化學微生物學微生物轉化

1、化學微生物學微生物轉化第1頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二UM-BBD第2頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第一節(jié) 微生物轉化歷史一、轉化歷史第3頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二二、酶促轉化歷史第4頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二三、與傳統(tǒng)化學的比較第5頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二二 微生物轉化方法 從20世紀50年代開始，微生物學家通過有機化學、物理學、生物化學和遺傳基因學等學科的幫助，來研究了微生物代謝產物中的化學組成以及生命活動中酶和酶的化學反應使

2、生物學科向分子水平發(fā)展；同時也提供了微生物學向化學學科的滲透。微生物學研究者應用現(xiàn)代的生物技術來幫助生物化學和有機化學工作者解決一些復雜和疑難的微生物代謝產物和化學合成的反應創(chuàng)造出不少人工合成的新化合物，推動了生物化學和有機化學的發(fā)展。 第6頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二微生物轉化是通過微生物細胞將復雜的底物進行結構修飾，也就是利用微生物謝過程中產生的某個或某一系列的酶對底物特定部位(基團)進行的催化反應。微生物作為一個生命體，其體積雖小，但有一套自身特異性的酶體系。在它的生長過程中有無數(shù)酶的參與，合成酶、水解酶、異構酶、氧化酶、還原酶等都可能對加入其中的底物發(fā)生

3、作用，使其結構發(fā)生變化。正因為微生物有著這獨特的優(yōu)點，微生物轉化就具備了生物量積累快、轉化時間短、轉化酶表達效率高、便于工業(yè)化生產的特點。第7頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二微生物轉化歷史悠久，早在2500年前的春秋戰(zhàn)國時期，人們就已經知道制醬和醋。在宋代，采用老的曲子進行接種，還根據酸大米和明礬水在較高溫下培養(yǎng)制造紅曲。不過當時人們并沒有認識到可以利用微生物來合成化學物質。因此一般認為微生物轉化研究始于1864年巴斯德利用乙酸桿菌將乙醇氧化為乙酸，但工業(yè)化微生物轉化的重要里程碑應該是20世紀50年代美國普強藥廠的Murray和Peterson利用微生物黑根霉(Rh

4、izonpus nigricans)的羥化酶將黃體酮轉化為11-羥基黃體酮，即對甾體化合物的結構改造。第8頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二利用微生物的作用來進行某種化學反應稱為微生物轉化反應(microbial transformation or microbial bioconversion)。準確地說應該是利用微生物代謝過程中某一個酶或者一組酶系對底物進行催化反應稱為微生物轉化反應。隨著生物學科進一步發(fā)展，特別是固定化細胞、誘變和基因重組等重要的生物技術的發(fā)展，不僅使得生物轉化成倍地提高轉化率，并且能將幾種不同合成基因構建到同一個工程菌中使得一次培養(yǎng)同時進行幾步

5、轉化反應，使微生物轉化在天然藥物修飾中發(fā)揮更重要的作用。第9頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第一節(jié)微生物轉化的反應隨著現(xiàn)代生物技術的不斷進步，特別是固定化細胞、誘變和基因重組等的發(fā)展，使微生物轉化的轉化率成倍提高，也為天然藥物結構修飾帶來了廣大的發(fā)展空間。不同類的微生物都含有不同的酶系?，F(xiàn)在將目前應用和研究上用得比較多的微生物按化學反應分類。第10頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二1應用于氧化反應(1)脫氫反應 應用于脫氫反應的主要是細菌第11頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第12頁，共151頁，2022年，5月

6、20日，16點46分，星期二第13頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二(2)羥基化反應應用于羥基化反應的主要是放線菌第14頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二2、應用于水解反應應用于水解反應的主要是細菌、酵母菌和霉菌第15頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二3、應用于還原反應應用于還原反應的主要是酵母菌和霉菌。第16頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二4、應用于?；磻獞糜邗；磻闹饕羌毦?7頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二5、應用于降解反應應用于降解反應的主

7、要是細菌第18頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二6、應用于脫水反應應用于脫水反應的主要是細菌和霉菌第19頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第二節(jié)微生物轉化的一般過程微生物轉化實驗概要過程如下： 選擇需要的菌株 培養(yǎng)成熟菌絲或孢子 選擇合適的轉化方式 轉化培養(yǎng)或轉化菌絲及孢子懸浮液轉化 轉化液的分離提取 產品純化第20頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二1選擇菌種選擇好的菌種是做好微生物轉化反應的關鍵；根據微生物轉化反應的類型，選擇哪類微生物含這類反應的酶。一般可以向國家或地方保管菌種機構去函索取。2. 制備培養(yǎng)基 按微

8、生物轉化菌種的培養(yǎng)特征和轉化反應需要配制培養(yǎng)基；一般要求培養(yǎng)基的成分能使菌絲生長豐滿和富含需要的酶。第21頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二3 加轉他底物 加底物時有兩個同等重要的影響因素：選擇合適的菌種生長期加底物；選擇加底物的方法和方式。4 添加刺激劑或抑制劑 添加抑制劑是抑制酶副反應或抑制其他反應不良酶的生長；添加刺激劑是提高酶活力和增加酶生長量。第22頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二5 控制好轉化反應培養(yǎng)時間 按有關微生物轉化反應各種因素，控制好轉化反應培養(yǎng)終點電，使底物轉化達到最大反應完全值。6 調控好影響因素調控好整個轉化過程中

