或當(dāng)試驗

30、驗條件(包括培培養(yǎng)條件件)發(fā)生生變更時時，都必必須要對對新的或或變更后后的檢驗驗方法加加以驗證證，以確確認供試試品在該該實驗條條件下無無抑菌活活性或其其抑菌活活性可以以忽略不不計。確確保在實實際檢驗驗條件下下，該供供試品的的無菌檢檢查法的的準確性性、有效效性和重重現(xiàn)性。驗證時時，按“供試品品的無菌菌檢查”的規(guī)定定及下列列要求進進行操作作試驗。供試品品對每一一試驗菌菌的抑菌菌活性應(yīng)應(yīng)逐一進進行驗證證。驗證用菌菌種、菌菌液制備備、各試試驗菌所所對應(yīng)的的培養(yǎng)基基及培養(yǎng)養(yǎng)溫度、參見33.1及33.2部分分。5.1 薄膜膜過濾法法驗證試試驗將規(guī)定量量的供試試品按薄薄膜過濾濾法過濾濾，沖洗洗，在最最后一次

31、次的沖洗洗液中加加入試驗驗菌少于于100CCFU。取出濾濾膜接種種至相應(yīng)應(yīng)的培養(yǎng)養(yǎng)基中，或或?qū)⑴囵B(yǎng)養(yǎng)基直接接加至濾濾筒內(nèi)。另取一一濾筒，不不過濾供供試品，其其它操作作同上，作作為陽性性對照，將將含培養(yǎng)養(yǎng)基的容容器按規(guī)規(guī)定溫度度培養(yǎng)335天天。各試試驗菌及及相應(yīng)的的培養(yǎng)基基逐一進進行驗證證。5.2 直接接接種法法驗證試試驗取適宜裝裝量的硫硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)基基8管，分分別加入入金黃色色葡萄球球菌、枯枯草芽孢孢桿菌、銅綠假單單胞菌、生孢梭梭菌的菌菌液各兩兩管；取取適宜裝裝量的改改良馬丁丁培養(yǎng)基基4管，分分別加入入白色念念珠菌、黑曲霉霉菌菌液液各兩管管。每管管加菌量量小于1100ccfu。其中1

32、1管接入入規(guī)定量量的供試試品，另另1管作作為陽性性對照，各各試驗管管按相應(yīng)應(yīng)規(guī)定的的溫度培培養(yǎng)35天。5.3 判斷斷與陽性對對照比較較，如含含供試品品各容器器中的試試驗菌均均生長良良好，并并且與陽陽性對照照容器內(nèi)內(nèi)的培養(yǎng)結(jié)果果相似，則則供試品品的該檢檢驗量在在該檢驗驗條件下下無抑菌菌作用或或抑菌作作用消除除，供試試品可按按該法進進行無菌菌檢查。若含供供試品的的任一容容器中微微生物生生長微弱弱、緩慢慢或不生生長，則則供試品品的該檢檢驗量在在該檢驗驗條件下下有抑菌菌作用，若若采用的的是直接接接種法法，可根根據(jù)實際際情況增增加培養(yǎng)養(yǎng)基的用用量、在在沖洗液液中或培培養(yǎng)基中中使用中中和劑(如-內(nèi)酰酰胺酶

33、、對氨基基苯甲酸酸、聚山山梨脂880)、或改為為薄膜過過濾法。若采用用的是薄薄膜過濾濾法，可可采用增增加沖洗洗液的用用量、改改變沖洗洗液的種種類、更更換濾膜膜品種等等方法消消除供試試品的抑抑菌作用用。并重重新進行行驗證試試驗。 已進行行過無菌菌檢查法法方法驗驗證試驗驗的供試試品，按按此法進進行無菌菌檢查。 6 供供試品的的無菌檢檢查 6.11 檢檢驗數(shù)量量及檢驗驗量檢驗數(shù)量量是指一一次試驗驗所用供供試品最最小包裝裝的數(shù)量量。除另另有規(guī)定定外，出出廠產(chǎn)品品應(yīng)盡量量抽取批批生產(chǎn)開開始和結(jié)結(jié)束或生生產(chǎn)過程程出現(xiàn)異異常情況況下的產(chǎn)產(chǎn)品進行行檢驗；一般情情況下，供供試品無無菌檢查查若采用用薄膜過過濾，應(yīng)

34、應(yīng)增加11/2的的最小檢檢驗數(shù)量量作陽性性對照用用；若采采用直接接接種法法，應(yīng)增增加供試試品1支支(或瓶瓶)作陽陽性對照照用。檢驗量是是指一次次試驗所所用的供供試品總總量(gg或ml)。采用用直接接接種法時時，若每每支(瓶瓶)供試試品的裝裝量按規(guī)規(guī)定足夠夠接種兩兩份培養(yǎng)養(yǎng)基，則則應(yīng)分別別接種硫硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)基基和改良良馬丁培培養(yǎng)基。采用薄薄膜過濾濾法時，檢檢驗量應(yīng)應(yīng)不少于于直接接接種法的的總接種種量，只只要供試試品特性性允許，應(yīng)應(yīng)將所有有容器內(nèi)內(nèi)的全部部內(nèi)容物物過濾。 6.22培養(yǎng)基基用量 除另另有規(guī)定定外，供供試品無無菌檢查查時，每每支培養(yǎng)養(yǎng)基的實實際裝量量及所占占容器高高度的比比例

