醫(yī)學(xué)免疫學(xué)課件：凝集和沉淀反應(yīng)

1、凝集和沉淀反應(yīng)定義： 細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞或細(xì)胞性抗原等顆粒性抗原，或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，它們與相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，形成肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱(chēng)為凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)(Agglutination)效價(jià)或滴度(Titer): 將標(biāo)本進(jìn)行一系列對(duì)比稀釋后，與相應(yīng)抗體反應(yīng)，進(jìn)行檢測(cè)，以出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度進(jìn)行半定量檢測(cè)凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)的發(fā)生分為： 抗原抗體的特異結(jié)合 出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的顆粒凝集 凝集反應(yīng)是一個(gè)定性檢測(cè)方法凝集反應(yīng)包括： 直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩大類(lèi)第一節(jié) 凝集反應(yīng)的特點(diǎn)第一節(jié) 直接凝集技術(shù) （Direct agglutina

2、tion test)第二節(jié) 間接凝集技術(shù) ( Indirect agglutination test)第三節(jié) 其它凝集技術(shù)凝集反應(yīng)直接凝集試驗(yàn): 細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體反應(yīng)，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象凝集原(Agglutinogen):凝集反應(yīng)中的抗原凝集素(Agglutinin):參與凝集反應(yīng)的抗體第二節(jié) 直接凝集技術(shù)(Slide agglutination test)原理： 通常以已知抗體作為診斷血清，與待 測(cè)顆?？乖陔娊赓|(zhì)存在下，作用一定時(shí)間，通過(guò)凝集與否，進(jìn)行細(xì)菌或紅細(xì)胞定性（或定型）方法評(píng)價(jià)：特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速一、玻片凝集試驗(yàn)原理： 已知的細(xì)菌或紅

3、細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體在試管中直接凝集的半定量試驗(yàn)，多用來(lái)測(cè)定抗體方法評(píng)價(jià)： 特異性易受條件影響，敏感性不高臨床應(yīng)用： 外斐試驗(yàn)、肥達(dá)試驗(yàn)、交叉配血試驗(yàn)(Tube agglutination test)二、試管凝集試驗(yàn)包含內(nèi)容： 一、載體種類(lèi)及其處理方法 二、間接凝集技術(shù)類(lèi)型 三、間接血凝試驗(yàn) 四、膠乳凝集試驗(yàn) 五、間接凝集試驗(yàn)的應(yīng)用第三節(jié) 間接凝集技術(shù)間接凝集試驗(yàn)： 用人工方法將可溶性抗原(或抗體）吸附或偶聯(lián)于載體上，使之成為致敏載體顆粒，再與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)特異性的凝集現(xiàn)象間接凝集試驗(yàn)概念載體(Carrier)： 試驗(yàn)體系中與免疫無(wú)關(guān)的大小適當(dāng)?shù)念w粒

4、致敏(Sensitized): 抗原(或抗體)偶聯(lián)于顆粒表面的過(guò)程致敏顆粒 (Sensitized particle): 吸附有已知抗原或抗體的顆粒相關(guān)概念緩慢2.5%的OHC-(CH2)3-CHO(戊二醛)室溫下攪拌2h用PBS稀釋成0.5%紅細(xì)胞懸液OHC-(CH2)3-HC=抗原(或抗體)-NH2的緩沖液* 電磁攪拌N-抗原(或抗體)* 抗原于pH7.2PBS中進(jìn)行；抗體于pH4.0醋酸中進(jìn)行 加入 紅細(xì)胞載體制備一、載體種類(lèi)及其處理方法離心聚苯乙烯膠乳-抗原(或抗體)過(guò)量抗原(或抗體)抗原-聚苯乙烯膠乳的絮狀凝集性能不穩(wěn)定，容易解離。 混合聚苯乙烯膠乳中和聚苯乙烯膠乳表面電荷除去游離配

5、體膠乳顆粒物理交聯(lián)法pH值7.08.2的PBS，離子強(qiáng)度0.05，孵育45min增大配體與載體表面的距離聚苯乙烯膠乳-CO-NH-抗原(或抗體)減少空間位阻氨基己酸抗原(或抗體)-NH2性能穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)，特異性、敏感性優(yōu)于物理法。 混合羧化聚苯乙烯膠乳碳化二亞胺縮合成膠乳顆?；瘜W(xué)交聯(lián)法根據(jù)致敏用的試劑和反應(yīng)方式分為2.反向間接凝集試驗(yàn) (Reverse indirect agglutination test)3.間接凝集抑制試驗(yàn) (Indirect agglutination inhibition test)1.(正向)間接凝集試驗(yàn) （Indirect agglutination test

