STAT3蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其泛素化功能研究

1、 STAT3蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其泛素化功能研究 李夏瑩+張秀杰+宋貴文Summary：為研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的活性調(diào)控機(jī)制，克隆人源STAT3基因，并將其構(gòu)建在真核表達(dá)載體上。之后，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)STAT3和泛素化質(zhì)粒的方法，驗(yàn)證了STAT3蛋白可以發(fā)生多種類型的泛素化修飾。結(jié)果表明，K63位非降解功能的泛素化影響STAT3蛋白的磷酸化，從而影響STAT3的活性及功能的發(fā)揮；而K48位降解功能的泛素化影響STAT3蛋白的降解，使STAT3蛋白得以更新，這2種類型的泛素化對(duì)STAT3蛋白及其功能都十分重要。Key：STAT3蛋白；表達(dá)載體；泛素化；K63；K48：

2、Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A：1002-1302（2017）11-0016-03化5。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族（STAT）已發(fā)現(xiàn)7個(gè)成員，STAT3是該家族的研究熱點(diǎn)，且敲除該基因可以使胚胎死亡，說(shuō)明該基因是不可或缺的。磷酸化修飾是調(diào)控STAT3活性的主要方式，Tyr705、Ser727是磷酸化的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)6。此外，STAT3的Lys685可以在組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的修飾下發(fā)生可逆乙酰化7-8。在真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)的泛素化和磷酸化是最常見(jiàn)的翻譯后修飾。細(xì)胞外信號(hào)嚴(yán)格調(diào)控著蛋白的泛素化，在很多情況下，這種調(diào)控依賴于蛋白質(zhì)的磷酸化9。磷酸化通過(guò)修飾泛素化的底物，或者修飾泛素化機(jī)器的某個(gè)組分來(lái)影響泛素化

3、。此外，泛素化對(duì)于磷酸化和信號(hào)分子的傳遞也有一定的作用。本研究通過(guò)研究STAT3蛋白是否會(huì)發(fā)生泛素化，發(fā)生哪種類型的泛素化，并以此解釋泛素化與STAT3活性之間的關(guān)系。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料Taq DNA polymerase，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶、pMD-19-T simple Vector、DNA酶、Oligo（dT）18、Random promers、PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）Kit，購(gòu)自TaKaRa公司；dNTPs，購(gòu)自北京盛旭百川生物科技有限公司；

4、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；蛋白質(zhì)非預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)marker及預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)marker，購(gòu)自Fermentas公司；Tween-20，購(gòu)自Amresco公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、EASYspin plus RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒、Enhanced chemiluminescence（ECL）kit，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA凝膠回收純化試劑盒，購(gòu)自Zymo公司；無(wú)內(nèi)毒素大量質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；Anti-c-HA單克隆抗體、protein A/G plus-agarose（S

5、C-2003），購(gòu)自Santa Cruz生物公司；Anti-FLAG M2（F1804）單克隆抗體、PI染料，購(gòu)自Sigma公司；HRP-標(biāo)記山羊抗小鼠和山羊抗兔抗體，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)自Invitrogen公司；蛋白酶抑制劑，購(gòu)自亞太恒信生物科技（北京）有限公司；Sal 和Hind 酶，購(gòu)自NEB公司；HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K63等載體質(zhì)粒均由唐軍教授饋贈(zèng)；所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2Human STAT3基因的克隆根據(jù)NCBI STAT3（ID：47080104）基因序列設(shè)計(jì)引物，

6、上游引物為5-ATGGCCCAATGGAATCAGC-3，下游引物為5-TCACATGGGGGAGGTAGCGC-3。建立50 L PCR反應(yīng)體系：5 L 10PCR Buffer，2 L 10 mmol/L dNTPs，20 pmol/L 上下游引物各1 L，4 L cDNA，1 L Taq plus DNA polymerase，用ddH2O補(bǔ)至50 L。按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)：94 變性30 s，60 退火45 s，72 延伸2.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 延伸10 min，4 保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，目的基因大小為 2 313 b

7、p。1.3宿主細(xì)胞蛋白STAT3重組質(zhì)粒的構(gòu)建針對(duì)pRK5-flag質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物并引入Sal和Hind酶切位點(diǎn)，以測(cè)序正確的pMD-19-T-STAT3質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR；1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行Sal和Hind雙酶切，同時(shí)對(duì)pRK5-flag質(zhì)粒進(jìn)行 Sal 和Hind雙酶切，1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物；將PCR酶切產(chǎn)物和pRK5-flag酶切產(chǎn)物按6 1摩爾比混合，并加入等量的（5 L）Solution I（酶溶液），過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5；挑取單克隆，提取質(zhì)粒酶切鑒定正確后，由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確克隆保存