35、應(yīng)與與“驗證試試驗”所用的的培養(yǎng)基基相同。 6.33 陽陽性對照照 供試品品無菌檢檢查應(yīng)進進行陽性性對照試試驗。陽陽性對照照菌的選選擇原則則：應(yīng)根根據(jù)驗證證試驗結(jié)結(jié)果選擇擇相應(yīng)對對照菌，陽陽性對照照管的加加菌量為為小于1100個個cfu。陽性對對照管培培養(yǎng)48872小小時，應(yīng)應(yīng)生長良良好。6.4 陰性對對照 凡無菌菌檢查，均均應(yīng)取相相應(yīng)溶劑劑和稀釋釋劑同法法操作作作為陰性性對照。陰性對對照不得得有菌生生長。 6.5無菌菌檢查操操作 無菌檢檢查法包包括薄膜膜過濾法法和直接接接種法法。只要要供試品品性狀允允許，應(yīng)應(yīng)采用薄薄膜過濾濾法。 6.5.1 供試品品在移入入緩沖間間前應(yīng)除除去外包包裝、消消毒

36、外表表面并編編號，培培養(yǎng)基管管(瓶)用0.1%新潔爾爾滅或酒酒精棉擦擦拭瓶(管)外外壁，然然后連同同其他用用具(包包括無菌菌衣、帽帽、口罩罩等)移移入緩沖沖間，開開啟操作作間紫外外燈和空空氣過濾濾裝置并并使其工工作1小小時以上上。 6.5.2 操作人人員用肥肥皂、水水清洗雙雙手，關(guān)關(guān)閉紫外外光燈，進進入緩沖沖間，換換拖鞋，再再用755乙醇醇棉球擦擦手，穿穿戴衣、帽、口口罩、手手套。將將所需物物品剝?nèi)トヅＦぜ埣?，移入入無菌間間，每次次試驗中中所用物物品必須須計劃好好，并有有備用物物。 6.5.3 供試品品外部消消毒 6.55.3.1 將消毒毒過的粉粉針劑、油劑等等鋁蓋壓壓封的橡橡皮塞小小瓶，先先

37、用755乙醇醇或碘伏伏棉球擦擦拭外壁壁及瓶塞塞，待干干，用滅滅菌鑷子子剔去鋁鋁蓋上的的鋁質(zhì)小小圓片，過過火焰數(shù)數(shù)次。將消毒過過的安瓿瓿針劑先先用碘酒酒棉球或或碘伏棉棉球?qū)舶碴惩獠坎坎潦脺鐪缇?，用用砂輪或滅滅菌銼輕輕割安瓿瓿頸部（便便于折開開安瓿），再再用755%乙醇醇棉球?qū)⒒蔷撇敛羶?，待待干?.5.3.33 其他他供試品品容器表表面或外外包裝，可可參照上上述用適適當(dāng)消毒毒液擦拭拭或浸沒沒后以無無菌的方方式取內(nèi)內(nèi)容物。6.5.4 供供試品制制備用滅菌鑷鑷取出注注射器，在在火焰旁旁將針芯芯插入針針管并安安上針頭頭，供試試品瓶蓋蓋和注射射器針頭頭均應(yīng)迅迅速通過過火焰數(shù)數(shù)次；當(dāng)當(dāng)供試品品

38、為粉針針劑，瓶瓶蓋為橡橡膠塞時時，用注注射器吸吸取規(guī)定定的溶劑劑，在已已消毒好好的橡膠膠塞中心心位置刺刺入小瓶瓶加入溶溶劑，溶溶解，混混勻后吸吸出溶液液，或選選用其它它適宜的的方法。如為注注射液、供角膜膜創(chuàng)傷及及手術(shù)用用的滴眼眼劑或滅滅菌溶液液可直接接用注射射器吸取取藥液，或或選用其其它適宜宜的方法法。按規(guī)規(guī)定或需需滅活的的供試品品可用滅滅活劑溶溶解，將將瓶內(nèi)供供試液抽抽出稀釋釋至規(guī)定定的濃度度。需加加入空氣氣加壓后后便于抽抽出的供供試品，應(yīng)應(yīng)用注射射器對著著火焰抽抽取空氣氣加入，抽抽取瓶中中液體時時，應(yīng)將將供試品品倒置并并使針頭頭在液面面下。供供試品如如為直接接分裝成成注射用用無菌粉粉末的原

