十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管凝膠電泳法(CE-SDS法)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程SOP

1、第 頁(yè)/共10頁(yè)十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管凝膠電泳法（CE-SDS法）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程類別工作標(biāo)準(zhǔn)文件文件編號(hào)XXXXX版本號(hào)V01頁(yè)碼共頁(yè)執(zhí)行日期年月日（禁止復(fù)?。徟?yè)起草人審核人審核人批準(zhǔn)人部門分析研究部分析研究部分析研究部質(zhì)量保證部姓名簽名日期年月曰年月曰年月曰年月曰頒發(fā)部門：質(zhì)量保證部分發(fā)部門：分析研究部拷貝號(hào)：NO/文件變更歷史版本號(hào)執(zhí)行日期變更原因、依據(jù)及變更內(nèi)容V002019年03月10日新起早目錄TOC o 1-5 h z1目的42范圍43定義44環(huán)境、健康和安全45培訓(xùn)46職責(zé)47程序（內(nèi)容）4 HYPERLINK l bookmark4 7.1原理47.2實(shí)驗(yàn)材料47.3操作步驟5

2、7.4結(jié)果分析97.5判定標(biāo)準(zhǔn)97.6注意事項(xiàng)98相關(guān)文件109參考文獻(xiàn)1010流程圖1011附錄10 HYPERLINK l bookmark8 十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管凝膠電泳法（CE-SDS法）測(cè)定記錄1 HYPERLINK l bookmark10 十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管凝膠電泳法（CE-SDS法）測(cè)定記錄（適用于多個(gè)樣品）11目的規(guī)范十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管凝膠電泳法（CE-SDS法）檢驗(yàn)的操作過(guò)程。范圍本規(guī)程適用于常規(guī)十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管凝膠電泳檢驗(yàn)，涉及到蛋白質(zhì)純度相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。定義CE-SDS:十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管凝膠電泳。4環(huán)境、健康和安全還原電泳中使用的巰基乙醇為揮發(fā)性液體，具有較

3、強(qiáng)烈的刺激性氣味，會(huì)刺激眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚，吞食有害，與皮膚接觸有毒，取液時(shí)穿戴適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)服、手套和護(hù)目鏡或面具。如不慎與眼睛接觸后，請(qǐng)立即用大量清水沖洗并征求醫(yī)生意見(jiàn)。該液體對(duì)水體環(huán)境能產(chǎn)生長(zhǎng)期污染等不良影響，切勿倒入下水道，應(yīng)倒入廢液桶，由專業(yè)部門回收。與空氣混合、受熱、明火可爆，如其燃燒可用二氧化碳、干粉類滅火劑。儲(chǔ)存庫(kù)房應(yīng)通風(fēng)低溫干燥，與氧化劑、食品分開(kāi)儲(chǔ)運(yùn)。5培訓(xùn)培訓(xùn)部門:分析研究部。培訓(xùn)對(duì)象:分析研究部相關(guān)人員。培訓(xùn)方式和時(shí)數(shù):自學(xué)，0.5小時(shí)?？己朔绞?問(wèn)答。6職責(zé)質(zhì)量保證部:負(fù)責(zé)監(jiān)督本文件的執(zhí)行。分析研究部:負(fù)責(zé)嚴(yán)格執(zhí)行本規(guī)程規(guī)定。程序（內(nèi)容）7.1原理該方法是指以彈性石英毛

4、細(xì)管為分離管道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)目標(biāo)蛋白在含有膠的溶液中的遷移速率不同而得到分離，較小分子量的分子遷移速度更快則其遷移時(shí)間短，較大分子的遷移速度慢則其遷移時(shí)間更長(zhǎng)。該方法主要能檢測(cè)分子量在10kDa以上的降解片段。實(shí)驗(yàn)材料7.2.1試藥與試液721.1超純水：電阻率不低于18.2MQcm，本方法所有試液均用超純水配制。SDS-MWAnalysisKitBeckman生產(chǎn)，貨號(hào)390953，該試劑盒中包含SDS-MW凝膠分離緩沖液、SDS-MW樣品緩沖液（樣品稀釋液）、酸性清洗液（0.1mol/L鹽酸溶液）、堿性清洗液（0.1mol/L氫氧化鈉溶液）、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（10kDaIntern

