殼聚糖的復(fù)合法降解及降解產(chǎn)物降血糖活性的研究

1、殼聚糖的復(fù)合法降解及降解產(chǎn)物降血糖活性的研究【摘要】目的研究復(fù)合法降解殼聚糖及降解產(chǎn)物的生物活性方法在纖維素酶降解的后期引入H22氧化降解殼聚糖。觀察其降解產(chǎn)物對糖尿病小鼠生化指標(biāo)的影響。結(jié)果最正確工藝條件為：纖維素酶降解時酶糖比0.2，pH4.6、50、時間為3h，后續(xù)H22降解時H22用量為0.81.0(l/g)、75、時間為1.5h，所得降解產(chǎn)物的平均分子量約為1700。工藝所消費的低聚殼聚糖用量為100g/kg時具有明顯的降血糖生物活性，其成效甚至優(yōu)于拜糖蘋。結(jié)論該復(fù)合降解工藝具有本錢低，易于工業(yè)化，而且所得產(chǎn)品具有較高的生物活性。【關(guān)鍵詞】殼聚糖;低聚殼聚糖;降解;血糖;生物活性Ab

2、strat：bjetiveTinvestigatehitsandegradatedbybinedethdandprdutinbilgialativityfdegradatin.ethdshitsanasfirstdegradatedbyellulasedeplyerizatin,andthenasxidatedbyH22.Theeffetsfdegradatinndiabetiieasbserved.ResultsTheptiuellulasedeplyerizatinnditinseretheassfellulasethitsan(n)0.1,pH4.6,teperature(T)50and

3、tie(t)3h.TheptiuH22xidatinnditinseretheprprtinfH22thitsan(n)0.81l/g,teperature(T)75,tie(t)1.5h.Undertheptiudegradatinnditinabut1700lighitsanuldbebtained.rever,thepreparedlighitsanshedbviuslyleringbld-gluseativityhengiventieatadsef100g/kganditseffetasevenveraarbse.nlusinThisbineddegradatinethdthitsan

4、isntnlyllystandeasytindustrialize,butalsitspreduthasahigherbilgialativity.Keyrds：hitsan;lighitsan;Degradatin;Bldgluse;Bilgiativity殼聚糖作為天然堿性多糖，其資源量僅次于纖維素，分子量從幾十萬到幾百萬不等。降解后的低聚殼聚糖因溶解性增強(qiáng)，容易被吸收利用，尤其是分子量在1500左右的產(chǎn)品顯示出獨特的生理活性和功能1。目前，由殼聚糖降解制備優(yōu)質(zhì)低聚殼聚糖的工業(yè)化消費成為該多糖廣泛推廣使用的瓶頸。在已有研究的眾多降解方法中，非專一性酶降解和H22氧化降解法比擬有望實現(xiàn)大規(guī)模

5、化消費。其中H22氧化降解具有本錢低、降解速度快、產(chǎn)品無殘毒等優(yōu)勢。但反響在H22用量大、溫度高及反響時間長的條件下易發(fā)生副反響，制備產(chǎn)品的活性也受到質(zhì)疑。與其相比，酶降解由于無副反響、降解條件溫和、降解過程容易控制、產(chǎn)品生物活性高而引起人們的廣泛關(guān)注2。在眾多非專一性酶的挑選過程中，纖維素酶因存在廣泛，消費本錢低，對殼聚糖具有一定降解作用而受到重視，但纖維素酶活力有限，降解效率低，產(chǎn)物分子量分布較寬3。為此，本研究在纖維素酶降解的后期向體系內(nèi)引入H22快速氧化降解，以進(jìn)步反響速率、縮小產(chǎn)品分子量分布寬度。最后對制備的低聚殼聚糖產(chǎn)品進(jìn)展降血糖生物活性研究，以評價該制備工藝的可行性。1器材1.1

6、材料殼聚糖，濟(jì)南海得貝海洋生物工程，脫乙酰度90%;纖維素酶，天津麗華制劑廠，酶活力40000Ug-1;H22，30%分析純。拜糖蘋，北京拜爾醫(yī)藥保健產(chǎn)品;四氧嘧啶，Siga公司提供。1.2儀器203柔性反響釜，德國進(jìn)口;小型板框壓濾機(jī)，浙江省海寧市豐源過濾設(shè)備;DZF-6050型離心噴霧枯燥器，常州市一步枯燥設(shè)備廠;L-10AD凝膠色譜儀，日本島津;血糖儀，上海榮盛生物技術(shù)提供。1.3動物3月齡雄性昆明小鼠，體質(zhì)量2030g，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。2方法2.1降解實驗2.1.1纖維素酶的降解實驗在攪拌的情況下，將200g殼聚糖按150(/V)混合，參加適量冰醋酸溶解后，快速升溫至所