6、)二、間接凝集技術(shù)類(lèi)型載體可溶性抗原致敏致敏顆粒NS凝集顆粒用特異性抗原致敏載體，檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體的方法待測(cè)抗體(正向)間接凝集試驗(yàn)用特異性抗體致敏載體，檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗原的方法載體已知抗體致敏致敏顆粒NS凝集顆粒待測(cè)抗原反向間接凝集試驗(yàn)待測(cè)抗原已知抗體無(wú)結(jié)合抗原抗體分散NS致敏顆粒有凝集顆粒為陰性間接凝集抑制試驗(yàn)將待測(cè)樣品中的抗原與已知抗體作用后，再與相應(yīng)抗原-乳膠顆?；旌稀Ｒ驔](méi)有游離抗體的存在，乳膠顆粒表面的抗原不能與抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，即凝集被抑制如：孕婦尿液中含HCG，用抗HCG與之結(jié)合后，再加HCG-乳膠，則不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象待測(cè)抗原已知抗體無(wú)結(jié)合抗原抗體分散NS致敏顆粒有凝集顆

7、粒為陰性間接凝集抑制試驗(yàn)用抗原致敏載體及相應(yīng)抗體作為診斷試劑，用于檢測(cè)標(biāo)本中是否存在與致敏載體相同的抗原待測(cè)抗原已知抗體特異結(jié)合抗原抗體復(fù)合物NS致敏顆粒無(wú)凝集顆粒為陽(yáng)性用抗原致敏載體及相應(yīng)抗體作為診斷試劑，用于檢測(cè)標(biāo)本中是否存在與致敏載體相同的抗原間接凝集抑制試驗(yàn)正向間接 已知抗原 無(wú) 抗體 膠乳凝集 凝集試驗(yàn) 致敏載體 RBC凝集致敏顆粒 第二試劑 待測(cè)物 陽(yáng)性結(jié)果間接凝集 已知抗原 抗體 抗原 膠乳不凝集 抑制試驗(yàn) （或抗體） （或抗原 ） 抗體 膠乳不凝集 致敏載體 陰性結(jié)果凝集反向間接 已知抗體 無(wú) 抗原 膠乳凝集 凝集試驗(yàn) 致敏載體 RBC凝集 * 間接凝集抑制試驗(yàn)：需要先加入已知

8、與致敏顆粒相同的抗原(或抗體) 進(jìn)行中和。間接凝集試驗(yàn)比較（Indirect hemagglutination test)原理： 用已知的可溶性抗原(或抗體）吸附人的“O”型血紅細(xì)胞、綿羊或家兔的紅細(xì)胞，制成致敏血紅細(xì)胞,與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)參與下，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。方法評(píng)價(jià)： 敏感性較強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速、成本低廉三、間接血凝試驗(yàn)(被動(dòng)血凝試驗(yàn))紅細(xì)胞抗原致敏致敏紅細(xì)胞NS紅細(xì)胞凝集待測(cè)抗體間接血凝試驗(yàn)結(jié)果示意圖-+間接血凝試驗(yàn)原理： 將可溶性抗原(或抗體）與膠乳結(jié)合后，直接與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生凝集反應(yīng)方法評(píng)價(jià)： 1.膠乳顆粒的性能比RBC穩(wěn)定、均一性好 2.與抗

9、原結(jié)合的能力及凝集性能不如RBC 四、膠乳凝集試驗(yàn)1. 抗體的檢測(cè) 檢測(cè)細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)感染后產(chǎn)生的抗體及自身抗體和藥物抗體 自身免疫病患者的抗體的檢測(cè) 變態(tài)反應(yīng)患者的抗體的檢測(cè)2. 抗原的檢測(cè) 較少使用五、間接凝集試驗(yàn)的應(yīng)用一、抗球蛋白試驗(yàn) (Antiglobulin test)二、協(xié)同凝集試驗(yàn) (Coagglutination test) 三、冷凝集試驗(yàn) (Cold agglutination test)四、自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) (Auto-erythrocyteagglutinationtest )第四節(jié) 其它凝集技術(shù)類(lèi)型：(Antiglobulin test) 1.直接法 2.間接法一