5、alStandard）。也可采用北京博思雅生化技術(shù)研究院生產(chǎn)的SDS試劑盒，貨號(hào)BSYK018,該試劑盒中包含CE-SDSGelBuffer、CE-SDSSampleBuffer（樣品稀釋液）。也可采用同類型其它品牌的商品化試劑盒。7.2.1.3烷基化溶液（0.25mol/L碘乙酰胺溶液）：稱取約0.046g碘乙酰胺，加入1ml超純水溶解混勻，可于28C避光保存7天。7.2.1.42-巰基乙醇。7.2.1.5系統(tǒng)適用性樣品：如無(wú)特殊規(guī)定，應(yīng)采用經(jīng)特殊處理后的系統(tǒng)適用性專用樣品（處理方法見(jiàn)各項(xiàng)目下規(guī)定）；也可選用相應(yīng)原研藥或各項(xiàng)目自制工作對(duì)照品。儀器與用具毛細(xì)管電泳儀：ABSCIEX公司PA80

6、0plus或CESI8000Plus。7.2.2.2毛細(xì)管卡盒：適用于7.2.2.1中毛細(xì)管電泳儀的毛細(xì)管卡盒。7.223毛細(xì)管：非涂層-熔融石英毛細(xì)管（內(nèi)徑50pm）,切割至總長(zhǎng)為30.2cm，高分辨率方法有效分離長(zhǎng)度為20cm，高效方法有效長(zhǎng)度為10cm。7.224孔塞：孔塞大小8（100pmX800pm）o7.225其他：CE通用樣品瓶、藍(lán)色橡膠通用樣品瓶瓶蓋、200pl微量管（內(nèi)插管）、移液器、水浴鍋（或金屬浴）、臺(tái)式離心機(jī)、離心管、超濾管。7.3操作步驟供試品制備7.3.1.1供試品稀釋（1）空白對(duì)照：取當(dāng)次檢測(cè)供試品對(duì)應(yīng)的緩沖液（如原液緩沖液或制劑緩沖液），分別用稀釋液（SDS樣品

7、緩沖液）進(jìn)行稀釋（稀釋倍數(shù)同供試品），作為空白對(duì)照。（2）系統(tǒng)適用性：取各項(xiàng)目下規(guī)定的系統(tǒng)適用性樣品，用稀釋液（SDS-MW樣品緩沖液）稀釋至終濃度約為1.0mg/ml。（3）原液：根據(jù)待測(cè)原液濃度，用稀釋液（SDS-MW樣品緩沖液）稀釋至終濃度約為1.0mg/ml。（4）成品：若為液體制劑，根據(jù)標(biāo)示含量，直接用稀釋液（SDS-MW樣品緩沖液）稀釋至終濃度約為l.Omg/ml；若為凍干制劑，則先用水復(fù)溶后，根據(jù)復(fù)溶后理論含量，再用稀釋液（SDS-MW樣品緩沖液）稀釋至終濃度約為l.Omg/ml。731.2非還原供試品溶液制備：取稀釋后供試品溶液各95卩1,各加入lOkDaInternalSta

8、ndard2卩1，再各加入0.25mo1/L碘乙酰胺溶液5卩1，渦旋混勻。7.3.1.3還原供試品溶液制備：取稀釋后供試品溶液各95卩1，各加入lOkDaInternalStandard2卩1，再各加入2-巰基乙醇5卩1，渦旋混勻。7.3.1.4將各供試品溶液在70C孵育，非還原供試品溶液孵育5分鐘，還原供試品溶液孵育510分鐘。冷卻至室溫后以每分鐘6000轉(zhuǎn)離心1分鐘。從樣品管中分別取出樣品至200卩1微量管中，將200卩1微量管放入CE通用樣品瓶中，蓋好藍(lán)色橡膠通用樣品瓶瓶蓋，放置樣品盤中待檢測(cè)分析。7.3.2緩沖液瓶的準(zhǔn)備和擺放按下圖和下表加入各入口緩沖液，并用藍(lán)色橡膠通用樣品瓶瓶蓋蓋好

9、。(fiO17-14ft)瀟壞第也24腑幡環(huán)料16ft）17-24ft)(IMS11ft)susMK分臬給沖撤（解劉加SDS勒分席蟻沖険【fii碑対吐(ifiOj-WK)盤瞅ABCDE圖7.1入口緩沖液擺放圖示表7.1入口緩沖液加入體積及用途CE通用瓶位置入口緩沖液加入體積入口緩沖液用途A1至A6超純水1.5ml沖洗毛細(xì)管B4至B6超純水1.5ml沖洗毛細(xì)管B1至B3SDS凝膠分離緩沖液1.2ml沖洗毛細(xì)管C1至C3SDS凝膠分離緩沖液1.1ml供試品分離D1至D3堿性清洗液（0.1mo1/L氫氧化鈉溶液）1.5ml每針之前沖洗毛細(xì)管El至E3酸性清洗液（O.lmol/L鹽酸溶液）1.5ml每

