動(dòng)物組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

1、動(dòng)物組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件 第1頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二凈化工作室 - 我國(guó)藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn) -潔凈度級(jí)別塵粒最大允許數(shù)/立方米塵粒最大允許數(shù)0.5um5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003,50005110,000350,0002,0001003100,0003,500,00020,00050010300,00010,500,00060,000NA15第2頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二第3頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二風(fēng)淋室:風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，它不僅可以清除人體和物品

2、表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。風(fēng)淋室的板壁采用輕質(zhì)隔熱夾芯鋼板，吹淋板采用進(jìn)口不銹鋼制作，吹淋口方向可調(diào)，風(fēng)淋時(shí)間可在30-99秒間的調(diào)整。風(fēng)淋室可以配合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調(diào)，一般控制溫度在30-35較為適宜。第4頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二傳遞窗:該裝置是一種潔凈室的輔助設(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開(kāi)門次數(shù)，把對(duì)潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。PB系列傳遞窗按用途分為標(biāo)準(zhǔn)型和生物潔凈型兩種。（后者帶空氣自凈裝置）按門互鎖形式分為機(jī)械互鎖和電子互鎖兩種

3、外殼按材料分為彩鋼板型、薄鋼板噴塑型和全不銹鋼型三種通用型尺寸如下表所列，特殊規(guī)格按用戶要求制作。第5頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二高效過(guò)濾器: 高效過(guò)濾器是用超細(xì)玻璃纖維紙作濾料，膠板紙作分隔板，可與鋁合金框、木框及鍍鋅鋼板框組合而成。 特點(diǎn)：具有低阻高效、輕質(zhì)、容塵量大等特點(diǎn)，層高的要求，縮小凈化設(shè)備靜壓箱體積等優(yōu)點(diǎn)。 適用于常溫常壓常濕條件下環(huán)境空氣的凈化，尤其適用于需要高效空氣過(guò)濾器覆蓋率高的凈化廠房。第6頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二潔凈層流罩: 技術(shù)性能參數(shù)： (1)凈化等級(jí)：100級(jí)(美國(guó)聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)209E) (2)平均風(fēng)速：

4、0.250.45m/s(可調(diào)) (3)噪音：62dB(A) (4)電源：220V/50HZ 層流罩是可提供局部高潔凈環(huán)境的空氣凈化設(shè)備。它主要由箱體、風(fēng)機(jī)。初效空氣過(guò)濾器、高效空氣過(guò)濾器、阻尼層、燈具等組成，外殼為不銹鋼或彩鋼板。該產(chǎn)品既可懸掛，又可地面支撐，結(jié)構(gòu)緊湊，使用方便?？梢詥蝹€(gè)使用，也可多個(gè)聯(lián)接組成帶狀潔凈區(qū)域，形成潔凈隧道。 潔凈層流罩是將空氣經(jīng)風(fēng)機(jī)以一定的風(fēng)壓通過(guò)高效空氣過(guò)濾器后，由阻尼層均壓，使?jié)崈艨諝獬蚀怪睂恿餍蜌饬魉腿牍ぷ鲄^(qū)，從而保證了工作區(qū)內(nèi)達(dá)到工藝所需的高潔凈度。第7頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二超凈工作臺(tái) 超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)

5、動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。 第8頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二II級(jí)A型生物安全柜:一種既能使操作造成無(wú)菌、無(wú)塵的局部空氣環(huán)境，保證檢驗(yàn)、檢測(cè)不受污染，又能保證被研究的對(duì)象（如病菌、細(xì)菌等）不外溢，保護(hù)周圍環(huán)境及操作人員的安全隔離設(shè)備。該設(shè)備可廣泛應(yīng)用于低、中等危險(xiǎn)度（病原體1-3，DNA重組P1-P3）的臨床細(xì)菌學(xué)，病毒學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、生物學(xué)及生命科學(xué)的研究，加工、檢驗(yàn)部門。第9頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣

6、、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 第10頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時(shí)）。主要用干玻璃器皿消毒 第11頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二濾 器Zeiss濾器：過(guò)濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過(guò)法除菌第12頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二大容量高壓滅菌器 全自動(dòng)手提式滅菌器 第13頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀第14頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二培 養(yǎng) 板第15頁(yè)

7、，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二培養(yǎng)瓶第16頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二 常用玻璃器皿清洗浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干第17頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二清潔液的配制第18頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90 ，14 h)。箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾

8、水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。第19頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二移液器第20頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二第21頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二顯微鏡第22頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器第23頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二高速離心機(jī) 第24頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二液氮罐第25頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二實(shí)驗(yàn)室安全層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則一級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室二級(jí)生