8、菌種，并提取質(zhì)粒待用。pRK5-flag-STAT3：上下游引物分別引入Sal和Hind酶切位點(diǎn)，上游引物為5-ACGCGTCGACATGGCCCAATGGAATCAGCTAC-3，下游引物為5-CCCAAGCTTTCACATGGGGGAGGTAGCGCAC-3。1.4STAT3泛素化的檢測(cè)6孔板分別按下述方式轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，其中pRK5-flag空載體組作為陰性對(duì)照：（1）pRK5-flag+HA-ub；（2）pRK5-flag-STAT3+HA-ub；（3）pRK5-flag+HA-KO；（4）pRK5-flag-STAT3+HA-K48；（5）pRK5-flag-STAT3+HA

9、-K63。 細(xì)胞內(nèi)泛素化：（1）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后20 h（即收獲細(xì)胞蛋白前4 h），加入20 mol/L MG132抑制蛋白酶體的降解作用。（2）收獲細(xì)胞蛋白。用冰預(yù)冷的1PBS輕輕漂洗細(xì)胞2次。（3）配制裂解工作液。1 mL Lysis buffer中加入10 mol/L二硫蘇糖醇溶液，1cocktail C蛋白酶抑制，10 mmol/L N-乙基順丁烯二酰亞胺和終濃度為1%的十二烷基硫酸鈉溶液（SDS）。（4）6孔板每個(gè)孔中加入80 L現(xiàn)用現(xiàn)配的裂解工作液，將細(xì)胞刮下轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中。（5）將離心管放入 95 金屬浴中，滅活10 min。（6）超聲波（功率10%）破碎細(xì)胞沉淀1 mi

10、n。（7）每管加入720 L不含（SDS）的裂解工作液，4 、12 000 r/min離心20 min。（8）取出50 L離心上清液作為Input，其余上清液加入到含有偶聯(lián)Flag抗體的beads離心管中，4 旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。（9）過(guò)夜孵育之后，用 1Lysis buffer洗滌beads 3次（4 、3 000 r/min、3 min）。（10）加入20 L 2SDS蛋白上樣緩沖液，于100 煮 10 min，立即進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。2結(jié)果與分析2.1人源STAT3基因的克隆為獲取人源基因STAT3，使用Trizol法提取HEK293T細(xì)胞的總RNA，以其為模板利用RT-PCR擴(kuò)

11、增STAT3基因。擴(kuò)增得到片段大小約為2 310 bp，如圖1所示。隨后將2種PCR產(chǎn)物分別與pMD-19-T載體連接，并將轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，構(gòu)建并保存在pMD-19-T載體中的STAT3基因與NCBI上登陸的參考序列在氨基酸水平上完全相同，可用于后續(xù)試驗(yàn)中。2.2STAT3基因重組載體的構(gòu)建根據(jù)試驗(yàn)需要，將STAT3基因分別插入相應(yīng)的表達(dá)載體內(nèi)，經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序比對(duì)正確后作質(zhì)粒大量提取，用于后續(xù)的試驗(yàn)。依據(jù)試驗(yàn)需求構(gòu)建重組載體pRK5-flag-STAT3，重組載體的酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。2.3pRK5-flag-STAT3質(zhì)粒的驗(yàn)證表達(dá)將pRK5-flag-S

12、TAT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收獲細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證。如圖3所示，pRK5-flag-STAT3在細(xì)胞中表達(dá)良好，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。2.4STAT3蛋白可以發(fā)生泛素化為驗(yàn)證STAT3蛋白能否發(fā)生泛素化修飾，將構(gòu)建的pRK5-flag-STAT3真核表達(dá)載體以及pRK5-flag與 HA-ub 一起轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，為保證能有效捕捉蛋白泛素化修飾，在轉(zhuǎn)染20 h后收集細(xì)胞裂解液，并進(jìn)行免疫共沉淀，孵育2 h后，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，如圖4所示，STAT3可以發(fā)生泛素化修飾。2.5STAT3蛋白泛素化類型確定泛素分子全長(zhǎng)包含7個(gè)賴氨酸

13、位點(diǎn)（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）和1個(gè)位于C端的甘氨酸位點(diǎn)以及位于N端的甲硫氨酸位點(diǎn)。泛素自身的每個(gè)賴氨酸位點(diǎn)以及N端的甲硫氨酸位點(diǎn)都可以發(fā)生泛素化從而延伸泛素鏈10-11，其中對(duì)K48、K63位多聚泛素化的研究最廣泛。按照試驗(yàn)方法中所述，將構(gòu)建的pRK5-flag-STAT3真核表達(dá)載體以及pRK5-flag分別與HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K48一起轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染20 h后收集細(xì)胞裂解液，并進(jìn)行免疫共沉淀，孵育2 h后，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，如圖5所示，STAT3可以發(fā)生多種類型的泛素化修飾。3結(jié)果與討論STAT3蛋白

