免疫化學實驗操作指導書：免疫血清的制備

1、PAGE PAGE 269實驗十三 免疫化學實驗 免疫化學實驗包括免疫血清的制備、沉淀反應定量法、對流免疫電泳、單向定量免疫電泳（火箭電泳）、雙向定量免疫電泳（交叉免疫電泳）、微量免疫電泳以及單向雙向免疫擴散、酶聯(lián)免疫吸附測定等。從內(nèi)容上看這幾個實驗具有一定的連貫性，是免疫化學最基本的實驗方法。 實驗(一) 免疫血清的制備一. 實驗目的：制備抗特定抗原的動物抗血清。二. 器材與試劑： 1. 實驗動物：兔子（25003000克） 2. 抗原：（小牛血清） 3. 佐劑：福氏完全佐劑 4. 乳化攪拌器 5. 注射器及針頭 6. 手術(shù)器械：剪刀，手術(shù)刀，線，血管鉗，塑料導管（2mm） 7. 恒溫箱 8

2、. 離心機及離心管 9. 三角瓶（100ml） 10. 酒精棉球 11. 疊氮化鈉(NaN3)12. pH 7.2磷酸緩沖生理鹽水（PBS）三. 實驗方法 制備高效價和高特異性的免疫血清是免疫化學實驗的第一步，免疫血清也是免疫學實驗必不可少的生物制劑。實驗程序包括動物免疫注射，抗血清效價的測定，全部放血及血清的分離與保存四步。 1.免疫兔子免疫周次不完全佐劑(ml) 抗原小牛血清(ml) PBS(ml)滅活結(jié)核桿菌免疫用量 ml/只 注射部位石蠟油 羊毛脂一0.51.51.50.50.1-0.2mg/ml 2四只腳掌二0.51.511 2腋窩 腹股溝 脊背三11 2腹腔四0.30.2 0.5耳

3、緣靜脈福氏完全佐劑常用的制備方法有研磨法和注射器法兩種。研磨法方法如下：將經(jīng)高壓除菌的石蠟油0.5ml和羊毛脂1.5ml放入無菌的乳缽內(nèi)，再慢慢滴入小牛血清。PBS及已滅活的結(jié)核桿菌，邊滴邊研磨，直至成為乳白色粘稠的油包水乳劑。檢驗方法是取一滴乳劑滴入水面（冷水），如不擴散，則完全佐劑已研磨成功。此配方為一只兔子的免疫用量，也可按比例多組聯(lián)合研磨。 注射器法：將兩個注射器中間接上一根短的膠皮，注射器左右推拉，使注射器內(nèi)的溶劑充分乳化，直至形成油包水乳劑。2. 免疫血清效價的測定第四周時通過耳緣靜脈采血1ml，先將血液置室溫30分鐘，離心（3500rpm）10分鐘，取出血清。用雙向免疫擴散法測定

4、抗血清的效價，以確定免疫效果。3. 頸動脈采血將禁食12小時或隔夜的兔子仰面固定于固定板上，頭部放低，暴露出頸部，剪開頸中部皮膚，約10cm長。沿氣管分離皮下組織，直至暴露氣管前的胸鎖乳突肌。仔細分開胸鎖乳突?。ㄗ⒁馕鸺魯嘈⊙埽诩∈旅婵拷鼩夤軆蓚?cè)，可以看到搏動的頸動脈。取二把血管鉗在血管的遠心端（近頭部）夾緊，一把夾住近心端的血管（在近心端用線扎好與血管相連的神經(jīng)，然后用剪子在二把血管鉗中間的血管上剪一小口插入塑料放血管（用線固定），輕輕放開近心端的止血鉗，使血很快射入三角瓶中。直至血流緩慢時（也可用同法在另一側(cè)動脈內(nèi)插管放血）將固定板后肢端抬高，增加放血量。將三角瓶蓋好，放置室溫一小