9、各項影響因素。7 控制好轉化反應終點 當取樣分析反映轉化培養(yǎng)液中轉化產物積累不再增加時，立刻采用物理方法將菌絲體及培養(yǎng)物除去來停止轉化反應。8 分離純化轉化產物此時轉化產物已與生物轉化系統(tǒng)分開，可按化學方法將產物分離提純第23頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二三幾種常用的微生物轉化方法 隨著固定化細胞、誘變和基因重組等重要的生物技術的發(fā)展，不僅使得微生物轉化在天然藥物修飾中發(fā)揮更重要的作用，使生物轉化成倍地提高轉化率，并且使得微生物轉化方法更加豐富?，F(xiàn)在將幾種微生物轉化方法簡介如下。第24頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二1、分批培養(yǎng)轉化法

10、分批培養(yǎng)(batch culture)轉化法是在搖瓶和發(fā)酵罐中待菌體生長到一定階段加入底物進行轉化的方法。底物加入時間因菌種和底物不同而各異，一般在對數(shù)生長期，但也有在延遲期和穩(wěn)定期加入的。第25頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二2、利用酶進行生物轉化 直接從微生物體內或發(fā)酵液中將酶提出在體外對底物進行生物催化?？梢越涍^多步處理得到純度較高的酶。也可以是粗酶?，F(xiàn)在微生物來源的酶已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工及環(huán)保等行業(yè)第26頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二3、應用滲透細胞進行生物轉化 應用滲透細胞進行生物轉化主要是促進底物滲入胞內，與酶充分接

11、觸，同時便于轉化產物透出胞外，這種方法更適合于胞內酶作用的生物轉化。增大細胞滲透性或改變細胞膜孔，一般采用表面活性劑或有機溶劑，有時也可利用抗生素來增加細胞膜的滲透性，但用量應適當控制，以免殺死微生物。第27頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二4、應用孢子進行生物轉化細菌的孢子一般無活性，而真菌的分生孢子和子囊孢子往往有較高的酶活力，與菌絲體比較具有雜質相對少的優(yōu)點。孢子轉化需要注意的是不能讓孢子萌芽，否則不能保持穩(wěn)定的生物轉化活力。應用于生物轉化的孢子懸浮液和培養(yǎng)基成分與靜止細胞轉化法相似也是采用不完全培養(yǎng)基，僅含有緩沖液及葡萄糖等產生能量的碳源。第28頁，共151頁

12、，2022年，5月20日，16點46分，星期二5、應用固定化細胞進行生物轉化 固定化細胞在適宜的轉化條件下進行生物轉化能保持細胞相對活的狀態(tài)，它的最大優(yōu)點是可以長期反復使用，有的能維持有效催化達數(shù)月之久。另外使用固定化細胞還使得產物提取簡單，便于自動化和大規(guī)模的工業(yè)化生產。目前常用的固定化方法有聚丙烯酰胺聚合法和卡拉膠包埋法。第29頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二6、應用干燥細胞進行生物轉化干燥細胞轉化法實際上是另一種靜息細胞轉化法，便于貯備隨時使用。干燥細胞的制備有以下兩種常用方法。冰凍干燥法：將培養(yǎng)好的菌絲液，通過離心或過濾，洗滌后獲得干凈的菌絲體并重新懸浮于稀

13、的緩沖液或純水中，冰凍后抽真空，直接升華除去水分得到蓬松的粉末。這種干燥菌絲體在冰凍保存的條件下可以保持活力達數(shù)年之久，適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產。第30頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二丙酮干粉制備法：將菌絲體懸浮于一20的丙酮中處理3次，每次獲得泥漿狀的丙酮液，用抽氣過濾進行收集，最后用冷乙醚洗滌，以幫助洗去殘余的丙酮。丙酮干粉劑必須冰凍貯藏，以供隨時使用。第31頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二7 靜息細胞轉化法 靜息細胞轉化法是指將微生物培養(yǎng)至定階段后分離出菌絲體，將其重新懸浮于不完全培養(yǎng)基(缺少某種營養(yǎng)物質，如氮源等)中，使其處于不再

14、生長但仍保持原有各種酶活的狀態(tài)，再加入底物，在適當?shù)臏囟?、pH和振蕩條件下進行轉化的方法。它是一種將生長影響減至最小的生物轉化方法。第32頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二四 微生物轉化反應的特點 微生物轉化反應，可以用靜止地按洗滌細胞進行研究也可以用發(fā)酵方式進行轉化以及應用固定化細胞進行生產等。 它跟酶法轉化和有機化學轉化比較有以下特點第33頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 1、反應條件溫和、公害少、設備簡單且反應速度快 在微生物轉化的反應中一般無需高壓、強熱等比較苛刻的條件，只需在常溫和pH為7左右的環(huán)境下進行反應即可； 原料除了普通的

15、培養(yǎng)基和底物外沒有其他化學品，一般普遍認為公害比較少； 設備簡單，反應條件比較溫和，生產安全。 微生物轉化反應是酶催化的反應。在最合適條件下，一秒內酶能催化底物轉化成產物的分子個數(shù)數(shù)量級是102lO6第34頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二2、可以減少反應步驟 隨著現(xiàn)代生物技術的迅速發(fā)展，酶合成基因構建的基因工程菌可以把需要幾步催化合成的中間體在一次發(fā)酵中轉化完成。將幾步中間體合成的酶通過基因構建到同一工程菌中，使在發(fā)酵法轉化時需要幾步催化臺成的中間體只要一步就可以轉化成功。如維生素c生物合成中基因重組葡萄糖酸氧化桿菌的代謝工程菌，將L-山梨醇脫氫酶基因和L-山梨酮脫