10、針之前沖洗毛細(xì)管Fl至F3超純水1.5ml每針之前沖洗毛細(xì)管7.3.2.2按下圖和下表加入各出口緩沖液，并用藍(lán)色橡膠通用樣品瓶瓶蓋蓋好。（解第17-24嵐）編牌JM6妁酬斛M胎備耳第】$薊mi嵋耳第1妣曲醐17-M船(17-21)17-24ft)（胸第1栩禾）17-24)曲理壞第肋拓曲的魏沖險(xiǎn)Ocm-16曲邯壞第已吧墉誹壞第14旳B:I)EF圖7.2出口緩沖液擺放圖示表7.2出口緩沖液加入體積及用途CE通用瓶位置出口緩沖液加入體積出口緩沖液用途A1至A6超純水1.5ml沖洗毛細(xì)管B1至B3超純水0.8ml沖洗SDS凝膠分離緩沖液的廢液瓶B4至B6超純水1.5ml沖洗毛細(xì)管C1至C3SDS凝膠分

11、離緩沖液1.1ml供試品分離D1至D3超純水0.8ml沖洗堿性清洗液的廢液瓶E1至E3超純水0.8ml沖洗酸性清洗液的廢液瓶F1至F3超純水0.8ml沖洗超純水的廢液瓶7.3.3編輯方法并調(diào)用方法表7.3電泳操作參數(shù)（高分辨率分離法）分離參數(shù)參數(shù)設(shè)置檢測(cè)器波長(zhǎng)214nm或220nm,帶寬10nm毛細(xì)管溫度20C樣品溫度102C分析方法步驟事件總結(jié)1堿性溶液沖洗0.1mol/L氫氧化鈉，70psi下3分鐘，向前2酸性性溶液沖洗0.1mol/L鹽酸，70psi下1分鐘，向前3水沖洗70psi下1分鐘，向前4SDS凝膠沖洗/灌裝SDS凝膠灌裝，70psi下10分鐘，向前5凝膠后浸潤(rùn)1水浸潤(rùn)0.0分鐘

12、6凝膠后浸潤(rùn)2水浸潤(rùn)0.0分鐘7樣品注射5kv下20秒，反相極性8注射后浸潤(rùn)水浸潤(rùn)0.0分鐘9電壓分離15kv下40分鐘，溫度為20C,Ramp=1.00分鐘，反相極性10自動(dòng)歸零5分鐘表7.4電泳操作參數(shù)（高效分離法）分離參數(shù)參數(shù)設(shè)置檢測(cè)器波長(zhǎng)214nm或220nm，帶寬10nm毛細(xì)管溫度20C樣品溫度102C分析方法步驟事件總結(jié)1堿性溶液沖洗0.1mol/L氫氧化鈉，70psi下3分鐘，反向2酸性性溶液沖洗0.1mol/L鹽酸，70psi下1分鐘，反向3水沖洗70psi下1分鐘，反向4SDS凝膠沖洗/灌裝SDS凝膠灌裝，70psi下10分鐘，反向5凝膠后浸潤(rùn)1水浸潤(rùn)0.0分鐘6凝膠后浸潤(rùn)2

13、水浸潤(rùn)0.0分鐘7樣品注射5kv下20秒，正常極性8注射后浸潤(rùn)水浸潤(rùn)0.0分鐘9電壓分離15kv下30分鐘，溫度為20C,Ramp=1.00分鐘，正常極性10自動(dòng)歸零2分鐘7.3.4供試品檢測(cè)：將供試品位置號(hào)編輯入序列表中，輸入相應(yīng)供試品名稱與文件名稱，并調(diào)用相關(guān)方法。序列表中樣品排列順序依次為毛細(xì)管活化、空白對(duì)照、系統(tǒng)適用性1、供試品、系統(tǒng)適用性2、關(guān)機(jī)，各進(jìn)樣檢測(cè)一次（其中系統(tǒng)適用性1、系統(tǒng)適用性2為同一管樣品）；若稀釋后供試品溶液終濃度小于l.Omg/ml,貝U可適當(dāng)增加序列表中樣品注射時(shí)間以增加進(jìn)樣量。運(yùn)行序列開(kāi)始檢測(cè)分析。7.4結(jié)果分析還原條件：按面積歸一化法計(jì)算，以重鏈、非糖基化重