10、、抗球蛋白試驗(yàn)(Coombs試驗(yàn)) 原理： 把產(chǎn)生“不完全抗體”的機(jī)體正常血清球蛋白，注射到異種動(dòng)物，使其產(chǎn)生抗球蛋白。此種抗球蛋白加入表面結(jié)合有不完全抗體的紅細(xì)胞的復(fù)合物中，就能出現(xiàn)可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象作用：檢測(cè)紅細(xì)胞表面結(jié)合的不完全抗體臨床意義：新生兒溶血癥和自身免疫性溶血性貧血的診斷RBC為Rh+7S的IgG體內(nèi)發(fā)生+抗IgG體外測(cè)試抽血1. Coombs試驗(yàn)直接法 作用：檢測(cè)游離在血清中的不完全抗體臨床意義：輸血前的交叉配血、不相溶輸血后的抗體檢測(cè)。檢測(cè)母體 Rh（D）抗體有助于及早發(fā)現(xiàn)及避免新生兒溶血癥RBC為Rh+不完全抗體+抗IgG體外測(cè)試2. Coombs試驗(yàn)間接法 特點(diǎn)： 自身紅細(xì)

11、胞凝集試驗(yàn)與一般間接血凝試驗(yàn)不同之處為反應(yīng)中的紅細(xì)胞是未經(jīng)致敏的受檢者新鮮紅細(xì)胞臨床應(yīng)用： HIV、HBsAg的檢測(cè)二、自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(Auto-erythrocyteagglutination test )二、自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(Auto-erythrocyteagglutination test )血液標(biāo)本中的紅細(xì)胞和抗原(或抗體)分別與試劑中的抗紅細(xì)胞單克隆抗體和特異性抗體(或抗原)反應(yīng)，形成網(wǎng)絡(luò)而導(dǎo)致紅細(xì)胞的凝集。(Coagglutination test)原理： SPA(葡萄球菌A蛋白)能與血清中的IgG類(lèi)抗體的Fc段非特異性結(jié)合，而兩個(gè)Fab段暴露在葡萄球菌菌體表面，仍然保持正

12、常的抗體活性，與特異性抗原相遇時(shí)，能出現(xiàn)特異的凝集現(xiàn)象應(yīng)用： 微生物的快速診斷、定種及定型；以協(xié)助傳染病的早期診斷三、協(xié)同凝集試驗(yàn)IgGSPASPA- IgG 待測(cè)抗原SPA- IgG-待測(cè)抗原凝集顆?；旌?加入?yún)f(xié)同凝集試驗(yàn)原理概念：冷凝集素是紅細(xì)胞某些抗原的自身抗體，只能在低溫時(shí)與其相應(yīng)的抗原結(jié)合 (Cold Agglutination test)原理：冷凝集反應(yīng)在4時(shí)最強(qiáng)烈，紅細(xì)胞凝集最明顯；溫度升高后，抗原抗體復(fù)合物解離，凝塊消失意義：冷凝集素增高常見(jiàn)于：?jiǎn)魏思?xì)胞增多癥和支原體肺炎，惡性淋巴瘤呈現(xiàn)慢性增高四、冷凝集試驗(yàn)抗原表位隱含，不能與抗體結(jié)合混合暴露表位的抗原表位與抗體結(jié)合混合374

13、37冷凝集試驗(yàn)原理 第一節(jié) 液相內(nèi)沉淀試驗(yàn) 第二節(jié) 凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn) 第三節(jié) 免疫電泳技術(shù) 第四節(jié) 免疫濁度分析技術(shù)沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng):(precipitation)液相內(nèi)沉淀試驗(yàn)：凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體,在適宜條件下發(fā)生特異性結(jié)合,所出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象指抗原抗體在以生理鹽水或其它無(wú)機(jī)鹽緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)的液相內(nèi)自由接觸,短時(shí)間可出現(xiàn)反應(yīng)指抗原抗體在瓊脂糖內(nèi)擴(kuò)散或凝膠內(nèi)擴(kuò)散試驗(yàn)沉淀反應(yīng)概念一、絮狀沉淀試驗(yàn)： (Flocculation test)二、環(huán)狀沉淀試驗(yàn): (Ring precipitation test)三、免疫濁度試驗(yàn): (Immunoturbidimetry)第一節(jié) 液相沉淀