5、時，再放4過夜，待血塊收縮后分離血清（離心3500rpm,10分鐘）。4血清的保存如要長時間存放，56滅活，在血清里添加0.1%疊氮化鈉，將血清進行小量分裝，放置低溫冰箱內(nèi)保存。Some commonly used adjuvantsAdjuvantComposition and useFreunds complete adjuvant(FCA)Mineral oil containing heat-killed mycobacteria(Mycobacterium tuberculosis)Used as emulsion with aqueous antigenFreunds incomp

6、lete adjuvant(FIA)Mineral oilUsed as emulsion with aqueous antigenAlumComplex aluminium salts. There are various versions of the adjuvant: some can be purchased ready for use(e.g. Alhydrogel); others can be prepared in the laboratory by mixing various salts, e.g. NaHCO3, and aluminium potassium sulp

7、hate. Aqueous antigen is absorbed to gelBentonite Wyoming sodium bentonite(Montmorillonite) as gel. Aqueous antigen adsorbed to surfaceQuil ASaponin derived from Quillaja saponana Molina(South American tree). Mixed to form a complex with aqueous antigen.Muramyl dipeptide(MDP)N-Acetylmuramyl-L-alanyl

8、-D-isoglutamine. Mixed with aqueous antigen. Various derivations of MDP are aqueous antigenMonophosphoryl lipid A(MPL)Used in various formulations, often as an emulsion with oils. Antigen included in emulsionBacillus pertussisKilled organisms mixed with aqueous antigenFCA is probably the most potent

9、 adjuvant but may be inappropriate for some purposes.Source: Reproduced from M.A.Kerr and R.Thorpe, Immunochemistry Labfax(1994), Bios Scientific, Oxford.Examples of immunization protocols that have been used successfullySpeciesPrimingRest period(weeks)First boostRest period(weeks)Subsequent boostsM

10、ice, rats and guinea pigs5-100g antigen in FCA or other adjuvant, s.c. or i.m.2-350-100g antigen in FIA, other adjuvant or PBS, i.m. or s.c.35-100g antigen in FIA or PBS, i.p., s.c., i.m. or i.v.Rabbits50-250g antigen in FCA or other adjuvant, i.d., i.m. or s.c.3-450-250g antigen in FIA or other adj

11、uvant or PBS, i.m., or s.c.4 or longer50-250g antigen in FIA or PBS, i.m., s.c. or i.v.Sheep and goats 250g-10mg antigen in FCA or other adjuvant, i.m.,s.c. or i.d.4250g-10mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m.or s.c. 4-8 or longer250g-10mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m., s.c.or i.v.Horse

12、s and donkeys250g-50mg antigen in FCA or other adjuvant, i.m.,s.c. or i.d.4250g-50mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m.or s.c.4-8 or longer250g-50mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m.or s.c.Primates50g-1mg antigen in adjuvant, i.m. or s.c.50g-1mg antigen in adjuvant or PBS, i.m., s.c.or i.v.

13、4-8 or longer50g-1mg antigen in adjuvant or PBS, i.m., s.c.or i.d.Chickens30-200g antigen in FCA or other adjuvant, i.m.2-330-200g antigen in FIA or other adjuvant, i.m.3 or longer30-200g antigen in FIA or other adjuvant or PBS, i.m.FCA, Freunds complete adjuvant; FIA, Freunds incomplete adjuvant; P

14、BS, phosphate-buffered saline; i.p., intraperitoneally; s.c., subcutaneously; i.m., intramuscularly; i.v., intravenously; i.d., intradermally.Source: Reproduced from M.A.Kerr and R.Thorpe, Immunochemistry Labfax(1994), Bios Scientific, Oxford.實驗(二) 沉淀反應定量法一實驗目的：測定抗血清中特異性抗體的濃度。二器材與試劑:137恒溫箱2紫外分光光度計3冰箱4塑料離心管（15ml）5抗原（小牛血清）6免疫血清7pH 7.2磷酸緩沖生理鹽水（PBS）80.1M NaOH9高速離心機三實驗方法在10支塑料離心管里分別加入1，10，20，50，100，150，250，350，450l的抗原溶液，用PBS將每支離心管里的溶液總量加至450l 。然后分別向各支離心管里再加入100l的抗血清