7、需溫度，加纖維素酶進(jìn)展恒溫降解。到達(dá)預(yù)定時間后迅速升溫至100使酶失活，取樣稀釋過濾、用凝膠色譜分析產(chǎn)物的平均分子量3。實驗以酶糖比n、pH和溫度T為主要影響因素設(shè)計L9(34)正交實驗，得最正確組合工藝條件為n=0.1，pH=4.6，T=50。2.1.2H22氧化降解工藝條件確實定在纖維素酶降解的根底上升溫至預(yù)定溫度，參加H22后繼續(xù)降解，到預(yù)定時間后取樣、過濾分析產(chǎn)物平均分子量。最后在確定的最正確復(fù)合降解工藝條件下對殼聚糖進(jìn)展降解，卸料降溫，板框壓濾、噴霧枯燥后待用。2.2降解物對糖尿病小鼠生化指標(biāo)的影響2.2.1高血糖模型的復(fù)制及分組小鼠禁食12h，四氧嘧啶生理鹽水溶液(2%)腹腔注射(

8、一次性給藥)，劑量為180g/kg，72h后空腹尾尖取血，血糖儀測血糖，大于11l/L的小鼠入選糖尿病模型。取10只正常小鼠為正常組。將造模成功的小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為模型組，殼聚糖原料組(100g/kg)，低劑量降解產(chǎn)物組(100g/kg)，高劑量降解產(chǎn)物組(200g/kg)，拜糖蘋治療組(20g/kg)。灌胃1次/d，連續(xù)給藥28d。正常組和模型組灌胃生理鹽水。2.2.2動物標(biāo)本留取每天觀察各組小鼠的進(jìn)食量、飲水及尿量;給藥14d和28d后尾尖取血，血糖儀測血糖;實驗完畢后小鼠被斷椎處死，取肝、腎組織，用濾紙吸干外表血跡后稱重。2.3統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS13.0軟件進(jìn)展統(tǒng)計分

9、析，所得數(shù)據(jù)用s表示，組間差異采用t檢驗。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1纖維素酶的降解過程研究為了考察纖維素酶的催化降解過程，在正交實驗確定的最正確組合條件下對殼聚糖進(jìn)展降解，產(chǎn)物的平均分子量隨時間的變化情況見圖1。圖1纖維素酶降解過程圖1說明，在開場降解的0.75h內(nèi)，產(chǎn)品平均分子量迅速下降。這也證實了纖維素酶對殼聚糖主要進(jìn)展內(nèi)切降解反響。隨著反響的進(jìn)展，殼聚糖聚合度減小，產(chǎn)物平均分子量下降趨勢變緩。這與產(chǎn)物濃度的增加在一定程度上抑制了降解反響的進(jìn)展有關(guān)。當(dāng)降解到達(dá)3h后，產(chǎn)物的平均分子量下降趨勢非常微弱，維持在2萬左右。因此，可在纖維素酶降解3h后，引入H22進(jìn)展降解。3.2H22氧化

10、降解工藝條件確實定3.2.1溫度對降解過程的影響在纖維素酶降解的根底上，不同溫度條件下H22氧化降解殼聚糖過程見圖2。圖2溫度對H22降解過程的影響圖2說明，引入H22后產(chǎn)物平均分子量迅速下降，降解速率根本上與溫度呈正比。這可能是殼聚糖分子內(nèi)部尚存在少量易斷裂“弱鍵，如：少數(shù)鏈節(jié)上具有呋喃環(huán)構(gòu)造、存在少數(shù)戊糖的環(huán)狀構(gòu)造、或存在少數(shù)開環(huán)的半縮醛鏈節(jié)構(gòu)造。之后產(chǎn)物平均分子量下降比擬平緩，且溫度越高進(jìn)入平緩階段越早。此外，在反響過程中還發(fā)現(xiàn)，在高于80條件下降解時，所得產(chǎn)物顏色隨著降解時間的延長由淡黃色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚覝囟仍礁咦兓矫黠@。分析認(rèn)為當(dāng)殼聚糖降解到一定程度后，其空間構(gòu)造由卷曲狀轉(zhuǎn)變成短

11、的直鏈狀，氨基基團(tuán)活潑性增強(qiáng)，易發(fā)生羰氨副反響。為了有效控制副反響消耗具有生物活性的氨基，確定后期H22氧化反響溫度為75、時間為1.5h。3.2.2H22用量對降解過程的影響在纖維素酶降解的根底上，質(zhì)量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%H22的用量與殼聚糖用量的比值n對降解過程的影響見圖3。圖3H22用量對降解過程的影響由圖3可以看出，在反響時間和溫度一樣的條件下，降解產(chǎn)物的平均分子量隨H22用量的增加而下降。當(dāng)用量比增加到0.8以后，下降趨勢明顯變緩。由此確定后續(xù)H22的最適用量比值為0.81.0(l/g)。此時，可獲得平均分子量約為1700左右的降解產(chǎn)物。采用纖維素酶與雙氧水復(fù)合降解殼聚糖與直接采用雙氧水