16、氫酶基因，通過基因重組構建出一個工程菌株，發(fā)酵過程可以在同一次轉化發(fā)酵中將D一山梨醇轉化成一酮一L古洛糖酸。第35頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二3、對立體結構合成上具有高度的專一選擇性 微生物轉化反應其實也是一種酶反應對底物作用時，具有高度的立體結構選擇性。微生物轉化反應不僅對結構有化學選擇性，還有區(qū)域選擇性、面選擇性和對映異構選擇性。第36頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二嚴格的立體結構選擇性對天然藥物微生物轉化來說是非常重要的。因為藥物的異構不僅無用或者低效，并且會帶來副作用，有時會有相反的藥效和強力的毒性。特別是生理活性很高的激素、

17、抗生素以及心血管系統(tǒng)和神經系統(tǒng)等藥物的藥效對對映體結構的要求很高，往往具有嚴格對映體結構要求，這是有機化學合成等方法根難達到的。第37頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二4、回收率高、成本低 微生物轉化反應是在細胞內進行，保持原來整體酶系比較符合生物催化所需環(huán)境和條件。 在氧化一還原等催化反應時不需要添加輔酶；輔酶往往很不穩(wěn)定，難以分離提取，從這點來說微生物轉化比酶法轉化要好多了。 微生物 反應可以持續(xù)進行、反應量大、回收率高并可以大規(guī)模工業(yè)化生產。從設備和原料方面來說生產成本低于酶法和化學合成法第38頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第三節(jié)

18、微生物轉化的影響因素利用微生物代謝過程中某一個酶或一組酶系對底物進行催化反應，稱為微生物轉化反應。微生物轉化反應本質上是一個酶反應，因此，同酶反應一樣，在這個催化反應過程中涉及一系列的影響因素，其中最為重要的是轉化的時間、溫度、底物添加方法、酶的抑制劑、酶的誘導劑以及生長調節(jié)劑等。上述因素的變化皆會對轉化率有一定的影響。下面分別針對上述因素對微生物轉化的影響加以具體敘述第39頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二一、轉化的時間和溫度 微生物轉化反應本質上是酶反應，是單酶或多酶的催化反應。 既然是酶反應，就存在一個最佳的反應時間，時間太短則轉化不完全；時間太長，會造成微生物

19、衰亡及酶失活。 最佳反應時間的確定可以采用高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、薄層掃描(TLCS)、分光光度法等定量分析手段來完成。 不同的反應類型、不同的微生物、不同的酶，最佳反應時間不同，有的只需幾小時，有的則持續(xù)數(shù)天第40頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 溫度也是影響轉化率的一個重要因素。溫度升高，轉化率會提高，但超過一定的限度，會使得酶失活速率也加快，所以只有在一個適當?shù)臏囟认罗D化，才能達到最佳轉化率。最佳溫度的選擇也可通過上述分析檢測手段來確定第41頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二二、底物添加方法在微生物轉化中，根據能否

20、溶于水來分，可以把底物分為兩大類，即可溶于水和不可溶于水底物。能溶于水的底物添加方法中有許多是與培養(yǎng)基中添加碳源的方法相類似，但是其轉化率與其添加方法有很大的影響。第42頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二對于能溶于水的底物來說，將其添加到水的培養(yǎng)基中進行微生物轉化是比較容易的，不過要注意加底物量的多少、添加速度和底物是否對微生物有毒性。添加底物的量一般與微生物轉化反應的類型，細胞內含酶的多、少、強、弱和底物的化學性質有關；第43頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二含酶活力強和含酶量多的微生物進行轉化時，添加底物的速度可以快點，底物的量也可以多點

21、。加底物速度和量要與微生物的耐受能力相掛鉤，底物舔加的速度和總量不能超過微生物的耐受范圍，同時產物的積累也會對酶產生抑制，所以必須有一個合適的底物添加量，第44頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二一般來說，非離子化合物的底物最大投料質量濃度約為10 ，而離子型的底物為5；不同 的微生物對有毒性的底物的耐受性不一致，一般來說在微生物生長期其耐受有毒底物的能力比較低；還得注意的一點是即使對沒有毒性的底物，當轉化積累到大量的非毒性底物時，也會產生產物抑制現(xiàn)象，所以最好用連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵隨時分離轉化得到的產物。第45頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 而對

22、于不能溶于水的底物來說，將其添加到水的培養(yǎng)基中要比添加能溶于水的底物難得多，但是隨著現(xiàn)代化生物技術的廣泛應用，目前已經有許多種解決方法了。采用將底物制成細粉末狀的固體直接投料。這種投料方式使得轉化細胞和粉末底物之間有最好的接觸表面積，轉化率也會提高。在甾體轉化中常用此法。第46頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二將不溶于永的底物溶于能溶于水的有機溶劑中來進行添加。這類有機溶劑包括有低級醇(甲醇、乙醇)、丙酮和二甲基亞砜等；但是這類水能 溶的有機溶劑超過一定量對細胞和酶都會有一定的傷害作用每次添加的量要 盡量少第47頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星

