梁nsclc分子病理診斷重要性及新的進(jìn)展

1、NSCLC分子病理及新的進(jìn)展重要性梁學(xué)附屬第一醫(yī)院2017.04.21廣州醫(yī)目錄CONTENTS12分子病理現(xiàn)狀及進(jìn)展NSCLC分子病理重要性肺癌分子分型的發(fā)展凸顯分子學(xué)重要性1987年以前Other 22%34%KRAS 8%EGFR52%55%HER22% BRAF2%RET1% MET 14 SKIP3%MET5%11%EGFRKRAS未知ALK 7%ROS11%經(jīng)驅(qū)動(dòng)篩選分類的突變顯微組織分型Navada S.et al. 2016 ASCO Abstract 7082Cross DA. et al. Cancer Discov 2014:4:1046-1061 Savas P. et

2、 al.J Thorac Dis 2013:5(S5):S579-S59275%非鱗狀25%鱗狀85%15%非小細(xì)胞肺癌小細(xì)胞肺癌1987-20042012以后87%患者有明確驅(qū)動(dòng)變異，66%可獲得靶向治療87%患者已有可知驅(qū)動(dòng)81%驅(qū)動(dòng)已有明確的靶向抑制劑66%患者可接受已上市藥物的化靶向治療肺分子分型已成為臨床治療決策前的必要步驟Seo JS, et al. Genome Res 2012; 22:2109-2119.國(guó)內(nèi)外靶向治療藥物層出不窮泰瑞沙驅(qū)動(dòng)對(duì)于EGFR陽(yáng)性肺癌患者接受靶向治療顯著獲益緩解率突變陽(yáng)性患者IPASS-SIGNAL WJTOG 3405 NEJGSG002 OPTI

3、MALEURTAC71.2% vs 47.3%84.6% vs 37.5%62.1% vs 32.2%73.7% vs 30.7%83% vs 36%58% vs 15%61% vs 22%67% vs 23%9.8 vs 6.4 月8.4 vs 6.7 月9.6 vs 6.6月10.8 vs 5.4 月13.1 vs 4.6 月9.7 vs 5.2 月11.1 vs 6.9 月11.0 vs5.6 月無(wú)進(jìn)展生存LUX-LUX-G 3G 6對(duì)于EGFR突變陽(yáng)性患者，TKI在緩解率及PFS上顯著優(yōu)于化療Mok et al NEJM 2009, Lee et al WCLC 2009, Mitsu

4、domi et al Lancet Oncology 2010, Maemondo NEJM 2010, Zhou et al ESMO 2010, Rosell Lancet Oncol 2012,JC et al ASCO 2012, Wu YL et al ASCO 2013TKI化療TKI化療研究RR中位PFS分子分型與靶向治療為患者帶來(lái)生存獲益HER2EGFR mutantsALKROS/RET b-rafK-rasK-rasKris MG ,et al. JAMA. 2014 May 21;311(19):1998-2006.具有驅(qū)動(dòng)突變的患者接受靶向治療，其生存期較未接受靶向治療

5、的患者更長(zhǎng)（3.5年 vs. 2.4年）。各大指南NSCLC需進(jìn)行分子病理1. S. Novello et al. Ancol2016;27:v1-v272.3.2017. V1,等.中國(guó)性肺癌診療規(guī)范.中國(guó)肺癌雜志.2016;19(1):1-15.中國(guó)性肺癌診療規(guī)范：晚期NSCLC、或含成分其他肺癌，應(yīng)常規(guī)進(jìn)行EGFR、ALK檢測(cè)。 必要可機(jī)型ROS1、 RET、Kras、BrafV600E、Her2擴(kuò)增及Met檢測(cè)ESMO 2016指南：需進(jìn)行EGFR、ALK指南2017 V5：NSCLC進(jìn)行EGFR、ALK、ROS1及PD-1檢測(cè)目錄CONTENTS2分子病理現(xiàn)狀及進(jìn)展肺癌病理方法學(xué)的變