14、試驗(yàn)抗原溶液與相應(yīng)抗體溶液混合,在電解質(zhì)存在下,抗原與抗體結(jié)合出現(xiàn)可見(jiàn)的絮狀沉淀技術(shù)類(lèi)型1 抗原稀釋法方法評(píng)價(jià)和應(yīng)用：原理3 棋盤(pán)格法2 抗體稀釋法用于測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的最適比敏感度較低、簡(jiǎn)便、易受抗原抗體比例影響最適比.一、絮狀沉淀試驗(yàn)1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量不變振搖 混勻、37孵育沉淀量不同出現(xiàn)沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖絮狀沉示意圖淀AgAbAg表1. 最適比的方陣測(cè)定法抗體稀釋度抗原稀釋度1/101/201/401/801/1601/3201/640對(duì)照1/5+-1/10+-1/20+-1/40-+-1/80-+-從表

15、1 可看出方陣法可較正確找出抗原與抗體的最適比.如抗體用 1:40 ,抗原則 1:320 稀釋如抗原是 1:160 ,抗體則用 1:20 恰當(dāng).注: “+”為沉淀物; “+”為最適比. 3.棋盤(pán)格法(方陣法): 用恒定的抗原量與不同程度稀釋的抗體反應(yīng)，計(jì)算結(jié)果同上法，得出的是抗體結(jié)合價(jià)和最適比 抗原和抗體同時(shí)稀釋?zhuān)梢淮瓮瓿煽乖涂贵w的滴定，并找出抗原和抗體的最適比2.抗體稀釋法:一、絮狀沉淀試驗(yàn)敏感度較低、只能定性不能定量、缺乏多對(duì)分辨力；但是簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用；鑒定血跡、診斷炭疽把抗原液小心加于已含抗體液的細(xì)試管液面上,當(dāng)對(duì)應(yīng)抗原與抗體相遇時(shí),在界面處形成清晰的乳白色沉淀環(huán)方法評(píng)價(jià)和應(yīng)用：原

16、理(ring precipitation test)二、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)AbAg環(huán)狀沉淀示意圖沉淀管內(nèi)徑1.52mm15min出現(xiàn)沉淀環(huán)為陽(yáng)性30min不出現(xiàn)沉淀環(huán)為陰性操作步驟可對(duì)各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)的抗體在二者比例合適時(shí)特異結(jié)合，在特殊的緩沖液中快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度方法評(píng)價(jià)和應(yīng)用：原理(Immunoturbidimetry)三、免疫濁度試驗(yàn)一、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn): (Single gel diffusion test)二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)： (Double gel diffusion test)第二

17、節(jié) 凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn) 敏感度1.25mg/L、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、重復(fù)性和線性均好將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測(cè)抗原在凝膠中自由擴(kuò)散，與相應(yīng)抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相關(guān)方法評(píng)價(jià)原理(single gel diffusion test)一、單項(xiàng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（沉淀環(huán)直徑)2抗原濃度1.抗體混于凝膠中2.抗原加入孔內(nèi)3.抗原自由擴(kuò)散標(biāo)準(zhǔn)品抗原濃度測(cè)定不同病人抗原濃度測(cè)定1.測(cè)定沉淀環(huán)直徑2.在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找 相應(yīng)抗原濃度一、單項(xiàng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)一、單項(xiàng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 1.抗原分子量：與擴(kuò)散速度、沉淀環(huán)反相關(guān) 6.瓊脂板厚度：與沉淀環(huán)反相關(guān) 2.抗體種類(lèi)：兔抗血清優(yōu)于馬、羊 3.抗體稀釋度：

18、抗體濃度大沉淀環(huán)小 4.擴(kuò)散時(shí)間：抗原含量高，擴(kuò)散時(shí)間長(zhǎng) 5.擴(kuò)散溫度：437內(nèi)溫度與擴(kuò)散速度正相關(guān)一、單項(xiàng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)影響因素穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、但靈敏度稍差將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對(duì)應(yīng)孔中,兩者各自在凝膠中向四周自由擴(kuò)散,當(dāng)抗原與抗體相遇,在比例合適時(shí)形成沉淀線方法評(píng)價(jià)原理(double gel diffusion test)應(yīng)用1.檢測(cè)未知抗原或抗體3.抗體效價(jià)滴定4.抗原或抗體純度鑒定2.抗原性質(zhì)分析二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)AbAg染色標(biāo)本圖1.抗原抗體雙向自由擴(kuò)散2.24小時(shí)出結(jié)果3.呈現(xiàn)沉淀線或弧雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)-原理示意圖雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)-原理示意圖AgAbA B C D E F A：濃度Ag、Ab及擴(kuò)散率近似； B：濃度Ag、Ab近似，擴(kuò)散率AgAb ； C：濃度Ag、Ab近似，擴(kuò)散率AgAb ； D：濃度AgAb，擴(kuò)散率近似； E：濃度AgAb，擴(kuò)