14、鏈和輕鏈的校正峰面積分別占所有校正峰面積之和的百分比分別計(jì)算重鏈、非糖基化重鏈和輕鏈的純度，三者之和即為產(chǎn)品純度。（注：根據(jù)樣品功能決定總純度是否包含非糖基化重鏈）。非還原條件：按面積歸一化法計(jì)算，以供試品主峰的校正峰面積占所有校正峰面積之和的百分比計(jì)算單體的純度。7.5判定標(biāo)準(zhǔn)空白對(duì)照判定標(biāo)準(zhǔn)：與系統(tǒng)適用性圖譜進(jìn)行比較，在供試品降解片段、單體、聚合體的遷移時(shí)間范圍內(nèi)，空白對(duì)照應(yīng)無(wú)明顯的干擾峰出現(xiàn)。系統(tǒng)適用性判定標(biāo)準(zhǔn)非還原型電泳或還原后呈現(xiàn)單一主帶的還原型電泳：系統(tǒng)適用性1與系統(tǒng)適用性2圖譜中主峰遷移時(shí)間的極差應(yīng)W2.0min；主峰校正峰面積百分比極差應(yīng)W0.6%。7.5.2.2還原后呈現(xiàn)輕鏈

15、、重鏈的還原型電泳：系統(tǒng)適用性1與系統(tǒng)適用性2圖譜中重鏈遷移時(shí)間的極差應(yīng)W2.0min；輕鏈校正峰面積百分比極差應(yīng)W0.6%；重鏈校正峰面積百分比極差應(yīng)W0.6%。7.5.2.3若空白對(duì)照與系統(tǒng)適用性同時(shí)滿足要求，貝本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，否貝實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，供試品需復(fù)檢。7.6注意事項(xiàng)為保證供試品能與SDS樣品緩沖液中的SDS充分結(jié)合，供試品的稀釋倍數(shù)應(yīng)三2倍。緩沖液瓶的數(shù)量取決于樣品的個(gè)數(shù)，保證每810個(gè)循環(huán)都能使用新的緩沖液。若供試品溶液的緩沖體系會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如純化中間樣品），可用截距為10kD的超濾管置換緩沖體系后，再進(jìn)行樣品檢測(cè)。如果供試品初始濃度較低，可用截距為10kD的超濾管進(jìn)行超濾

16、濃縮，使終濃度接近2.0mg/ml。依據(jù)進(jìn)樣口離檢查窗口的距離，分離方法分為高分辨率方法和高效分離方法。在高分辨率方法中，將樣品放置在左側(cè)樣品托盤中，入口緩沖液放置在左側(cè)緩沖液托盤，出口緩沖液放置在右側(cè)緩沖液托盤；在高效分離方法中，將樣品放置在右側(cè)樣品托盤中，入口緩沖液和出口緩沖液互換位置。根據(jù)分子量大小選擇高分辨率方法和高效分離方法，建議分子量約為3070kD的供試品選擇高分辨率方法，分子量大于70kD的供試品選擇高效方法。具體選用何種分離方法見(jiàn)各項(xiàng)目下規(guī)定。方法中各參數(shù)，如還原、非還原處理時(shí)孵育溫度、孵育時(shí)間等，可依據(jù)各項(xiàng)目在該方法下的驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。相關(guān)文件參考文獻(xiàn)BECKMANCOU

17、LTER.PA800plusPharmaceuticalAnalysisSystem:SDS-MWAnalysisM.B25803AA,January2013BECKMANCOULTER.PA800plusPharmaceuticalAnalysisSystem:IgGPurity/HeterogeneityAssayM.B25801AA,January20139.3中國(guó)藥典2015年版，通則3127“單抗分子大小變異體測(cè)定法（CE-SDS法）”10流程圖11附錄十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管凝膠電泳法（CE-SDS法）測(cè)定記錄品名批號(hào)編號(hào)規(guī)格開(kāi)檢日期年月日檢驗(yàn)依據(jù)一、實(shí)驗(yàn)材料1、試藥與試液名稱編號(hào)/批

18、號(hào)（來(lái)源）系統(tǒng)適用性樣品（）SDS凝膠分離緩沖液稀釋液（SDS樣品緩沖液）堿性清洗液（O.lmol/L氫氧化鈉溶液）酸性清洗液（O.lmol/L鹽酸溶液）InternalStandard（kD）2-巰基乙醇碘乙酰胺溶液（0.25mol/L）復(fù)溶溶劑（滅菌注射用水）原液緩沖液（）成品緩沖液（）2、儀器與用具名稱生產(chǎn)廠家/型號(hào)設(shè)備編號(hào)毛細(xì)管電泳儀ABSCIEX/PA800plusABSCIEX/CESI8000Plus水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司/DKB-501S其它第1頁(yè)/共5頁(yè)第 頁(yè)/共5頁(yè)臺(tái)式高速（冷凍）離心機(jī)Eppendorf/CentrifUge5418R其它金屬浴Thermo/Dig