6、遷高通量分子NGSMicroarray經(jīng)典分子FISH PCRSanger sequencing組織病理H&EIHC細(xì)胞學(xué)液態(tài)活檢NGS DdPCR CTCARMS-PCR點(diǎn)多位點(diǎn)高通量手動(dòng)半自動(dòng)全自動(dòng)組織細(xì)胞血漿目前臨床組織分子病理檢測(cè)技術(shù)及其作用EGFR、KRAS等的點(diǎn)突變、缺失SangerARMS-PCREGFR、KRAS等的點(diǎn)突變、缺失檢測(cè)ALK、ROS1、RET融合，Met擴(kuò)增分子病理IHC檢測(cè)ALK、ROS1、RET融合，Met擴(kuò)增FISH多多種變異形式平行檢測(cè)NGSARMS法EGFR、KRASARMS法無(wú)法檢測(cè)未知變異！特異性PCR + 熒光探針= ARMS方法等位通過(guò)等位達(dá)到對(duì)

7、特異擴(kuò)增選擇性擴(kuò)增目標(biāo)序列，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)是否存在突變；以突變檢測(cè)的高特異性和高靈敏度。突變正向引物產(chǎn)生熒光信號(hào)延伸A突變DNA模板反向引物突變正向引物無(wú)延伸G野生DNA模板反向引物12Newton CR. et alysis of any pomuion in DNA. Thelificationrefractory muion system (ARMS). Nucleic Acids Research 17(7):2503-16, 1989FISH法ALK、ROS1融合，Met擴(kuò)增FISH免疫熒光雜交法，檢測(cè)ALK融合的金標(biāo)準(zhǔn)直接/間接標(biāo)記了熒光的單鏈DNA(探針) 與其互補(bǔ)的目標(biāo)

8、樣本DNA(玻片上的標(biāo)本)退火雜交或DNA序列的情況。，通過(guò)觀察熒光信號(hào)在上的位置反映相應(yīng)陽(yáng)性目前，F(xiàn)ISH是一種用于檢測(cè)擴(kuò)增和融合的非常有效的常規(guī)檢測(cè)方法，但FISH依賴人工斷裂檢測(cè)探針（檢測(cè)融合）Eg：ALK, ROS1,RET判斷，性強(qiáng)！拷貝數(shù)檢測(cè)探針（檢測(cè)擴(kuò)增）Eg: MET、HER2IHC法ALK、ROS1融合、Met擴(kuò)增IHC免疫組織化學(xué)法，對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行分型、定位、定性及定量的檢測(cè)。通過(guò)融合蛋白檢測(cè)融合

9、：ALK, ROS1,RET全自動(dòng)Ventana IHC原理：在常規(guī)IHC之后加入擴(kuò)增信號(hào)，并且通過(guò)充分洗滌一抗避免假陽(yáng)性全自動(dòng)VentanaIHC：信號(hào)擴(kuò)增常規(guī)IHC：無(wú)信號(hào)擴(kuò)增15Ventana ALK (D5F3)的 CFDA臨床實(shí)驗(yàn)三家公立醫(yī)院超過(guò)1100例NSCLC樣本進(jìn)行Ventana ALK(D5F3)與FISHALK結(jié)果的對(duì)比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)ALK(D5F3)與FISH ALK的一致性為99.23%結(jié)果表明Ventana16VentanaIHC和FISH的對(duì)比全自動(dòng)Ventana IHC優(yōu)勢(shì)判讀標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，僅存在or 陽(yáng)性的判讀IHC 陽(yáng)性 = FISH 陽(yáng)性全自動(dòng)檢測(cè)，避免操作流程中的

10、誤差，可重復(fù)性好價(jià)格便宜，可同時(shí)用于ALK的篩選和Minca EC, et al. J Mol Diagn. 2013;15(3):341-6.17PD-L1表達(dá)檢測(cè)（IHC，腫瘤細(xì)胞+免疫細(xì)胞）18cMET異常MET靶點(diǎn)相對(duì)比較復(fù)雜，有多種異常形式Methods of direct MET activationProteinoverexpres Jeeyun Lee, MD Samsung Medical Centeral communicationStransky et alNat Commun 2014 Sep 10;5:4846Ou et al,J Thorac Oncol 2011;

