分子熒光分光光度法實驗技術

1、分子熒光分光光度法實驗技術2022/9/3第1頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一分子發(fā)光分析法分子發(fā)光分析包括: 熒光分析（fluorescence analysis） 磷光分析（phosphorescence analysis） 化學發(fā)光分析（chemiluminescence analysis） 該類分析方法與吸收分光光度法有密切關系。2022/9/3第2頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一分子發(fā)光分析法 若分子吸收了光能而被激發(fā)支較高能態(tài)，在返回基態(tài)時，發(fā)射出與吸收光波長相等或不等的輻射，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光，熒光分析和磷光分析是基于這類光致發(fā)光

2、現(xiàn)象而建交起來的分析方法。 2022/9/3第3頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一分子發(fā)光分析法 該類分析方法與吸收分光光度法有密切關系。 當物質分子吸收輻射能而被激發(fā)到較高電子能態(tài)之后，在返回基態(tài)的過程中，要釋放出部分能量。2022/9/3第4頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一一、熒光分析法 物質的基態(tài)分子受一激發(fā)光源的照射，被激發(fā)至激發(fā)態(tài)后，在返回基態(tài)時，發(fā)射出與吸收光波長相等或較長的熒光。若物質分子用X射線或紅外光激發(fā)，則分別產生X射線熒光或外光熒光。2022/9/3第5頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一一、熒光分析法 通

3、常所指的分子熒光是指紫外-可見光熒光，即利用某些物質受到紫外光照射后，發(fā)射出比吸收的紫外光波長相等或更長的紫外熒光或可見熒光，通過測定物質分子產生的熒光強度進行分析的方法稱為熒光分析。2022/9/3第6頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一二、熒光分析法的應用 熒光分析可應用于物質的定性檢測及定量分析。由于物質結構不同，所能吸收的紫外光波長不同，在返回基態(tài)時，所發(fā)射的熒光波長也不同，利用這個性質可以鑒別物質。對于同種物質的稀溶液，其產生的熒光強度與濃度呈線性關系，利用這個性質可進行定量分析。2022/9/3第7頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一二、熒光

4、分析法的應用 熒光法主要應用在醫(yī)學檢驗、生物醫(yī)學、藥物、環(huán)境監(jiān)測、食品分析等方面，尤其對體內活性物質及藥物代謝物的測定更為重要。2022/9/3第8頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一三、熒光分析法的特點 熒光法的主要特點： 1）靈敏度高，檢出限為10-7-10-9g/ml，比紫外可見分光光度法高101000倍。 2）熒光法的選擇性強，能吸收光的物質并不一定能產生熒光，且不同物質由于結構不同，雖吸收同一波長，產生的熒光強度也不同。 3）它還有用樣量少、操作簡便等的優(yōu)點。 熒光法的缺點是，由于許多物質不發(fā)射熒光，因此使它的應用范圍受到限制。2022/9/3第9頁，共52頁，2

5、022年，5月20日，10點6分，星期一四、熒光法的基本原理 1）激發(fā)光譜和熒光光譜2）激發(fā)光譜和熒光光譜的的形狀及其關系3）物質的分子結構和熒光的關系4）環(huán)境對熒光的影響 2022/9/3第10頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一1）激發(fā)光譜和熒光光譜 任何發(fā)射熒光的物質都具有兩個特征光譜，即發(fā)射光譜（excitation spectrum）和熒光光譜(fluorescence spectrum)。它們是熒光分析中定性和定量的基礎。 熒光物質的最大激發(fā)波長（ex）和最大熒光波長（em）是鑒別物質的根據，也是定量測定時的最靈敏的條件。2022/9/3第11頁，共52頁，20

6、22年，5月20日，10點6分，星期一1）激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜 ： 如果將激發(fā)光的光源用單色器分光，測定不同波長的激發(fā)光的照射下，熒光最強處熒光強度的變化，以激發(fā)波長（）為橫坐標，熒光強度（IF）為縱坐標作圖，便可得到熒光物質的激發(fā)光譜。 2022/9/3第12頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一1）激發(fā)光譜和熒光光譜熒光光譜 ：固定激發(fā)光波長和強度，而讓物質發(fā)射的熒光通過單色器分光，以測定不同波長的熒光強度。以熒光波長（）為橫坐標，熒光強度（IF）為縱坐標作 圖，便可得到熒光物質的熒光光譜。 2022/9/3第13頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星

7、期一 2）激發(fā)光譜和熒光光譜的的形狀及其關系 熒光物質的激發(fā)光譜和熒光光譜形狀相似。這是因為物質分子吸收了一定波長的紫外光后，才能發(fā)射出熒光。吸收越多，發(fā)射的熒光強度也越強。 一般把激發(fā)光譜看作是熒光物質的表觀吸收光譜。激發(fā)光譜和熒光光譜呈現(xiàn)大致的鏡像對稱關系。 2022/9/3第14頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3）物質的分子結構和熒光的關系 了解熒光和物質分子結構的關系，可以幫助我們考慮如何將非熒光物質轉化為熒光物質或將熒光強度不大或選擇性不高的物質轉化為熒光強度大及選擇性高的熒光物質，以提高分析的效果。2022/9/3第15頁，共52頁，2022年，5月20日，