12、降解相比，雙氧水降解時間縮短將近50%，產(chǎn)品平均分子量低且顏色較淺4。分析認(rèn)為，殼聚糖溶液經(jīng)過纖維素酶初步降解后分子量有了很大降低，呈均相溶液，從而抑制了雙氧水可能對局部殼聚糖過度降解。此外，降解時間縮短也很好地限制了副反響的發(fā)生。3.3降解產(chǎn)物的降血糖活性研究3.3.1一般情況的觀察實驗過程中各組小鼠體重、血糖及內(nèi)臟重量的變化見表1。表1小鼠體重、血糖及內(nèi)臟重量的變化與正常組對照，1P0.01，2P0.05;與模型組對照，3P0.01，4P0.05經(jīng)四氧嘧啶注射造模成功后的糖尿病小鼠，出現(xiàn)飲食量增加、多飲多尿、體毛松散及精神萎靡等病癥。未經(jīng)治療的模型組“三多病癥尤其突出，體重也明顯低于正常組

13、(P0.05)。低劑量降解產(chǎn)物和拜糖蘋治療組的一般病癥得到明顯改善，體重與正常組無顯著差異。殼聚糖原料和高劑量降解產(chǎn)物治療組的病癥改善居中。3.3.2降解產(chǎn)物對糖尿病小鼠血糖的影響與模型組相比，殼聚糖原料治療組血糖值雖然有所降低，但并不存在顯著性差異。原因為殼聚糖本身分子量過大，不能被有效吸收所致。而高、低劑量降解產(chǎn)物和拜糖蘋治療組的14，28d血糖值明顯低于模型組(P0.01)。其中，低劑量降解產(chǎn)物的降血糖效果甚至優(yōu)于拜糖蘋。由此說明殼聚糖原料經(jīng)過本工藝降解后具有明顯的降血糖生物活性，且起效較快。與正常組相比，單獨使用降解產(chǎn)物并不能使血糖降到正常值。3.3.3降解產(chǎn)物對糖尿病小鼠內(nèi)臟的影響由

14、表1中的數(shù)據(jù)分析可知，除拜糖蘋治療組外(P0.05)，其它治療組的肝臟指數(shù)雖然高于模型組，但不存在顯著性差異。這說明殼聚糖及降解產(chǎn)物對肝臟具有一定保護(hù)功能，但效果不顯著。同時也證實了臨床上廣泛使用的拜糖蘋降糖藥具有對肝臟損害小的優(yōu)點。對于腎臟，低劑量降解產(chǎn)物治療組的指數(shù)與正常組較接近，而其它治療組的肝臟指數(shù)與模型組接近，明顯高于正常組(P0.01)。可見，使用一定劑量本工藝消費的低聚殼聚糖對糖尿病小鼠進(jìn)展治療時，可同時到達(dá)保護(hù)肝、腎的成效。有關(guān)低聚殼聚糖降糖作用機(jī)制目前尚不清楚。大多推測為，殼聚糖分子構(gòu)造中的大量氨基調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)pH呈弱酸性，從而增強(qiáng)胰島素的活性。也有人認(rèn)為降解后的低聚殼聚糖對動

15、物機(jī)體內(nèi)-葡萄糖苷酶具有一定抑制作用，阻礙了它從碳水化合物和有關(guān)多糖的非復(fù)原端切下葡萄糖5。根據(jù)本研究結(jié)果，降解產(chǎn)物的治療效果與拜糖蘋比擬接近，而拜糖蘋正是-葡萄糖苷酶的抑制劑，因此，偏向于后者。4結(jié)論本研究提出了一種纖維素酶結(jié)合雙氧水降解殼聚糖的復(fù)合降解方法。實驗確定最正確工藝條件為：纖維素酶降解時酶糖比為0.2、pH4.6、反響溫度為50、時間為3h，后續(xù)H22降解時30%H22用量與殼聚糖原料的比值為0.81.0(l/g)、75、時間為1.5h，所得降解產(chǎn)物的分子量約為1700。降解產(chǎn)物對糖尿病小鼠降血糖研究說明，用量100g/kg時具有明顯的降血糖生物活性，且起效較快。其成效甚至優(yōu)于拜糖蘋。此外，對糖尿病小鼠進(jìn)展治療時，可同時起到保護(hù)肝、腎的成效。因此，該降解工藝不僅有效結(jié)合了非專一性酶和雙氧水氧化降解的優(yōu)勢，具有本錢低，易于工業(yè)化，所得產(chǎn)品具有較高的生物活性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1魏新林，夏聞水.甲殼低聚