二胺氧化酶對川味香腸品質(zhì)及生物胺含量的影響

1、PAGE PAGE - 12 -二胺氧化酶對川味香腸品質(zhì)及生物胺含量的影響川味香腸是中國西南地區(qū)知名的傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，因自然發(fā)酵風(fēng)味濃郁、特點(diǎn)突出而深受消費(fèi)者喜愛，消費(fèi)市場和消費(fèi)潛力巨大1。川味香腸高度依賴自然發(fā)酵，在生產(chǎn)過程中極易被微生物污染、易受季節(jié)及氣候等因素影響，使得成品中的生物胺種類多、含量高。生物胺是由氨基酸脫羧酶將肉中游離氨基酸脫羧形成的一類含氮小分子化合物2。生物胺是人體生理代謝所需物質(zhì)，但當(dāng)機(jī)體內(nèi)的生物胺積累到一定量時就會發(fā)生中毒反應(yīng)，甚至危及生命3。目前，降低肉制品中生物胺含量的研究主要集中在將具有生物胺氧化酶活性的微生物作為發(fā)酵劑接種到肉制品中，生物胺氧化酶能將已存在的生

2、物胺分解為相應(yīng)的醛、氨氣和過氧化氫4。根據(jù)底物氨基個數(shù)通?？梢詫⑸锇费趸阜譃閱伟费趸?、二胺氧化酶和多胺氧化酶。單胺氧化酶主要作用于酪胺、苯乙胺5；二胺氧化酶通常作用于組胺、尸胺和腐胺6；多胺氧化酶主要作用于精胺和亞精胺及腐胺7。翟鈺佳8篩選到1株具有較強(qiáng)胺氧化酶活性的植物乳桿菌，將其作為發(fā)酵劑添加到羊肉發(fā)酵香腸中，發(fā)現(xiàn)香腸中生物胺含量顯著降低。然而該種方法可能造成輕發(fā)酵食品發(fā)酵過度的情況9。黃瑤等10通過破碎黑曲霉細(xì)胞得到胺氧化酶的粗酶液，添加到自制醬油和市售醬油中，使市售醬油和自制醬油中總生物胺分別降低了69.5%和78.29%。NAILA等11在金槍魚魚湯中添加二胺氧化酶，發(fā)現(xiàn)組胺含

3、量顯著降低，在10h時幾乎降為0。利用生物胺氧化酶控制生物胺的技術(shù)目前主要應(yīng)用于醬油和水產(chǎn)品中，在肉制品中的應(yīng)用尚未見報道，并且在復(fù)雜的食品基質(zhì)中添加生物胺氧化酶是否會對食品品質(zhì)造成影響還有待探究。本研究基于生物胺氧化酶不具有底物特異性的特點(diǎn)12，將二胺氧化酶預(yù)添加到川味香腸中，探究該酶在川味香腸發(fā)酵、成熟過程中對感官品質(zhì)以及對生物胺含量的影響，為實(shí)際生產(chǎn)中通過外源添加生物胺氧化酶的方式來控制發(fā)酵肉制品中生物胺的含量提供依據(jù)和理論參考。1材料與方法1.1材料與試劑新鮮豬肉、腸衣、食鹽、花椒、白酒等調(diào)料，四川雅安市雨城區(qū)蒼坪山農(nóng)貿(mào)市場；二胺氧化酶(提取自豬肝臟)，美國SigmaAldrich公司

4、；MRS培養(yǎng)基等培養(yǎng)基，青島日水生物技術(shù)有限公司；組胺、酪胺、腐胺、尸胺標(biāo)準(zhǔn)品、丹磺酰氯等，美國Sigma公司。1.2儀器與設(shè)備PHS-3CpH計(jì)，杭州奧立龍儀器有限公司；LC-2022CHT高效液相色譜儀，美國ThermoFisherScientific公司；BMS602均質(zhì)機(jī)，德國BRT公司；(ANGGUANG)SC-8全自動色差計(jì)，北京康光儀器有限公司。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1川味香腸的制作與樣品采集參照張雪梅13的配方，孫霞14的工藝流程、參數(shù)制作香腸。具體參數(shù)如下：(1)配方：豬肉m(肥肉)m(瘦肉)=37，食鹽2.8%，白砂糖1%，白酒1.5%，辣椒粉1%，花椒粉0.5%，胡椒粉0