19、italCoolingDrybath其它UncoatedABSCIEX（內(nèi)徑um）,有效分離長(zhǎng)度：cm,毛細(xì)管批Capillary號(hào)：，毛細(xì)呂編號(hào)：二、操作步驟1、待測(cè)樣品稀釋空白對(duì)照：取緩沖液卩1,加入稀釋液卩1,混勻，稀釋倍數(shù)為倍。系統(tǒng)適用性：樣品初始濃度為mg/ml,取對(duì)照品卩1,加入稀釋液卩1，混勻，稀釋倍數(shù)為倍，稀釋后終濃度為mg/ml。原液：原液蛋白質(zhì)初始濃度為mg/ml，取待測(cè)原液卩1，加入稀釋液卩1,混勻，稀釋倍數(shù)為倍，稀釋后終濃度為mg/ml。成品（液體制劑）：成品標(biāo)示量為，取待測(cè)成品卩1,加入稀釋液卩1,混勻，稀釋倍數(shù)為倍，稀釋后終濃度為mg/ml。成品（凍干制劑）：成品標(biāo)

20、示量為，取成品用ml/瓶的注射用水復(fù)溶。取復(fù)溶后成品卩1,加入稀釋液卩1,混勻，稀釋倍數(shù)為倍，稀釋后終濃度為mg/ml。其它2、供試品溶液制備非還原供試品溶液制備：分別取稀釋后樣品溶液各卩1,加入lOkDaInternalStandard卩1,再加入0.25mmo1/L碘乙酰胺水溶液卩1,渦旋混勻后在C孵育分鐘。還原供試品溶液制備：分別取稀釋后樣品溶液各卩1,加入lOkDaInternalStandard卩1,再加入2-巰基乙醇卩1,渦旋混勻后供試品溶液在C孵育分鐘。3、將制備好的供試品溶液冷卻至室溫后以每分鐘6OOO轉(zhuǎn)離心l分鐘。從樣品管中分別取出樣品至200卩1微量管中，將200卩1微量管

21、放入CE通用樣品瓶中，蓋好藍(lán)色橡膠通用樣品瓶瓶蓋，放置樣品盤中待分析。4、緩沖液瓶的準(zhǔn)備：SDS凝膠分離緩沖液分別加1.2ml（B列）與1.1ml（C列），超純水、酸性清洗液及堿性清洗液分別加1.5ml,廢液瓶中加超純水0.8ml。按照下圖位置放入相應(yīng)的緩沖液瓶。分離方法：高分辨率方法高效方法入口緩沖液，放置于側(cè)緩沖液托盤（入口緩沖液擺放見(jiàn)下圖）17-24at)17-14ft)鮒umi樹(shù)水H-24汨9濮膠廿離軟神秋E裾環(huán)第找】（M第檢】恢環(huán)第*24獻(xiàn)】（M第打-対撫孵U暢環(huán)弟仃-14撫趙純水ss8UH勰梯弧$51膠廿眾捌哦備環(huán)第丄咖【瞭F丄咖swsSUH燃柵撫srosJW冏港（解第i-m）哉怕制液（栢耳需口撫趣*術(shù)ABCDE出口緩沖液，放置于側(cè)緩沖液托盤（出口緩沖液排放見(jiàn)下圖）越魏水瞬環(huán)至17-24如趙純水|憎訊遨17-24）趙繪水（詡壞第I-*祝（韜壞第F3祝）趙純水#17-24ft)【梢環(huán)第H-243OSDS礙腔仆甜扭沖蔽（耆環(huán)第1閃4程）17-24ft)胡卑削打-刑沈、(#17-24ft)甜亮水熾耳第9-1&次SDS琥夜仆由盤沖嵌BCDE6、在計(jì)算機(jī)中打開(kāi)軟件32Karat,建立新的序列程序，輸入對(duì)應(yīng)的供試品名稱與位置，并選擇相應(yīng)的分離方法對(duì)供試品進(jìn)行分析測(cè)定。供試品分離方法關(guān)鍵參數(shù)見(jiàn)下表。電泳參數(shù)設(shè)定值樣品進(jìn)樣5kV電動(dòng)進(jìn)樣秒樣品分離15kV下