11、 6: 942-6Stein et al,Eur Urology 2015; 67: 353-4RearrangementPomuionlification標(biāo)本量少、腫瘤異質(zhì)性成為傳統(tǒng)檢測(cè)方法最大瓶頸纖支鏡活檢標(biāo)本腫瘤時(shí)間、空間異質(zhì)性二代法(NGS)實(shí)現(xiàn)多多變異形式同時(shí)檢測(cè)變異形式分子方法指南8外顯子的重復(fù)、缺點(diǎn)突變短小片段和缺失失及拷貝數(shù)變?nèi)诤匣疉RMS-PCR(血液標(biāo)本)EGFR突變ARMS-PCR（組織標(biāo)本）EGFR突變，ALK融合FISH、IHCALK融合，MET擴(kuò)增NGSEGFR,ALK,ROSE1， MET,BRAF,RET,HER2， KARS二代法(NGS)原理及流程組片段化內(nèi)

12、的腫瘤1. DNA建庫(kù)METEGFRALK富集感的/區(qū)域3. 數(shù)據(jù)分析2. 二代二代（NGS）多平序；檢測(cè)準(zhǔn)確、靈敏；NGS檢測(cè)可以使患者從靶向治療中獲益基于靶向捕獲的NGS相比傳統(tǒng)EGFRALKROS1檢測(cè)增加10%-15%陽(yáng)性率，為提供靶向治療機(jī)會(huì)?；颊逧GFR+ALK+ROS1=60%Other22%8各變異形式=78%KRAS8%EGFR52%HER22%BRAF2% RET1%ALK7%MET 14 SKIP3%MET6%ROS11%常見驅(qū)動(dòng)的罕見亞型：ALK的非EML4融合；EGFR exon 19的全部亞型；EGFR 18del、19ins等罕見突變會(huì)對(duì)1代，2代TKI敏感，但是

13、ARMS不包括； EGFR L747P點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致TKI耐藥，而 ARMS檢測(cè)會(huì)當(dāng)19 DEL；NGS是Met-14 Skip檢測(cè)的唯一方法MET ex14 skip變異類型極其復(fù)雜目前只有NGS法可以檢測(cè)MET ex14是目前只指南明確的突變位點(diǎn)，在西方人群肺中占比約3%，韓國(guó)1.7%，中國(guó)尚無(wú)數(shù)據(jù)。MET ex14 skip對(duì)克唑替尼敏感Garrett M. Fton et al. Cancer Discov. 2015基于捕獲的NGS能夠檢出FISH不能檢出的ALK融合NGS-based multiplex genotyof NSCLCTypeGeneExon 18Mut site G7

14、19S20S768I2021790L861QEGFR2112L858R G12A1212G12D G12VSNV18 sitesKRAS1312G13DG12C12G12R12G12S BRAF15V600E20H1047R9E545KPIK3CA209H1047L E542K9E545DTypeGeneExonFu13ALK與5個(gè)ROS1與8個(gè)TypeGeneExonMut siteInDelEGFR221919種缺失203種NGS大Panel檢測(cè)反映TMBASCO 2016#9017NSCLC中TMB至少12/Mb，患者對(duì)抗PD-1/PD-L1療效較好，15/Mb患者療效更優(yōu)AACR回顧性

15、探索腫瘤突變負(fù)荷（TMB）對(duì)于NIVO對(duì)比化療一線NSCLC的療效相關(guān)性高TMB組PIVO 9.7個(gè)月對(duì)比化療5.8個(gè)月，HR：0.62。高TMB組ORR，NIVO 47%對(duì)比化療28%；研究發(fā)現(xiàn)PD-L150%且高TMB，ORR達(dá)到了75%。同時(shí)這部分的PFS非常好，不過(guò)樣本量?jī)H16例；AACR 2017. Impact of Tumor MuLineNiv in Stage IV or Recurrention Burde-Small Cellthe Efficacy ofg Cancer: An-Exploratoryysis of CheckMate 026無(wú)法組織活檢患者：液體活檢是

16、必要補(bǔ)充約1/3晚期NSCLC患者無(wú)法獲得用于檢測(cè)的組織樣本組織異質(zhì)性，活檢樣本無(wú)法反映腫瘤突變的全貌時(shí)空異質(zhì)性，無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)患者的病情樣本選擇：血液？尿液？血液ctDNA是首選的實(shí)時(shí)樣本！腫瘤液態(tài)活檢簡(jiǎn)介CTC（循環(huán)腫瘤細(xì)胞）ctDNA（循環(huán)腫瘤DNA）Exosome（外泌體）液態(tài)活檢臨床應(yīng)用早期檢測(cè)（如CTC）體液，可以檢測(cè)CTC，ctDNA等，但其液態(tài)活檢表明其樣本來(lái)源于方法可以包括：NGS, ddPCR, ARMS-PCR等高靈敏度的分子方法用藥應(yīng)答檢測(cè)（療效）治療決策Haber D. et al. Cancer Discov. 2014Diaz Jr et . Journal of