8、10點6分，星期一3）物質的分子結構和熒光的關系 物質的分子結構與熒光的發(fā)生及熒光強度的大小緊密相關。 分子產生熒光必須具備2個條件： （1）物質分子必須具有能吸收一定頻率紫外光的特定結構 （2）物質分子吸收了特征頻率的輻射能之后，必須具有較高的熒光效率。熒光效率大，在相同的濃度下，熒光的發(fā)射強度也大。 2022/9/3第16頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一3）物質的分子結構和熒光的關系1、具有共軛雙鍵體系的分子。共軛程度越大，分子的熒光效率越大。 2、具有剛性平面結構的分子。剛性的不飽和的平面結構具有較高的熒光效率，分子剛性及共平面性越大，熒光效率越高。 3、苯環(huán)上取

9、代基的類型。給電子基團常使熒光增強，吸電子基團及鹵素會減弱甚至破壞熒光。 2022/9/3第17頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一4）環(huán)境對熒光的影響 分子所處的環(huán)境，如溫度、溶劑、PH值等都會影響分子結構和立體構像，從而影響熒光強度 。 （1）溫度：一般說來，大多數熒光物質的溶液隨著溫度的降低，熒光效率和熒光強度將增加；相反，溫度升高熒光效率將下降 。 （2）溶劑：同一種熒光物質溶于不同的溶劑，其熒光光譜的位置和強度可能有明顯的不同。一般情況下，隨著溶劑的極性增加，熒光強度將增強。 2022/9/3第18頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一4）環(huán)境對

10、熒光的影響（ 3）溶劑PH值的影響，當熒光物質是弱酸或弱堿時，溶劑PH值對熒光強度有較大影響。（4）猝滅劑的影響，熒光猝滅是指熒光物質與溶劑子或其他溶質分子相互作用，引起熒光強度降低、消失或熒光強度與濃度不呈線性的關系的現(xiàn)象。引起熒光猝滅的物質稱為猝滅劑（quencher）。常見的猝滅劑有鹵素離子、重金屬離子、氧分子、以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。2022/9/3第19頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一五、熒光分光光度計的結構發(fā)光源：采用高壓氙燈。試樣池：熒光分析用的試樣池需用低熒光材料，常用石英池，形狀為四面透光的方形。檢測器：熒光的強度比較弱，因此要求檢測

11、器有較高的靈敏度，常用光電倍增管。單色器：采用光柵作為單色器。2022/9/3第20頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一六、熒光的定量分析 1、熒光測定的線性范圍一般在10-5100g/ml。當濃度較高時，吸光度（A）0.05時，由于自猝滅和自吸收等原因，熒光強度與濃度不呈線性關系，熒光強度同濃度的線性關系將向濃度軸偏離，發(fā)生負偏差。2、與紫外-可見分光光度法相同，也可采用標準曲線法和標準對照法。2022/9/3第21頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一六、熒光的定量分析 3、測量條件的選擇 選擇線性范圍：當熒光物質溶液的吸光度A0.05時，熒光強度與濃

12、度才呈線性關系。 選擇合適的激發(fā)光和熒光波長：一般選擇激發(fā)光譜中能產生最強熒光的入射光波長作為激發(fā)光，熒光光譜選擇最強熒光的波長作為熒光測定的波長。2022/9/3第22頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一七、熒光分光度計的性能可檢測熒光、磷光及生物發(fā)光掃描速度快，可達24000 nm/分，數據采集速率達80次/秒波長范圍：190-1100 nm光譜帶寬：1.5、2.5、5、10和20 nm五檔切換具有液體池和固體池，并具有自動控溫設備。2022/9/3第23頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一八、熒光分光度計的使用 1、開啟計算機，鍵入用戶名和密碼，打

13、開分光光度計主機，運行Cary Eclipse軟件。2、按樣品的測定要求進入相應的測定模塊。3、設定測定參數，按操作流程測試樣品，測定結果保存或打印。4、測試完畢后，在系統(tǒng)指定的出口退出系統(tǒng)；先關閉分光光度計主機電源，再關閉電腦，切斷總電源。5、罩上儀器罩，打掃室內衛(wèi)生，并在儀器使用登記本上填寫使用記錄。2022/9/3第24頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一操作軟件包2022/9/3第25頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一定性分析操作2022/9/3第26頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一預掃描2022/9/3第27頁，共52

14、頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一2022/9/3第28頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一移除譜圖2022/9/3第29頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一定性掃描參數設置2022/9/3第30頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一設置錯誤2022/9/3第31頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一2022/9/3第32頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一2022/9/3第33頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一2022/9/3第34頁，共52頁，2022年，5月2

15、0日，10點6分，星期一2022/9/3第35頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一譜圖存貯2022/9/3第36頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一圖譜格式-FBSW2022/9/3第37頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一數據格式-CSV2022/9/3第38頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一定量分析操作2022/9/3第39頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一2022/9/3第40頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一參數設置2022/9/3第41頁，共52頁，2022年

16、，5月20日，10點6分，星期一2022/9/3第42頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一標準樣品設置2022/9/3第43頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一待測樣品設置2022/9/3第44頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一空白校零2022/9/3第45頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一開始測定2022/9/3第46頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一2022/9/3第47頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一2022/9/3第48頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一重新計算2022/9/3第49頁，共52頁，2022年，5月20日，10點6分，星期一2022/9/3第5