14、作為信號(hào)通路中一個(gè)關(guān)鍵的分子，在受到外界信號(hào)刺激時(shí)，會(huì)發(fā)生磷酸化和二聚體化，轉(zhuǎn)化為活性形式的pSTAT3，進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活的作用。本研究通過(guò)克隆的方法獲得了人源STAT3基因，并將其構(gòu)建在pRK5-flag表達(dá)載體上。之后將pRK5-flag-STAT3和泛素質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，確認(rèn)STAT3可以發(fā)生泛素化修飾，并可以發(fā)生Ko、K48、K63等多種類型的泛素化。已有研究報(bào)道K63位的泛素化中在信號(hào)激活和蛋白質(zhì)運(yùn)輸中起了關(guān)鍵作用；蛋白激酶Akt的K63鏈泛素化，對(duì)于Akt的膜定位和磷酸化很重要12-14。此外，K48位的泛素化被證實(shí)與蛋白質(zhì)降解有關(guān)15。而其他賴氨酸連接的多聚泛素鏈具有非泛素降

15、解和泛素降解功能，其中K63連接多聚泛素化具有非泛素降解功能。已發(fā)現(xiàn)泛素化介導(dǎo)的非蛋白降解功能包括DNA損傷修復(fù)、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、胞吞作用和蛋白激酶活化。結(jié)合本研究結(jié)果以及已有文獻(xiàn)報(bào)道，可推測(cè)K63位非降解功能的泛素化影響STAT3蛋白的磷酸化，從而影響STAT3的活性及功能的發(fā)揮；而K48位降解功能的泛素化影響STAT3蛋白的降解，使STAT3蛋白得以更新，這2種類型的泛素化對(duì)于STAT3蛋白及其功能都十分重要。Reference：1Levy D E，Kessler D S，Pine R，et al. Interferon-induced nuclear factors that bin

16、d a shared promoter element correlate with positive and negative transcriptional controlJ. Genes & Development，1988，2（4）：383-393.2Dale T C，Imam A M，Kerr I M，et al. Rapid activation by interferon alpha of a latent DNA-binding protein present in the cytoplasm of untreated cellsJ. Proceedings of the Na

17、tional Academy of Sciences of the United States of America，1989，86（4）：1203-1207. 3Fu X Y. A transcription factor with SH2 and SH3 domains is directly activated by an interferon alpha-induced cytoplasmic protein tyrosine kinase（s）J. Cell，1992，70（2）：323-335.4Nakanoh S，F(xiàn)use N，Tadokoro R，et al. Jak1/Sta

18、t3 signaling acts as a positive regulator of pluripotency in chicken pre-gastrula embryosJ. Developmental Biology，2017，421（1）：43-51.5Yu H，Pardoll D，Jove R. STATs in cancer inflammation and immunity：a leading role for STAT3J. Nature Reviews Cancer，2009，9（11）：798-809.6Larner A C，David M，F(xiàn)eldman G M，et

19、 al. Tyrosine phosphorylation of DNA binding proteins by multiple cytokinesJ. Science，1993，261（5129）：1730-1733.7Lee H，Zhang P，Herrmann A，et al. Acetylated STAT3 is crucial for methylation of tumor-suppressor gene promoters and inhibition by resveratrol results in demethylationJ. Proceedings of the N

20、ational Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（20）：7765-7769.8Pan J，Lee Y，Zhang Q，et al. Honokiol decreases lung cancer metastasis through inhibition of the STAT3 signaling pathwayJ. Cancer Prevention Research，2017，10（2）：133-141.9Park S，Kim D，Kaneko S，et al. Molecular cloning a

21、nd characterization of the human AKT1 promoter uncovers its up-regulation by the Src/Stat3 pathwayJ. Journal of Biological Chemistry，2005，280（47）：38932-38941.10Xu P，Duong D M，Seyfried N T，et al. Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradatio

22、nJ. Cell，2009，137（1）：133-145.11Rieser E，Cordier S M，Walczak H. Linear ubiquitination：a newly discovered regulator of cell signallingJ. Trends in Biochemical Sciences，2013，38（2）：94-102.12Yang W L，Jin G，Li C F，et al. Cycles of ubiquitination and deubiquitination critically regulate growth factor-mediated activation of Akt signalingJ. Science Signaling，2013，6（