17、Clinical Oncology. 2014.液體活檢在重檢中的優(yōu)勢(shì)無(wú)創(chuàng)、敏感度高2016 ASCO Abstract 9001ARMS法液體活檢敏感性Zhijunt al. Targ Oncol. 2014Ying Wu et al.g Cancer. 2014Kenneth S. Thress, et al.g Cancer. 2015AURA研究結(jié)果提示：COBAS和BEAMing對(duì)T790M，同樣存在敏感性和特異性而一線TKI治療進(jìn)展后的患者，有50%以上存在T790M突變的特點(diǎn)；多項(xiàng)meta 分析提示， ARMS- PCR 等傳統(tǒng)方法液體活檢敏感性普遍在60-70%之間Digita

18、l PCR(數(shù)字PCR)超靈敏精確定量方法，但單點(diǎn)dPCR基于單分子模板PCR擴(kuò)增，進(jìn)行核算拷貝數(shù)精確定量的分析方法，萬(wàn)分之一檢測(cè)下限；整體原理：“分而治之”（divide and conquer）RainDanceFluidigmLife-TechnologyBio-RadDilutionDistributionlificationficationNGS液體活檢敏感性高，平行檢測(cè)Karen L. et al. J.Thorac.Oncol.2016NGS液體活檢陽(yáng)性與組織活檢陽(yáng)性患者ORR、PFS相似2016 ASCO Abstract 9001NGS液體活檢證實(shí)揭示一代EGFR TKI復(fù)雜

19、耐藥機(jī)制Rociletinib治療前ctDNA結(jié)果(n=41)46% with 1 (T790M)mechanismsafter 1st line EGFR-TKINat Commun. 2016 Jun 10;7:11815.Onco. 2016 Jun 9.NGS可發(fā)現(xiàn)已知和未知的耐藥突變-C797S，L798IL798IC798SNat Commun. 2016 Jun 10;7:11815.L798I于體外和體內(nèi)研究都是首次發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制 由Capp-seqNGS檢測(cè)ctDNA發(fā)現(xiàn)對(duì)二代及三代EGFR TKI不敏感Nat Med. 2015 Jun;21(6):560-2.2016WC

20、LC: 利用NGS檢測(cè)ctDNA揭示腫瘤異質(zhì)性Identifying Genomic Alteration ander-Tumor Heterogeneity of MultiplePrimaryg Cancers byed NGS of Tumor Tie and ctDNAPresenor: Kezhong Chen MDDepartment of Thoracic Surgery Peking University Peoples Hospital, Beijing, ChinaFigure 3. Comparison of gene alterationsbetn tie DNA an

21、d plasma ctDNAPresenion Number: MA17.03Kezhong Chen在早期肺癌中檢測(cè)ctDNA更大CAPP-Seq在I期肺癌性約為50%，IIIV期，ctDNA檢出組異常對(duì)比組織檢出，敏感依次升高，最高達(dá)100%。TP, trueFP, falseitiveitiveTN, true negativeFN, false negativeSn, sensitivitySp, specificityAaron M, et al. Nat Med. 2014結(jié)合UMI技術(shù)的NGS血檢早期肺癌探索UMI：基于分子的ctDNA液體活檢1. 對(duì)于二代，UMI是一段或多段短序列，通過(guò)建庫(kù)導(dǎo)入，在中讀出2.對(duì)ctDNA使用UMI，可以：a，精確定量起始分子數(shù)（定量）b，消減及文庫(kù)時(shí)產(chǎn)生的錯(cuò)誤 （降噪1）c，消減PCR擴(kuò)增所造成的不均一性 (降噪2)S. R. Kennedy, et al. Nature Protocol.2014基于外泌體RNA的ALK融合突變檢測(cè)Exosome Diagnostics研制探索IASLC: Thee