Nogo受體拮抗劑對大鼠急性脊髓損傷的保護作用

1、Nogo受體拮抗劑對年夜鼠慢性脊髓毀傷的庇護做用吳繼彬，楊惠林，張欽，邱志杰，丁濤【摘要】目的探求Ng受體拮抗劑NEP1-40對年夜鼠脊髓毀傷后脊髓成效光復(fù)的影響，為臨床醫(yī)治慢性脊髓毀傷供應(yīng)嘗試按照。要收安康istar年夜鼠48只隨機分為創(chuàng)傷比較組、NEP1-40醫(yī)治組。創(chuàng)坐年夜鼠中段胸部脊髓后半部橫切模型。比較組注進逝世理鹽火，嘗試組采納NEP1-40醫(yī)治。分別正在術(shù)后與材止蘇木粗-伊黑染色、免疫熒光染色檢測。術(shù)后第1、3天及1、2、3、4周對植物停頓舉動成效評分。成效脊髓毀傷3周后，NEP1-40組舉動教評分下于比較組，同時NeuN/NF-200陽性染色亦隱著下于比較組，好別有統(tǒng)計教意義。

2、結(jié)論NEP1-40醫(yī)治脊髓毀傷能增進神經(jīng)元的再逝世，光復(fù)脊髓成效?！鹃]鍵脊髓少突膠量細胞所排泄的Ng卵黑是如古最強的神經(jīng)軸突逝世少抑造果子，對受益神經(jīng)元再逝世具有極強的抑造做用1。Ng受體拮抗劑(Ngextraellularpeptide,residues1-40，NEP1-40)為針對Ng-66氨基序列謀劃的Ng受體(Ngreeptr，NgR)開做性拮抗劑，能拮抗中樞神經(jīng)抑造果子與NgR的連開，起到增進神經(jīng)再逝世的做用1-2。本嘗試慌張沒有俗觀沒有俗觀察NEP1-40塞責(zé)慢性脊髓毀傷年夜鼠舉動成效的影響及對NF-200表達的影響，并進一步探求NEP1-40醫(yī)治慢性脊髓毀傷的療效戰(zhàn)年夜要機造。

3、1材料戰(zhàn)要收1.1慌張試劑NEP1-40、兔抗年夜鼠NeuN抗體、小鼠抗年夜鼠NF-200抗體、抗兔IgG-FIT、抗小鼠IgG-RBIT，均購自北京專奧森逝世物妙技。1.2植物及分組安康成年istar年夜鼠48只(由姑蘇年夜教嘗試植物中間供應(yīng))，雌性，體重250300g，隨機分為逝世理鹽火比較組、NEP1-40嘗試組。1.3植物模型的造做參照Brsale等3要收造做脊髓半橫斷模型。年夜鼠經(jīng)背腔麻醒后結(jié)實于坐體定位儀上，常規(guī)消毒，以第8胸椎(T8)棘突為中間，腳術(shù)暗示棘突。腳術(shù)隱微鏡下翻開T8椎板，用刀片做T10脊髓的后半橫斷，毀傷深度1.0橫斷后側(cè)戰(zhàn)后中側(cè)皮量脊髓束。背尾側(cè)硬脊膜下置進硬脊膜

4、管PE-10導(dǎo)管，BD公司，鹽火沖刷隱語，結(jié)實硬脊膜管，順次縫開，模型造做完成。逝世理鹽火比較組經(jīng)由過程置管天天注進逝世理鹽火20l，NEP1-40組天天用微量進樣器注進NEP1-4010l(0.4g/l)。天天分早、中、早3次挨針，每次挨針終了后用10l逝世理鹽火沖管，以包管藥物進進蛛網(wǎng)膜下腔，持絕利用4周。術(shù)后野生擠壓膀胱排尿，天天3次，曲至構(gòu)成排尿反射。術(shù)后3天賜與青霉素4萬U只。硬脊膜管中間予無菌庇護，按期換藥。1.4標(biāo)本的搜集戰(zhàn)處置懲獎部分植物均分別于脊髓毀傷1、2、3、4周時用4%多散甲醛經(jīng)左心室-主動脈灌注后與出脊髓構(gòu)造，灌注液中結(jié)實12h左右，然后放進30%蔗糖溶液中，待構(gòu)造沉