23、期二采用非毒性表面活性物質來分散不溶性底物。通常應用聚山梨 酯80(吐溫一80)等非毒性表面活性物質來分散不溶性底物使得底物和轉化液的接觸面增大，來提高轉化率。一般操作方法是先配制好表面活性荊質量濃度為3的轉化液，然后將不溶水的粉末狀底物滴加分散到轉化液中進行轉化，必要時可用超聲波促進分散程度。第48頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二三、酶的抑制劑 在微生物轉化過程中添加酶的抑制劑是為了抑制轉化過程中的副反應，保證獲得轉化的目的產物。如在采用微生物轉化降解膽固醇的側鏈的方法制備甾體激素類藥物重要中間體雄甾二酮的過程中通過添加含二價鐵的螯合劑來抑制開裂甾體母核的副反應。

24、第49頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二四、酶的誘導劑 在微生物轉化過程中，酶活力的總強度是細胞內含酶量乘以細胞總數(shù)。要增加酶活力不僅要增加細胞的投入量，還要誘導細胞內酶量的增加。酶的合成在整個細胞生命中是根據其生理上的需求來進行調控的。酶可以分為組成酶和誘導酶第50頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二組成酶是指在微生物的生長代謝過程中會自然產生的一些酶.而誘導酶是指在加入一定的誘導物后才會產生或明顯地增加產量的一類酶。對于組成酶來說，微生物轉化的酶量主要與微生物的菌體量有關。第51頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二在

25、微生物轉化反應中許多重要的酶在沒有誘導的情況下是檢測不到其酶活的，這類酶稱為誘導酶。在微生物對數(shù)生長期容易被誘導物誘導產生，因此在對數(shù)生長期加入誘導劑是一個最好的時機。還有一個重要的規(guī)律是通常能被轉化的底物都具有該轉化酶的誘導作用第52頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二五、生長調節(jié)劑 生長調節(jié)劑(生物激素)對生物體代謝調節(jié)有顯著影響。因此，在微生物轉化過程中選擇合適劑量的生長調節(jié)劑可以有效地提高底物的轉化。第53頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第四節(jié) 微生物轉化的應用隨著科技的迅速發(fā)展，微生物轉化得到了不斷發(fā)展，從近年來的研究可以看出，一種

26、微生物可以轉化多種在分子結構上完全不同的物質；不同種微生物對結構相似的物質可以發(fā)生類似的反應。所以微生物轉化已成為現(xiàn)代生物工程技術的重要組成部分，廣泛應用于有機化合物的合成、藥物前體化合物的轉化、活性成分篩選及新藥開發(fā)、藥物代謝模型預測等諸多領域。第54頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二一在有機合成領域的應用 微生物轉化技術由于其高度立體及區(qū)域選擇性在有機合成領域的應用已經取得了顯著的效果,成為有機合成中的一個重要工具。根據Davis等的統(tǒng)研究，認為應用于微生物轉化的酶主要是乙酰轉移酶、糖苷酶、糖基轉酶、環(huán)氧酶、羥基化酶、醛縮酶等。第55頁，共151頁，2022年，5

27、月20日，16點46分，星期二按照1961年國際生化會議的規(guī)定，根據酶催化的反應類型不同，酶可以分為六大類：氧化還原酶類；轉移酶類； 水解酶類；裂合酶類；異構酶類；合成酶(連接酶)類。在有機合成域主要是利用氧化還原酶類和水解酶類，大約有23的生物轉化是蛋白酶、酯酶和脂肪酶起酯基和氨基的水解反應。第56頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 微生物轉化應用于有機化合物的合成存在著許多優(yōu)點，同時也有一些不足之處。最顯著的優(yōu)點就是高度選擇性，包括化學選擇性、區(qū)域選擇性，非對映選擇性、對映體選擇性，還有反應條件溫和，酶種類多樣酶量充足、轉化效率高、產品質量穩(wěn)定、對環(huán)境污染少等。缺

28、點是在一些極端的反應條件下，如過高或過低的pH、溫度和高鹽的濃度下，酶均易失活微生物轉化反應就明顯暴露出其不足之處。另外還存在產物和底物的抑制現(xiàn)象，有的底物或產物在一定的濃度下會抑制酶活，從而影響了轉化效率。盡管如此，微生物轉化已經成為有機合成的一個重要工具第57頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二（一）手性化合物合成與拆分 手性是生物體的基本特征，構成生命有機體的分子大都是不對稱的手性分子。 人體內在的手性環(huán)境可以識別手性藥物對映體，使對映體在活性、代謝過程和毒性等方面存在顯著差異。 如用于消除孕婦早期妊娠反應的鎮(zhèn)靜劑“反應?！?thalidomide，沙利度胺)被應

29、用不久，就被發(fā)現(xiàn)可以致使嬰兒出現(xiàn)畸形，經研究發(fā)現(xiàn)具有鎮(zhèn)靜作用的是其R一對映體而致畸變是由s一對映體引起的。因此必須對不同對映體看成不同的化合物進行研究。 利用微生物轉化對手性化合物的合成與拆分與化學拆分相比，有選擇性高、步驟簡單、成本低、產物回收率高等優(yōu)點。典型的例子就是采用生物法半合成頭孢菌素，通過利用酶的對映體催化專一性，只需兩步就可以替代傳統(tǒng)的化學生產法。第58頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二當前，國際上常認為手性化技術主要有三類：色譜法、化學不對稱合成與拆分法、生物合成與拆分法。前兩種方法是手性轉移方法，需要手性試劑、手性配基等手性源，而且還經常用到過渡金屬

