奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細胞株的體外作用

1、奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細胞株的體外作用【摘要】【目的】研究奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細胞株的生長抑制作用及對aspase-3活性的影響?！痉椒ā坑萌藢m頸癌HeLa細胞株經奧沙利鉑處理后，TT法測定細胞生長抑制率,透射電鏡觀察細胞形態(tài)學變化,流式細胞儀和原位末端標記技術法TUNEL檢測細胞凋亡率，比色法檢測aspase-3活性變化，,并利用A-DEVD-H進展aspase-3抑制試驗?！窘Y果】奧沙利鉑(464l/L)在體外能以時間和劑量依賴的方式對宮頸癌HeLa細胞產生細胞毒作用并誘導其凋亡，奧沙利鉑作用細胞株48h后,細胞呈現(xiàn)典型的凋亡細胞的形態(tài)特征；并能增加HeLa細胞的aspase-3

2、活性，A-DEVD-乙醛(A-DEVD-H)可有效抑制奧沙利鉑誘導的HeLa細胞凋亡。【結論】奧沙利鉑在體外能抑制人宮頸癌HeLa細胞的增殖,誘導細胞凋亡，aspase-3活化參與了奧沙利鉑誘導HeLa細胞的凋亡過程?！娟P鍵詞】宮頸癌；奧沙利鉑；生長抑制；aspase-3Abstrat：【bjetive】Tstudytheeffetfxaliplatinngrthinhibitinandaspase-3ativitynhuanervialanerHeLaells.【ethds】HuanervialarinaHeLaellseretreatedithxaliplatin.ellgrthratea

3、sdeterinedithTTassay;ellrphlgihangesereexainedundereletrnirspy.FlytetryandTUNELasusedtexaineellapptsisrate.Ativitiesfaspase-3eredeterinedbyhretry,anditsinhibitinastestbyA-DEVD-H.【Results】xaliplatin(4-64l/L)induedyttxiityandapptsisthuanervialarinaHeLaellsinvitristie-dependentanddse-dependent.Thetypia

4、lappttirphlgialfeaturesappearedintheellstreatedithxaliplatinfr48hurs;aspase-3ativityasup-regulatedinxaliplatin-induedappttiells.ThexaliplatininduedHeLaellapptsisaseffiientlyinhibitedbyA-DEVD-H.【nlusin】xaliplatinaninhibitHeLaellgrthfervialarinaandindueapptsisinvitr.aspase3ativatinaybeinvlvedinxalipla

5、tin-induedapptsisfHeLaells.Keyrds：ervialarina;xaliplatin;ellgrth;aspase-3JSUNYat-senUniv(edSi),2022,28(5):485-489奧沙利鉑(xaliplatin,L-HP)是第3代鉑類化合物,其化學名為左旋反式二氨環(huán)己烷草酸鉑。因為與順鉑作用機制有重要區(qū)別1,對各種順鉑耐藥的腫瘤細胞株無穿插耐藥,而且該藥無明顯腎毒性,耳毒性極微,血液學毒性較輕,神經系統(tǒng)毒性主要為劑量依賴性的自限性外周神經病變2,3，故近年來不但用于對順鉑耐藥的多種人類癌癥的二線治療4,5，而且臨床上已經有代替順鉑作為一線治療的使用

6、6,7。體內外試驗及臨床試驗已證實了奧沙利鉑對晚期大腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌等有較好療效8，但有關奧沙利鉑對人宮頸癌的作用及其機制的研究,國內外報道甚少。本實驗通過研究奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細胞株的生長抑制作用及對aspase-3活性的影響，旨在為其在宮頸癌的臨床應用提供實驗根據。1材料和方法1.1材料奧沙利鉑由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份消費(N:06967),用前以無血清培養(yǎng)液配制。HeLa細胞株由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院中心實驗室保存。TT為Siga公司產品,用PBS配成5g/L。RPI-1640培養(yǎng)液為GIB產品。胎牛血清:杭州四季青生物制品廠產品。原位末端轉移酶標記法(TUNEL)試劑