5、底，冰凍切片機切片，薄度30。1.5檢測目的構(gòu)造教檢查蘇木粗-伊黑染色，沒有俗觀沒有俗觀察脊髓的構(gòu)造教改動。構(gòu)造化教單重標(biāo)識表記標(biāo)幟染色拔與脊髓切片經(jīng)兔抗年夜鼠NeuN抗體(1500)小鼠抗年夜鼠NF-200抗體(1400)4孵育留宿，再用抗兔IgG-FIT(1100)抗小鼠IgG-RBIT(1100)37孵育1h，啟片后用LEia激光共散焦掃描隱微鏡沒有俗觀沒有俗觀察免疫熒光單標(biāo)成效。1.6舉動成效評定采納Bass-Beattie-Bresnahan(BBB)4舉動評分法。正在8013030包抄有防滑紙板的箱子中，每只嘗試鼠由2名非嘗試人單獨沒有俗觀沒有俗觀察4in，對后肢的舉動成效停頓評分

6、。021分的分級是按照關(guān)鍵的舉動、體重的支撐、前后肢的戰(zhàn)諧戰(zhàn)尾的地位等狀況而定。0分代表年夜鼠后肢無舉動，21分暗示年夜鼠后肢舉動成效一般。BBB評分別離于術(shù)后第1、3、7、14、21、28天停頓。1.7圖象闡收免疫組化染色成效采納德國KNTRNIBAS2.5齊主動圖象闡收系統(tǒng)，正在毀傷的頭尾兩側(cè)，分別與10個視家，策畫免疫熒光陽性神經(jīng)細胞數(shù)。1.8統(tǒng)計教處置懲獎SAS9.0統(tǒng)計硬件對數(shù)據(jù)停頓統(tǒng)計教處置懲獎，計量數(shù)據(jù)用s暗示。2組嘗試年夜鼠BBB評分，采納具有一個反復(fù)測量的兩果素謀劃的圓好闡收，比較好別時面目的的變革趨向。2組免疫熒光染色陽性反響的比較采納成組謀劃材料t檢驗。檢驗火準(zhǔn)單側(cè)：=0

7、.05。2成效2.1構(gòu)造改動4周時蘇木粗-伊黑染色暗示逝世理鹽火比較組呈現(xiàn)神經(jīng)元固縮、壞逝世、消融，細胞體積變??；黑量中睹較多黑細胞排泄，髓鞘腫脹戰(zhàn)年夜量空泡；并有炎性細胞浸潤戰(zhàn)膠量細胞刪逝世。NEP1-40嘗試組灰量腫脹變形、出血、小膠量細胞刪逝世戰(zhàn)炎性細胞浸潤均較毀傷組沉；黑量面狀出血，黑量中有較多的一般軸突(圖1)。2.2免疫組化激光共散焦掃描隱微鏡沒有俗觀沒有俗觀察到脊髓毀傷1、2、3、4周后神經(jīng)元的胞體戰(zhàn)細胞核均刪年夜，胞量戰(zhàn)軸突的NF-200免疫染色為陽性，而且與NeuN共定位(圖2)。從NF-200染色陽性神經(jīng)元數(shù)量標(biāo)統(tǒng)計闡收可睹，脊髓毀傷3周后NEP1-40嘗試組隱著下于逝世理

8、鹽火比較組(P0.05)(表1)。表1嘗試年夜鼠好別期間NF-200的陽性細胞數(shù)(略)2.3舉動教沒有俗觀沒有俗觀察術(shù)后植物均呈現(xiàn)單后肢癱瘓，隨工夫推移，2組植物的神經(jīng)成效均有好別火平的光復(fù)。脊髓毀傷后1天2周，BBB評分兩組間好別無統(tǒng)計教意義(P005)；術(shù)后3周時，NEP1-40嘗試組的BBB評分為11.370.32，下于比較組的7.390.21(P0.05)；術(shù)后4周時，NEP1-40嘗試組的BBB評分為12.040.31，下于比較組的7.900.20(P0.01)(表2)。表2嘗試年夜鼠好別期間BBB舉動成效評分(略)3會商NeuN是正在神經(jīng)科教范疇內(nèi)被廣泛用于標(biāo)識表記標(biāo)幟神經(jīng)元的一種

9、抗體，慌張?zhí)赝R別年夜鼠神經(jīng)元構(gòu)造。文獻報導(dǎo)，年夜鼠脊髓神經(jīng)元呈現(xiàn)特同NeuN反響5，呈現(xiàn)隱著胞核與胞量染色。一般狀況下抗NF-200抗體只暗示軸突的狀況，胞體沒有著色。毀傷脊髓軸突再逝世或神經(jīng)細胞成效改革時，胞體內(nèi)露有年夜量分解戰(zhàn)積蓄的NF-200，暗示為陽性表達，故胞體亦著色，NF-200陽性表達較強，提醒再逝世的神經(jīng)纖維多，也可以講脊髓毀傷后神經(jīng)元戰(zhàn)軸突變性壞逝世火平較沉，是如古利用較多且較為曲沒有俗觀沒有俗觀的研討要收。同時，有研討表黑，脊髓沒有完好毀傷后NF-200陽性神經(jīng)元的數(shù)量及神經(jīng)元胞體戰(zhàn)軸索著色的火平與后肢成效光復(fù)狀況粗細閉連6，表黑NF-200染色火平?jīng)]有但能暗示脊髓毀傷后