30、配合物作為手性模板，誘導反應中手性中心的建立，所以在制藥工業(yè)中的應用受到了限制，而且這些方法存在著操作復雜、試劑昂貴、得到產物光學純度不高等缺點。生物合成與拆分方法不僅不需要手性源，還能將非手性化合物轉化為手性化合物，并且克服了以上兩種方法存在的不足。這三種手性化技術的優(yōu)缺點如表1 2所示。第59頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二表1-2三種手性化技術方法的比較第60頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二微生物轉化在合成手性化合物領域已經廣泛運用。生物合成手性化合物主要是兩類：一類是外消旋體拆分為兩個光活性對映體；另一類是以外消旋或手性前體由底物

31、，通過酶催化得到不對稱的光活性產物。第61頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二Snell等利用細菌Rhodococcus AJ270中的腈水合酶對消旋布洛芬酰胺進行拆分，該酶對s-布洛芬酰胺的選擇性強，水解速度快，可得到s-布洛芬。甾體激素的微生物轉化是在手性合成研究中應用較早和較成功的例子，通過常規(guī)的化學方法很難氧化非活潑的碳氫鍵，而微生物氧化卻很容易做到這一點。第62頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二例如黑根霉(Rhizonpus nigricans)的羥化酶能使黃體酮(1一1)轉化為11-羥基黃體酮(1-2)圖 手性甾體化合物的微生物轉化

32、第63頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 左旋多巴是L-酪氨酸的衍生物3，4二羥基-L-苯丙氨酸，用于治療帕金森病。日本學者A Yamamoto等通過靜態(tài)細胞生物轉化方法，將草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)懸浮于緩沖液，就可以將鄰苯二酚(兒茶酚)、丙酮酸和氨縮合成左旋多巴，該生產工藝已經獲得專利(圖1- 8)第64頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二圖1-8 微生物轉化法制備左旋多巴第65頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二（二）食品添加劑的合成食品添加劑常是指在加工食品過程中為了保存或改善食品品質而添

33、加的物質。它們常具有保健、保鮮或改善風味等功能。這類化合物對人體發(fā)揮了重要的生物學作用。因此它們的合成研究備受人們關注，除了傳統(tǒng)的化學合成方法外，現(xiàn)在越來越多人也重視其微生物轉化合成法?，F(xiàn)就對常見的食品添加劑維生素C和香蘭醛微生物轉化合成作個簡要介紹。第66頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二1、維生素C的合成維生素C(Vc)是一種抗氧化劑，可作為食品添加劑，廣泛存在于檸檬、柑橘等水果和新鮮蔬菜中，它能用于壞血病的防治和增強機體對感染的抵抗能力，是一種輔助性治療藥物。眾所周知，Vc生產中的某些合成步驟是由微生物轉化完成的。第67頁，共151頁，2022年，5月20日，1

34、6點46分，星期二最早在l 935年，Reichstein就選用弱氧化乙酸桿菌(A . Suboxydans)將D一山梨醇轉化為L-山梨糖，再經多步化學反應就合成得到Vc。但到了20世紀70年代。我國學者發(fā)明了“二步發(fā)酵法”生產Vc ，即在上述的乙酸桿菌轉化后，再用氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobadter oxydans)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的混合菌使得L-山梨糖轉化為2-酮基-L-古龍酸，見圖19。第68頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第69頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二圖“二步發(fā)酵法”合成維生

35、素c第70頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二這一步微生物轉化反應較化學合成反應污染減少，合成步驟縮短，合成效率提高了。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展和應用，人們運用基因工程法構建一種新的工程菌它能直接將葡萄糖轉化為2-酮基-L-古龍酸。然后只需一步內酯化和烯醇化就制得Vc（代謝工程菌，將L-山梨醇脫氫酶基因和L-山梨醣脫氫酶基因，通過基因重組構建出一個工程菌株，發(fā)酵過程可以在同一次轉化發(fā)酵中將D一山梨醇轉化成一酮一L古洛糖酸。）第71頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二2、 香草醛合成香草醛(vanillin)又稱香蘭素是天然香料中最重要的一種。香料是

36、食品、化妝品和制藥工業(yè)的重要原料，香料占食品添加劑市場總量的25左右。長期以來，人們熱衷于從天然植物中提取香料，但是由于植物資源有限，含量低，提取困難，因而價格很昂貴。第72頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二雖然現(xiàn)在存在有機合成的香料，但是人們更鐘情于天然的產物，因此微生物轉化也成為了香料合成的一個重要途徑。通過微生物轉化方法合成香草醛就是一個典型的成功例子。它常以阿魏酸為反應起始物利用芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌等多種微生物進行一氧化產生香草酸，再通過諾卡氏菌(Nocardia sp. NRRL 5646)中的羧基還原酶系選擇性地將香草酸還原成香草醛(圖-10)第73

37、頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二圖1-10 微生物轉化法合成香草醛第74頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二二在新藥開發(fā)中的應用新藥合成主要是依靠化學合成和生物轉化兩種途徑?；瘜W合成途往主要是化學家們依據理論、自身經驗及文獻報道，主觀地設計合成路線，因此在仿生性和立體結構選擇性方面存在一定的難度，甚至很難實現(xiàn)；相反生物體經長期的演化進化，具有一套自身特異性的酶體系，使得生物轉化合成物質的途徑處于最佳狀態(tài)。第75頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二生物轉化方法通常以天然活性成分為先導化合物利用多種不同催化功能的酶系對其結