9、物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室四級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室第26頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則 我院層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為萬(wàn)級(jí)，專供細(xì)胞培養(yǎng)、凍存以及細(xì)胞治療用。層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室的總體要求：經(jīng)濟(jì)、有序、高效、安全。初步制定相關(guān)制度如下：第27頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二1、準(zhǔn)入制度：1）必須取得實(shí)驗(yàn)室相關(guān)實(shí)驗(yàn)技能考試合格方可進(jìn)入層流凈化室；2）在本室工作的實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)嚴(yán)格遵守本室工作守則，外來(lái)人員在進(jìn)入凈化室工作之前，必須接受培訓(xùn)；3）沒(méi)有經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員不得單獨(dú)進(jìn)入凈化室工作；4）進(jìn)入凈化室后要保持安靜

10、，不得大聲喧嘩。第28頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二2、安全制度：1）層流凈化室內(nèi)必須注意安全用電；2）謹(jǐn)慎使用酒精燈，不能在有明火的情況下加、換酒精； 3）實(shí)驗(yàn)人員自覺(jué)維護(hù)室內(nèi)設(shè)備的安全使用，對(duì)室內(nèi)的儀器如CO2孵箱等要經(jīng)常注意機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)情況，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)檢修或報(bào)告請(qǐng)人檢修；4) 離開(kāi)層流凈化室必須斷開(kāi)必要的儀器電源；5）對(duì)不符合層流凈化室安全規(guī)定的行為主動(dòng)報(bào)告主管老師。 第29頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二3、衛(wèi)生消毒制度：1）一般情況下細(xì)胞間每日消毒一次（包括兩個(gè)緩沖間），方法為紫外線消毒（每次30分鐘至1小時(shí)）一次，另外每周用10乳

11、酸在緊閉門窗下熏蒸分鐘；2）實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)清理所用物品，注意臺(tái)面整潔；3）及時(shí)清洗所用隔離衣，并高壓滅菌后存放于指定位置（每日一次）； 4）除實(shí)驗(yàn)必須的用品外，其它物品不得帶入凈化室； 5）層流凈化室內(nèi)所用儀器及附屬設(shè)備均應(yīng)在指定范圍內(nèi)使用，不得隨意轉(zhuǎn)移地點(diǎn)，以便他人順利使用；6）層流凈化室實(shí)施值日生負(fù)責(zé)制，值班人員負(fù)責(zé)檢查室內(nèi)是否保持清潔整齊，督促違反規(guī)定者改正錯(cuò)誤。第30頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二4、出入制度：總體原則為進(jìn)出凈化室應(yīng)按次序開(kāi)、關(guān)門，只有將前面打開(kāi)的門關(guān)閉后才允許打開(kāi)下一個(gè)門，出入線路絕對(duì)不能逆行，使緩沖間起到應(yīng)有的作用。1）層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室

12、共有兩個(gè)緩沖間，進(jìn)入每個(gè)緩沖間必須更換指定消毒的拖鞋；2）穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開(kāi)層流凈化室；3）人流：打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)室外門，進(jìn)入第一緩沖間，開(kāi)燈，關(guān)閉細(xì)胞培養(yǎng)室外門, 穿戴專用的潔凈隔離衣、工作鞋帽、口罩等；打開(kāi)第一緩沖間內(nèi)側(cè)門，進(jìn)入第二緩沖間，新潔爾滅泡手1分鐘，烘干，關(guān)閉第二緩沖間外側(cè)門；打開(kāi)第二緩沖間內(nèi)側(cè)門，進(jìn)入層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室, 關(guān)閉層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室外門。4）物流：所有進(jìn)出層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室的物品均應(yīng)通過(guò)傳遞窗進(jìn)行；物品進(jìn)入層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室時(shí)，應(yīng)先打開(kāi)傳遞窗外側(cè)門，將物品放入傳遞窗，關(guān)閉傳遞窗外側(cè)門，打開(kāi)紫外燈照射分鐘；人員進(jìn)入層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室后，關(guān)閉紫外燈，打開(kāi)

13、傳遞窗內(nèi)側(cè)門，取出物品；物品出室次序與以上進(jìn)室次序相反，但不需紫外線照射。第31頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 ，O2 CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- 滲透壓 3 無(wú)污染 4 無(wú)毒第32頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml第

14、33頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二消化液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過(guò)濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用 第34頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二培養(yǎng)基：培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。第35頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月2

15、0日，16點(diǎn)11分，星期二天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限。 成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。 易發(fā)生支原體污染 第36頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二合成培養(yǎng)基： 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 。 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿

16、足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。 第37頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） ；多種金屬離子；激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等； 各種生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)移蛋白；不明成分。第38頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二一般說(shuō)來(lái)，含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加 10血清對(duì)于血清支持細(xì)因生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同

17、對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞第39頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二無(wú)血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長(zhǎng)因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子 等。無(wú)血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來(lái)已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無(wú)血清培養(yǎng)基中成功地生長(zhǎng)和增殖。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)

18、性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。第40頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二向無(wú)清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長(zhǎng)的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長(zhǎng)。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同。 無(wú)血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清。 第41頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘血清的消毒：過(guò)濾除菌第42頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)11分，星期二抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定。第43頁(yè)，