5、.05%，五香粉0.1%，硝酸鹽0.015%，亞硝酸鹽0.0075%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，50mg/kg二胺氧化酶。(2)工藝流程：原料肉預(yù)處理添加配料加酶攪拌灌腸發(fā)酵成熟包裝成品。(3)工藝參數(shù)：發(fā)酵溫度20，相對濕度85%，時間2d；成熟溫度13，成熟相對濕度75%，成熟時間28d。實(shí)驗(yàn)取樣：取香腸加工過程中的7個工藝點(diǎn)，即0d(原料肉)、2d(發(fā)酵結(jié)束)、5d(成熟第3天)、9d(成熟第7天)、16d(成熟第14天)、23d(成熟第21天)、30d(成熟結(jié)束)進(jìn)行采樣。1.3.2感官品質(zhì)1.3.2.1感官評價選擇具有一定感官評定經(jīng)驗(yàn)的10位品評員，從外觀、組織形態(tài)、風(fēng)味3個方面進(jìn)行評價，具體

6、感官評價標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。表1感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table1Thetableforsensoryevaluationstandard1.3.2.2香氣和滋味的電子鼻、電子舌檢測電子鼻參照周蘭15的方法；電子舌參照張楠16的方法。1.3.2.3顏色檢測每組準(zhǔn)備14個重復(fù)樣品，將樣品切割成1cm3，測定樣品的L值，a*值、b*值。1.3.2.4質(zhì)構(gòu)檢測參照張楠16的方法。1.3.3生物胺檢測1.3.3.1取樣參照張楠16的方法。1.3.3.2柱前衍生參考HUANG等17的方法，對樣品中組胺、酪胺、尸胺、腐胺進(jìn)行柱前衍生。1.3.3.3色譜條件參考HUANG等17的方法略作修改。色譜柱為C18(4.6mm2

7、50mm，5m)，流速為0.8mL/min，紫外檢測器波長為254nm，進(jìn)樣量10L，柱溫30，流動相A為超純水，流動相B為色譜級乙腈，采用梯度洗脫程序進(jìn)行分離：0min，35%A+65%B；5min，30%A+70%B；20min，0%A+100%B；25min35%A+65%B，持續(xù)至30min結(jié)束。1.3.4數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測量3次，所有數(shù)據(jù)均以平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS27.0，作圖采用軟件Origin2022進(jìn)行。2結(jié)果與分析2.1感官品質(zhì)測定結(jié)果2.1.1感官分析結(jié)果以外源添加50mg/kg二胺氧化酶的川味香腸為實(shí)驗(yàn)組，相同條件下未添加二胺氧化酶的為對照組，感官評價

8、結(jié)果如表2所示。2組香腸在外觀、組織形態(tài)、風(fēng)味及總分方面無顯著差異。表明添加二胺氧化酶對川味香腸的感官品質(zhì)并無影響，這可能是因?yàn)?組香腸采用了同樣的原料及加工工藝。表2感官評分表單位：分Table2Resultsofsensoryevaluation注：相同小寫字母表示差異不顯著2.1.2香氣和滋味的電子鼻及電子舌分析結(jié)果電子鼻的反應(yīng)過程是模擬人體嗅覺形成的過程，而后通過主成分分析將信息進(jìn)行降維處理。主成分分析貢獻(xiàn)率越大，越能反應(yīng)更多的指標(biāo)18。從圖1-a可以看出，第1主成分(PC1)與第2主成分(PC2)貢獻(xiàn)率之和為99.9889%，大于90%，說明這2種主成分能較好的反應(yīng)原始數(shù)據(jù)的全部信息

9、。2組香腸在主成分分析圖上有部分重合，加酶組的覆蓋面積相對較大，說明二胺氧化酶能夠在一定程度上增加川味香腸的風(fēng)味。但2組香腸在電子鼻雷達(dá)圖中形成的圖形形狀差異不大(圖1-c)，可能是因?yàn)槭褂孟嗤呐浞胶图庸すに?。與其他4根傳感器相比，2組樣品主要在P30/1及T30/1傳感器上有較明顯的響應(yīng)，其中傳感器P30/1響應(yīng)最為顯著，說明其中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要是有機(jī)化合物、極性化合物等19。電子舌是模擬人體味覺系統(tǒng)，并能識別出5種基本味道酸、甜、苦、咸、鮮，可以客觀體現(xiàn)食品滋味20。由圖1-b可以看出，PC1與PC2之和為99.7961%，2組川味香腸滋味較為類似，加酶組所占面積比對照組稍大，說明滋味