39、原料藥（大大包裝粉粉針劑），取取樣時為為縮短暴暴露時間間，應(yīng)由由兩人操操作。將將放置于于緩沖間間的包裝裝瓶用00.1%新潔爾爾滅抹凈凈外壁，且且經(jīng)紫外外線照射射1小時時后移入入操作間間（臺），除除去鋁蓋蓋，用775%乙乙醇棉或或碘伏棉棉球擦拭拭瓶口橡橡膠塞外外壁和瓶瓶口縫隙隙，待干干，戴好好醫(yī)用消消毒手套套，在火火焰旁小小心揭開開瓶塞，用用專用取取樣器取取出規(guī)定定量的樣樣品，置置滅菌試試管中，密密塞待用用，立即即蓋好大大包裝瓶瓶塞，用用橡皮膠膠布及時封封口，再再用封箱箱紙包扎扎瓶口。如果容容器內(nèi)有有一定的的真空，可可用適當(dāng)當(dāng)?shù)臒o菌菌器材（如如一端帶帶有除菌菌過濾器器的針頭頭），向向供試品品容器

40、內(nèi)內(nèi)導(dǎo)入無無菌空氣氣，再按按無菌操操作開啟啟容器取取出內(nèi)容容物。供試品處處理時所所用的溶溶劑、乳乳化劑、分散劑劑、中和和劑及其其用量應(yīng)應(yīng)驗證是有效效的，并并對微生生物生長長無影響響。除另有規(guī)規(guī)定外，供供試品處處理及接接種，按按下列方方法進行行。6.5.5 薄薄膜過濾濾法無菌檢查查用的濾濾膜孔徑徑為不大大于0.45m，直徑徑約為550mmm。應(yīng)根根據(jù)供試試品及其其溶劑的的特性選選擇濾膜膜材質(zhì)，如如抑菌性性供試品品采用低低吸附性性的濾膜膜，油性性供試品品選用疏疏水性濾濾膜。水水溶性供供試液過過濾前先先將少量量的沖洗洗液過濾濾以潤濕濕濾膜。油類供供試品，其其濾膜和和過濾器器在使用用前應(yīng)充充分干燥燥。

41、使用用時，應(yīng)應(yīng)保證濾濾膜在過過濾前后后的完整整性。同同時每片片濾膜的的總過濾濾量不宜宜太大，以以避免濾濾膜上的的微生物物受損傷傷。薄膜過濾濾法采用用封閉式式薄膜過過濾器或或開放式式薄膜過過濾器，可可優(yōu)先選選用封閉閉式薄膜膜過濾器器。如采采用封閉閉式過濾濾器時，將將一次性性集菌培培養(yǎng)器（依依供試品品種類不不同選擇擇適宜的的集菌培培養(yǎng)器如如抗生素素類采用用抗生素素專用集集菌培養(yǎng)養(yǎng)器）放放于電控控集菌儀儀的排液液槽上，培培養(yǎng)器的的塑膠軟軟導(dǎo)管放放于電控控集菌儀儀的蠕動動泵的管管槽內(nèi)，其其進液導(dǎo)導(dǎo)管的雙雙芯針頭頭，插入入供試液液或沖洗洗液等容容器的塞塞上。6.5.5.11 操操作打開待檢檢樣品的的鋁蓋

42、，復(fù)復(fù)溶。吸吸取適量量藥液加加入0.9%無無菌氯化化鈉溶液液或其他他適宜的的溶液至至具塞的的瓶中，混混勻。如如采用封封閉式過過濾器，取取出培養(yǎng)養(yǎng)器先檢檢查包裝裝是否完完好無損損，將培培養(yǎng)器逐逐個插放放在不銹銹鋼座上，將將培養(yǎng)器器的彈性性軟管裝裝入集菌菌儀泵頭頭，注意意定位準準確，軟軟管走勢勢順暢。將培養(yǎng)養(yǎng)器導(dǎo)管管上的針針頭插至至供試液液容器塞塞上，開開動電控控集菌儀儀電源，將將樣品瓶瓶倒置固固定于支支架上，使使藥液均均勻通過過集菌培培養(yǎng)器，待待藥液排排盡，關(guān)關(guān)閉電源源，將針針頭取下下，插至至裝有適適宜沖洗洗液的瓶瓶塞內(nèi)，沖沖洗集菌菌培養(yǎng)器器的濾膜膜，照上上述操作作要求，沖沖洗次數(shù)數(shù)及沖洗洗量與驗驗證試驗驗保持一一致。濾濾干，關(guān)關(guān)閉電源源。將集集菌培養(yǎng)養(yǎng)器的排排氣孔上上膠帽取取下，集集菌培養(yǎng)養(yǎng)器底部部的排液液管口擰擰上，將將沖洗瓶瓶取下?lián)Q換上相應(yīng)應(yīng)的培養(yǎng)養(yǎng)基瓶，啟啟動電源源，將培培養(yǎng)基泵泵入指定定的培養(yǎng)養(yǎng)器內(nèi)，關(guān)關(guān)閉電源源。用小小夾夾閉閉與培養(yǎng)養(yǎng)器連接接部的軟