38、構進行修飾，從而得到更多結構新穎的化合物，再通過活性篩選，可以尋找新的高效低毒的先導化合物或通過對活性組分中不同成分結構變化與活性強度消長關系的分析發(fā)現(xiàn)關鍵活性成分。而我國天然藥物資源比較豐富用天然活性成分作為先導化合物尋找創(chuàng)新藥物是一個非?？扇〉耐据p第76頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二余伯陽等利用26種工業(yè)微生物對阿片類生物堿dihydrothevinone進行微生物轉化，經制備性實驗分離純化得到兩種主要產物，并鑒定為3-O-Demethyldihydrothevinone和nordihydrothebinone。通過轉化反應動力學分析表明去氧甲基化和去氮甲基化

39、幾乎是同時進行的第77頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二最后將P450酶抑制劑octylamin入反應體系，結果去氮甲基化反應被選擇性抑制，因此說明這兩個反應被不同酶催化從而可選擇性地制備單一產物nordihydrothebione，其nordihydrothebinone為阿片受體抑制劑的前體。微生物轉化規(guī)律還可以指導新藥的結構修飾，并獲得高效長效的新一代藥物，例如從硝苯地平轉化為氨氯地平， prontosil(偶氯磺胺)發(fā)展成為磺胺藥，這些可以說明微生物轉化對新藥開發(fā)的重要性。第78頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二三 作為體外模型預測代

40、謝 藥物代謝(drug metabolish)是研究藥物分子在體內以不同的規(guī)模發(fā)生的生物化學轉化。藥物經代謝后通常發(fā)生結構變化，從而引起相應的藥理活性及毒性改變，例如代謝失活、代謝活化，它是直接影響藥物發(fā)揮療效的關鍵因素之一。大部分藥物都是有機體的外源性物質，為了保證用藥安全，必須充分了解藥物在體內的吸收、分布、排泄以及生物轉化等過程第79頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二藥物代謝反應從化學本質上可以分相(phase )代謝反應和相(phase)代謝反應兩種類型。相代謝反應主要是官能團化(functionalization)，包括氧化、還原、水解等反應。藥物經過相代謝

41、反應后，極性基團引人藥物分子，即在藥物分子上形成羧基、羥基、氨基等基團從而使藥物分子水溶性增強，便于排泄，同時也改變了原有的官能團，使得藥物解毒或活化。第80頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二相代謝反應主要是結合反(conjugation)，包括葡萄糖醛酸結合、硫酸結合、谷胱甘肽結合等，藥物極性進一步加大，有利于排出體外。第81頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 傳統(tǒng)的藥物代謝研究方法往往是通過收集給藥動物的體液(血漿、尿、膽汁)或采用體外離體器官灌流，組織或細胞體外培養(yǎng)、肝微粒體體外溫孵等。這些方法一方面由于生物樣品常受到內源性物質的干擾，

42、不易得到純代謝產物，就算得到其產物量也是極其少的，難以滿足結構鑒定和藥理活性篩選的需要；另一方面技術要求較高，操作復雜井且消耗大量的實驗動物。第82頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二體內代謝主要是在酶的參與下進行的，其代謝產物在體外很難通過化學方法合成，而微生物轉化就是利用生物體內的酶系對外源性物質進行催化，形成其代謝產物，因此微生物轉化已成為研究體內代謝的一種重要的輔助工具。第83頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 Simth和Rosazza在研究芳香化合物的微生物羥基化時，注意到微生物代謝物和哺乳動物代謝物有相似性，并于1974年最先提出

43、了“哺乳動物代謝的微生物模型”(microbial models of mammalian metabolism)的概念。其核心理論是：真菌和哺乳動物都是真核細胞生物，因此在主要的生理功能中含有類似的酶作用機制，所以兩者在外源性化合物的代謝過程中就有相似的代謝系統(tǒng)和過程因此，微生物轉化在模擬哺乳動物藥物代謝途徑具有一定的預見性。第84頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二基于這一理論Foster等研究發(fā)現(xiàn)Cunninghamella bainieri對普羅帕酮以及甲氧那明的生物轉化，與人體內的代謝過程十分類似，提示該菌具有與人體類似的藥物代謝酶，并且可以用于藥物間相互作用

44、的研究。近幾年，隨著人們研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多微生物體系具有和哺乳動物藥物代謝功能非常相似的細胞色素P450同功酶和葡萄糖苷羧酶等，可以進行某些與哺乳動物相同的羥基化、?；?、N一脫烷基化、O-脫烷基化以及葡萄糖醛酸結合等代謝反應。第85頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二利用微生物作為體外代謝模型研究哺乳動物代謝有以下優(yōu)點：微生物來源廣泛種類繁多，可提供大量的篩選模型；建立微生物轉化系統(tǒng)，成本較低，操作簡單，易于控制；可以通過調節(jié)優(yōu)化條件，顯著提高代謝產物的收率，經過分離純化后，可以作為代謝產物的對照品進行藥理和毒理研究； 可以減少實驗動物用量第86頁，共151頁，202

45、2年，5月20日，16點46分，星期二例1(一)-eburnamonine是一種重要的-咔啉生物堿，臨床用于改善大腦循環(huán)和代謝。該化合物在人體內一個活性代謝物為(6R)-6-hydroxyeburnamonine(1-3)，但卻一直沒有結構鑒定方面的數(shù)據。Adachi等利用卷枝毛霉(Mucor circinelloides f. griseo-cyanus IFO 4563)和呈紫色鏈霉菌(Striptomyces violens IFO 13486)對底物進行微生物轉化。卷枝毛霉經過72h反應得到三個羥基化產物1-3、1-4和1-5；而呈紫色鏈霉菌經48h反應, 底物轉化為產物1-3和1-4