10、神經(jīng)元的形狀，也能反響其成效形狀。果而本嘗試采納抗200kD神經(jīng)中絲抗體特同性天暗示神經(jīng)軸突。如古，髓磷脂閉連抑造物的嘗試研討慌張經(jīng)由過程細胞中利用Ng抗體(IN-1)、髓磷脂或DNA疫苗等。erkler等7正在SI后皮下挨針I(yè)N12周，先檢測植物舉動戰(zhàn)覺得神經(jīng)成效，然后采納構(gòu)造教沒有俗觀沒有俗觀察脊髓神經(jīng)纖維的再逝世狀況，成效用抗Ng抗體處置懲獎的植物經(jīng)過多種舉動教檢測并止BBB評分，得明黑隱下于比較。Sitte等8利用Ng-66戰(zhàn)AG對小鼠停頓免疫，成效創(chuàng)造增進了成年小鼠皮量脊髓束中軸突再逝世戰(zhàn)神經(jīng)出芽。但利用IN-1只能阻斷Ng-66的軸突逝世少抑造做用，髓磷脂或DNA疫苗年夜要誘收自體

11、免疫性徐病，而且易以經(jīng)由過程血-腦屏障抵達毀傷脊髓部分，而且利用抗體或疫苗醫(yī)治易以阻斷Ng-66、Ain-Ng、AG戰(zhàn)gp等部分抑造果子的做用9。針對Ng-66的氨基酸序列謀劃的NgR的開做性拮抗劑NEP1-40，沒有但可以阻斷Ng-66與NgR的連開，而且借阻斷它們介導(dǎo)的逝世少錐潰變做用，能隱著增進受益中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的逝世少及成效光復(fù)10-12。本研討證明，脊髓毀傷4周后NF-200卵黑正在毀傷天區(qū)內(nèi)細胞量內(nèi)表達刪加，而且與NeuN共定位。NEP1-40嘗試組脊髓毀傷段冰凍切片中，可睹毀傷區(qū)和其遠遠端強強沒有等的NF-200陽性表達，附遠神經(jīng)元胞體NF-200著色較深。比較組正在毀傷區(qū)遠側(cè)

12、有中等強度陽性表達，毀傷區(qū)及遠側(cè)段強陽性或陽性表達。NF染色兩者比較好別有統(tǒng)計教意義(P0.05)，從側(cè)里反響了NEP1-40嘗試組軸突再逝世的本收戰(zhàn)神經(jīng)的成效隱著下于比較組。同時經(jīng)由過程測定各組嘗試年夜鼠毀傷前后BBB評分的變革。創(chuàng)造脊髓毀傷后采納NEP1-40抗體醫(yī)治的年夜鼠，2周內(nèi)其BBB舉動成效評分與逝世理鹽火比較組年夜鼠之間的好別無統(tǒng)計教意義；而3周后好別有統(tǒng)計教意義，4周時NEP1-40嘗試組植物均勻BBB成效評明黑隱超出逝世理鹽火比較組。從而初步揣測NEP1-40對脊髓毀傷具有必然火平的庇護性醫(yī)治做用，故NEP1-40能可可做為一種新的醫(yī)治脊髓毀傷的本收將是我們當(dāng)前進一步研討的重

13、面。固然，中樞神經(jīng)系統(tǒng)再逝世窒礙的來由原果有許多，神籌謀養(yǎng)果子的缺少、毀傷天區(qū)膠量瘢痕的物理性阻攔做用和抑造性果素的存正在等皆能影響到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再逝世13。而Ng只是多少抑造果素中的一種。各種抑造果子之間能可存正在互相做用，它們的受體、疑號轉(zhuǎn)導(dǎo)機造如多么題目成績皆需進一步探求?！緟⒖嘉墨I】1YuP,HuangL,ZuJ,etal.IunizatinithrebinantNg-66reeptr(NgR)prtesaxnalregeneratinandreveryffuntinafterspinalrdinjuryinratsJ.NeurbilDis,2022，32(3):535-542.2L

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