10、更加豐富。由電子舌雷達(dá)圖1-d可以看出，2組川味香腸在各個傳感器的響應(yīng)值差距不大，反映出添加二胺氧化酶對香腸的滋味無顯著性影響，呈味物質(zhì)的組成和含量較為類似，這與感官結(jié)果相似。JE、JB、HA、CA、BB探頭響應(yīng)都較高，說明樣品在酸味、鮮味、咸味方面較為突出，而在苦味上不顯著21。a-電子鼻主成分分析圖；b-電子舌主成分分析圖；c-電子鼻雷達(dá)圖；d-電子舌雷達(dá)圖圖1不同組川味香腸滋味及香氣電子鼻及電子舌分析Fig.1AnalysisofthetasteandaromaofdifferentgroupsofSichuansausagesbyelectronicnoseandelectronict

11、ongue2.1.3質(zhì)構(gòu)檢測結(jié)果質(zhì)構(gòu)會直接影響產(chǎn)品的感官，受水分含量、離子強(qiáng)度等多因素影響16。由表3可知，加酶組在硬度、彈性、黏結(jié)性、黏性、咀嚼性及回復(fù)性方面與對照組相比均沒有顯著性差異，這說明加酶不會對川味香腸質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。2.1.4色差測定結(jié)果2組香腸的色差檢測結(jié)果如表4所示。與對照組相比，香腸成熟結(jié)束時加酶組的色差僅在a*值上有顯著性差異。加酶組a*值隨著發(fā)酵和成熟的進(jìn)行，呈現(xiàn)先下降后上升，最后降低的趨勢?？赡苁且?yàn)榘l(fā)酵過程中原料肉被空氣中的氧氣氧化，顏色變深，隨后亞硝酸鹽、硝酸鹽被原料肉中微生物利用，進(jìn)行了發(fā)色作用，顏色部分恢復(fù)，但隨著產(chǎn)品中水分含量降低，色素濃縮，顏色再次加深，

12、a*值隨之下降，與等22研究結(jié)果一致。隨著香腸的成熟，加酶組的L值在發(fā)酵和成熟前期相較于原料肉無顯著變化(P0.05)，僅在成熟末期有顯著性上升(P0.05)，b*值變化趨勢幾乎一致且無顯著性差異。表3兩組川味香腸質(zhì)構(gòu)特性Table3TexturalcharacteristicsoftwogroupsofSichuansausage注：不同大寫字母表示同行之間差異顯著(下同)2.2川味香腸加工過程中生物胺含量的變化2.2.1川味香腸加工過程中總生物胺含量的變化情況川味香腸發(fā)酵、成熟過程中總生物胺含量變化情況如表5所示。隨著香腸加工時間的推進(jìn)，2組樣品的總生物胺含量不斷升高，表明加酶并不能完全抑

13、制生物胺的積累。與對照組相比，加酶組香腸中總胺含量增長較為緩慢，加酶組總生物胺含量顯著低于對照組，表明添加二胺氧化酶能有效降低生物胺含量及其增長速率。表4川味香腸在加工過程中色差的變化Table4ColordifferenceofSichuan-stylesausagesduringfermentationandripening注：不同小寫字母表示同列之間差異顯著(下同)表5川味香腸發(fā)酵、成熟過程中總生物胺的變化Table5ChangesinthetotalamountofbiogenicaminesduringtheprocessingofSichuansausage2.2.2川味香腸加工過

14、程中組胺含量的變化情況組胺在常見生物胺中毒性最強(qiáng)，過量攝入組胺會引起機(jī)體過敏反應(yīng)，甚至休克，美國食品及藥物管理局(FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA)對水產(chǎn)品中組胺限定為50mg/kg。由圖2可知，川味香腸中的組胺含量變化與總生物胺的趨勢一致，對照組中組胺含量剛開始增加較為緩慢，從第9天開始快速增長，這可能是因?yàn)槌墒鞙囟?、濕度適宜產(chǎn)組氨酸脫羧酶微生物的生長，利用原料肉中蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的豐富游離組氨酸生成組胺。加酶組中的組胺含量在第30天時增加明顯，達(dá)到61.79mg/kg，略高于FDA限量標(biāo)準(zhǔn)。與張楠16接菌生產(chǎn)的川味香腸成熟結(jié)束時組胺降解率(30.26%)相比，二胺氧