46、并測出了三種產物的結構式(圖1-11)。第87頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二圖1-11 (一)-eburnamonine及其微生物代謝產物第88頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二例2 藥物維拉帕米在人體內代謝廣泛，主要產生C- N鍵和C一0鍵斷裂的多種氧化代謝產物代謝過程主要涉及CYP3A4、CYPlA2和CYP2C8等酶系。 劉磊等利用短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)對維拉帕米進行微生物轉化研究。在轉化液中檢測到維拉帕米主要形成C- N鍵和C- O鍵斷裂的10種氧化代謝產物，其中N

47、-去短鏈烷基維拉帕米為主要產物，產率大于65，其他代謝產物的產率均小于15%。對健康受試者口服維拉帕米后的尿液分析，結果表明N-去短鏈烷基維拉帕米比例為42%是最主要的產物，其他比例均小于10%，而且代謝反應類型也是C-N鍵和C-N鍵斷裂。第89頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 由此可見，無論從藥物代謝的氧化反應類型還是從主要代謝產物的種類和比例等方面對比，短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)與人體藥 物代謝的結果都比較一致，是研究藥物C-N鍵和C-O鍵斷裂較理想的體外 模型，還可以進行相關的代謝產物的藥理活性實驗

48、。第90頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二例3 磷酸苯丙哌林(benproperine phosphate)為兼具外周和中樞作用的非成癮性鎮(zhèn)咳藥，該藥毒性小、不抑制呼吸、不良反應少而輕。黃海華等利用短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)對苯丙哌林微生物轉化進行研究。根據液相色譜和質譜數(shù)據推測，轉化產物分別為苯丙哌林單羥基化物(約65)、苯丙哌啉雙羥基化物和苯丙哌林單羥基化物的硫酸酯結合物。這些轉化產物與其在人體內代謝產物基本相同，其區(qū)別在于微生物轉化不能生成苯丙哌林單羥基葡萄糖苷酸結合物(圖1-12)。因此，通過對苯丙

49、哌林的轉化研究，優(yōu)化轉化條件有可能獲得人體內苯丙哌林羥基化代謝產物的對照品, 確定其化學結構，輔助推測苯丙哌林在生物體(包括人體)中的部分代謝途徑。第91頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第92頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 從以上的實例可以進一步看出微生物轉化可以作為研究藥物體內代謝的一個重要工具。通過篩選出能產生動物體內藥物代謝產物的生物體系，調節(jié)優(yōu)化條件，不僅可以預測藥物在人體的代謝過程，還可以為體內代謝提供充足的對照品或產物以供結構鑒定和活性篩選。第93頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第五節(jié) 新技術在微

50、生物轉化的中應用 隨著現(xiàn)代生物科學和生物技術的迅速發(fā)展，以及一些分析測試技術的應用，微生物轉化也得到了進一步的發(fā)展?；蚬こ碳夹g、固定化細胞轉化技術、雙水相轉化技術、超聲波技術、有機介質微生物轉化以及生物反應器等綜合應用于微生物轉化反應體系，不僅可使轉化的效率成倍增長，而且還有可能使整個反應過程連續(xù)、自動化。同時，一些分析測試技術如核磁共振、質譜等已經應用于微生物轉化的在線檢測。第94頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二一、基因工程技術在微生物轉化中的應用隨著近年來分子生物學的發(fā)展，人們對基因工程的認識也逐步加深，這為微生物轉化提供了新的思路。基因工程技術的發(fā)展和實用化

51、為此開辟了有效途徑。只要生物細胞中存在有催化某一生化反應的酶，即使其量微不足道，應用基因重組技術，通過基因擴增與增強表達，人們就可能建立高效表達特定酶制劑的基因工程菌或基因工程細胞，從而進一步構建成新一代的催化劑固定化工程菌或固定化工程細胞。第95頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二如，應用DNA重組技術建立了絲氨酸和色氨酸合成酶工程菌，這種工程菌組裝的生物反應器可以用甘氨酸和甲醛為原料制造絲氨酸，反應液含絲氨酸超過400gL，再從絲氨酸與吲哚轉化生成色氨酸，反應液中色氨酸濃度達到200gL。此外利用基因工程還可以將能進行生物轉化的相關酶從微生物、植物甚至動物細胞中克隆

52、出來再導入一個微生物中進行表達，從而產生能對底物進行轉化的一系列酶，將原來復雜的幾種轉化過程縮短為一個轉化反應。目前在這方面的研究也是微生物轉化的一個趨勢，并且具有廣闊前景。第96頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二二、固定化細胞轉化技術在微生物轉化中的應用固定化細胞轉化技術自20世紀70年代問世以來已經廣泛應用于工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)學、環(huán)境保護、能源開發(fā)以及理論研究等方面，并取得了豐碩成果。利用固定化細胞轉化技術，省去了破碎細胞提取胞內酶的過程，完整細胞得到固定后，酶活損失較少，活性回收率高，并且保持了細胞內原有的多酶體系，對于一些需要多步催化的反應過程，一步即可完成。被固

53、定的微生物細胞可以是處于生長狀態(tài)或體眠狀態(tài)的活細胞也可以是死亡的細胞(但胞內酶的活力仍 存在)第97頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 在微生物轉化過程研究最多的是固定化活細胞包埋技術。常用的包埋材料有聚丙烯酰胺(PAA)、聚氨基甲酸乙酯(PU)、海藻酸鹽凝膠、二氧基硅氧烷、葡聚糖凝膠、聚乙烯醇(PVA)等。 以海藻酸鈣凝膠為例，其制備過程如下：在室溫條件下，將一定濃度的海藻酸鈉溶液與微生物細胞混合均勻后，滴加到氧化鈣溶液中，形成球珠。第98頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二Kaul等采用了海藻酸鹽固定化生物催化劑(簡單節(jié)桿菌)和底物(氧化可