15、化酶(54.47%)控制組胺效果更顯著。圖2兩組川味香腸發(fā)酵、成熟過程中組胺含量的變化Fig.2ChangesinhistaminecontentduringtheprocessingofSichuansausages2.2.3川味香腸加工過程中酪胺含量的變化情況酪胺屬于單胺，和組胺一樣是毒性最強(qiáng)的生物胺之一，口服超過100mg就會出現(xiàn)中毒現(xiàn)象23。由圖3可以看出，2組川味香腸在加工過程中酪胺含量不斷升高，但均未超過100mg/kg，對照組在成熟結(jié)束時達(dá)到83.4mg/kg。加酶組在整個加工過程中酪胺含量明顯低于對照組，這說明二胺氧化酶能在一定程度上控制酪胺的含量。加酶組在第2天時酪胺含量增長

16、較為顯著，可能是原料肉中含有豐富的游離酪氨酸、酪胺酸脫羧酶，在適宜條件下產(chǎn)生的；在成熟后期的第2330天，酪胺增長可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)進(jìn)一步降解氧化，產(chǎn)生大量酪氨酸所導(dǎo)致，這與孫霞14未加菌發(fā)酵川味香腸檢測結(jié)果一致。對比組胺降解情況可以看出二胺氧化酶對于酪胺的控制效果不如組胺強(qiáng)，可能是酪胺是單胺，主要是由單胺氧化酶降解，而二胺氧化酶雖然也能降解，但效果不強(qiáng)。與孫霞等24混菌發(fā)酵生產(chǎn)的香腸(38.17%)相比，二胺氧化酶對酪胺的降解率(52.86%)更高。圖3兩組川味香腸發(fā)酵、成熟過程中酪胺含量的變化Fig.3Changesintyraminecontentduringtheprocessingof

17、Sichuansausages2.2.4川味香腸加工過程中腐胺含量的變化情況腐胺是一種二胺，過量的腐胺會產(chǎn)生不良?xì)馕?，并抑制人體對組胺的分解，加強(qiáng)組胺的毒性25。由圖4可以看出2組川味香腸在整個加工過程中腐胺含量呈上升趨勢。從第5天開始明顯增長，這可能是因?yàn)殡S著加工的進(jìn)行，香腸的pH值逐漸降低，肉中產(chǎn)胺微生物為了抵御外界酸環(huán)境開始產(chǎn)生大量生物胺，同時pH值的降低也影響了二胺氧化酶的活性，因而對腐胺的降解速度不及其產(chǎn)生的速度，導(dǎo)致腐胺的積累；在成熟終點(diǎn)加酶組中腐胺含量低于對照組，降解率為6.29%，表明添加二胺氧化酶能降低川味香腸中腐胺含量。圖4兩組川味香腸發(fā)酵、成熟過程中腐胺含量的變化Fig.

18、4ChangesinputrescinecontentduringtheprocessingofSichuansausages2.2.5川味香腸加工過程中尸胺含量的變化情況尸胺也是一種二胺，雖然本身毒性不強(qiáng)，但其能與亞硝酸鹽形成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺，還能在一定程度上增強(qiáng)組胺毒性。由圖5可以看出加酶組的尸胺含量隨著加工的進(jìn)行始終低于對照組，這說明二胺氧化酶對尸胺有較好的控制作用。在加工前5d，加酶組尸胺含量增加不顯著，一方面可能是原料肉品質(zhì)較好，尸胺的前體物質(zhì)游離賴氨酸較少，所產(chǎn)生的尸胺也較少；另一方面，添加的二胺氧化酶能夠分解一部分已生成的尸胺。從第9天起至成熟結(jié)束，加酶組尸胺含量出現(xiàn)了顯著性的增長，達(dá)到46.07mg/kg。這可能與香腸成熟中后期環(huán)境變化所導(dǎo)致的二胺氧化酶活性降低有關(guān)。在成熟結(jié)束時，二胺氧化酶對尸胺降解率達(dá)到了43.69%，略低于組胺和酪胺。圖5