54、的松)進行碳一位和二位脫氫反應研究。每個凝膠珠都可以看成是一個小的生物反應器，由于縮短了擴散距離，轉化率明顯提高，反應結束后細胞還可以回收并重復使用第99頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二三、雙水相轉化技術在微生物轉化中的應用雙水相轉化技術早期主要用于生物分子和細胞的分離與純化。這是由于生物產品如蛋白質和酶往往是胞內產品，需要經細胞破碎后才能提取、純化，細胞顆粒尺寸的變化給固一液分離帶來了困難，另外這些產品的活性和功能對pH值、溫度和離子強度等環(huán)境特別敏感為了克服這些缺點出現(xiàn)了雙水相技術。近年來，該技術開始應用于微生物轉化過程為生物催化過程引入了一種全新的反應體系第1

55、00頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 雙水相技術的核心是成相介質的選擇以及介質濃度的控制，它直接影響到底物和產物在兩相中的分配。雙水相體系基本上可以分為兩大婁：高聚物-高聚物體系和高聚物-低分子物質體系。第101頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二高聚物一高聚物體系是較常用的，典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖，當它們濃度達到一定時溶液變渾濁，靜止后形成兩個液層，上層富集了PEG，下層則是葡聚糖。Flygare等以聚乙二醇、葡聚糖及Brij35組成的雙水相體系，利用分支桿菌(Mycobacterium sp.)進行膽固醇側鏈降

56、解制備雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)研究，上層聚乙二醇富集了菌體，使得菌體具有較高的轉化活力，轉化速率可達到1.0mg(gh)。第102頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二四、超聲波技術在微生物轉化中的應用 超聲波是指頻率高于2104Hz的機械波。 與其他聲波一樣，超聲波可以在彈性介質中傳播。因為超聲波的波長很短，所以具有很強的定向傳播能力。同時由于超聲波在液體和固體中傳播時吸收衰減很小，因此具有很強的穿透力。根據超聲波的使用范圍，常可以將其分為兩類：一類是高頻超聲，頻率范圍為I10MHz，這一類主要用于醫(yī)學成像和化合

57、物結構的分析；另一類是功率超聲，頻率范圍為1560kHz，主要用于過程強化反應。第103頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二應用超聲波技術，首先受到機械力的作用，而機械能又可以轉化為熱能。此外，當聲強足夠大時，又能產生空化效應。超聲波的機械效應包括振動效應和聲流效應，指超聲在媒介中傳播時引起質點振動以及聲流對質點的剪切力；超聲波的熱效應指超聲波在媒介中傳播的過程中被傳播介質吸收轉變?yōu)闊崮?；超聲波的空化效應指超聲波激活氣泡各種動力學的表現(xiàn)形式。第104頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 超聲波技術應用于微生物轉化過程，主要是涉及固液傳質的生物體系

58、。超聲波可以產生上述的效應，較常規(guī)方法更有效地細化顆粒、增大傳質表面。這一過程主要發(fā)生于固液兩相界面及細胞壁、細胞膜附近的區(qū)域。在超聲場中，進行微生物轉化的環(huán)境和菌體均處于不斷的振動中。第105頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二對于環(huán)境而言，可加強分子的擴散效應，加速體系的混勻過程，減少各種代謝在液相中的梯度；對于菌體而言，可降低其細胞內胞液的黏度，提高膜的通透性。陽葵等等報道了采用超聲強度，超聲方式和時間對綠僵菌(Metarhizium sp)氧化16,17-環(huán)氧黃體酮的影響，并對微生物轉化體系中的超聲效應進行分析，第106頁，共151頁，2022年，5月20日，1

59、6點46分，星期二認為超聲使得反應物顆粒細化、增大了固液界面、加速了底物溶解和底物分子的傳遞；空化效應產生的沖擊力對細胞膜通透性發(fā)生變化，促進胞內酶的釋放及反應物向胞內的擴散。第107頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二五、有機介質中的微生物轉化 自從Buckland第一次利用有機溶劑四氯化碳(CCl4)為介質，采用諾卡菌(Nocardia sp.)將膽甾醇轉化為膽甾烯酮以來，在有機介質中進行微生物轉化成為了近幾年在該領域的研究熱點。因為在有機體系中可以有效地將產物及時分離出來，底物相應得到補充，從而消除底物和產物的抑制作用，提高轉化率。此外，由于一些底物或前體在水相中

60、的溶解度很小，通過用有機相作為介質可以大大提供其溶解度，即增加了底物或前體的加入濃度，在一定程度上也提高了轉化率。第108頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 一般來說，在有機介質中進行微生物轉化的過程中，有機溶劑與水形成兩相體系。包括有機介質(水不溶性)-發(fā)酵液和有機介質(水不溶性)-緩沖液兩種類型。Boren等在辛烷發(fā)酵液(1：1)組成的兩相體系中，將醋酸雄烯通過脫氫黃桿菌(Flavobacterium dehydrogenans)轉化為4-雄烯-3,17-二酮，第109頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二結果發(fā)現(xiàn)利用發(fā)酵液作為第二相有利于微