7、盒(武漢博士德公司),EPISXL型流式細胞儀(Bekanulter公司)，aspase-3試劑盒購自凱基生物工程公司。aspase-3阻斷劑A-DEVD-H購自Pharingen公司。1.2細胞培養(yǎng)將HeLa細胞培養(yǎng)于含100L/L胎牛血清的RPI-1640培養(yǎng)基中內含谷氨酰胺及100萬U/L青霉素和鏈霉素，置37、體積分數5%2飽和濕度下培養(yǎng),每23d傳代1次,取對數生長期細胞用于實驗。1.3TT實驗采用TT比色法,取對數生長期HeLa細胞5105/L，24h待大部分帖壁后分別參加不同濃度的奧沙利鉑2l/L、4l/L、8l/L、16l/L、32l/L、64l/L、128l/L、256l/L

8、,繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72,細胞對照組每孔參加20L培養(yǎng)液;空白對照組在鋪孔時不加細胞懸液,只加200L培養(yǎng)液。每個濃度各設3個平行孔,置37、5%2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)后,參加5g/LTT20L,繼續(xù)溫育4h后吸棄上清,參加二甲基亞砜(DS)150L,振蕩10in后,用自動酶標讀數儀在波長490n處測定各孔A值。實驗重復3次,取3次實驗結果的平均值作為實驗結果。按以下公式計算腫瘤細胞增殖抑制率:腫瘤細胞增殖抑制率=對照組吸光度A均值-實驗組吸光度A均值/對照組吸光度A均值100%。1.4電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)取對數生長期HeLa細胞分別參加2個100L培養(yǎng)瓶中,使每瓶細胞數為1106個。1瓶為陰

9、性對照,另1瓶參加奧沙利鉑后最終濃度32l/L,于37、體積分數5%2條件下培養(yǎng)48h,調整經胰蛋白酶消化后的細胞濃度至106/L，參加20g/L戊二醛固定后，由電鏡室按常規(guī)制備標本，在透射電鏡下觀察細胞形態(tài)并攝片。1.5原位末端標記技術(TUNEL)檢測細胞凋亡分組：對照組,草酸鉑作用組(8l/L、16l/L、32l/L、64l/L),每孔設4個復孔。把1106/L的HeLa細胞分別接種于24孔板中，同時在每個孔中放置載玻片后，于37、52下培養(yǎng)，爬片24h，按分組加藥，加藥完畢后在48h撈片。自然枯燥后用40g/L多聚甲醛固定，進展TUNEL染色。TUNEL染色步驟按TUNEL原位凋亡檢測

10、試劑盒說明書進展。光鏡下觀察凋亡細胞呈棕黃色，陰性細胞呈藍色。光鏡下計算凋亡指數(apptsisindes,AI)。AI=凋亡細胞數/總細胞數100%。1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡將1106個HeLa細胞接種于6孔培養(yǎng)板,24h待大部分貼壁后，分別參加2種不同濃度的奧沙利鉑,使其終濃度分別為8l/L、32l/L,同時設對照組,各組設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后獲取細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,參加70%冷乙醇固定后重新搜集細胞,PBS洗去固定液,參加RNA酶反響過夜,與碘化丙啶(PI)染液混勻后,上流式細胞儀檢測細胞凋亡。1.7比色法檢測aspase-3活性取對數生長期的細胞(2105/L)

11、,試驗組參加不同濃度的奧沙利鉑,對照組不加藥,培養(yǎng)24h、48h、72h后搜集細胞,PBS洗滌,冷的lysisbuffer懸浮細胞,置冰上20in,4,11000g離心3in,測定上清液蛋白濃度,汲取50L含50200g蛋白的細胞裂解液上清,參加50Lreatinbuffer,再參加5Laspase-3Substrate,并于37避光孵育4h,用酶標儀(405n)測定吸光度,與對照組進展比擬觀察aspase-3活化程度。1.8aspase-3抑制試驗HeLa細胞濃度調整為2105/L,先參加抑制劑A-DEVD-H40L(0.1g/L),在37、5%2孵箱中孵育2h后,參加奧沙利鉑(終濃度16l

12、/L),再孵育72h后,分別檢測細胞凋亡率及aspase-3活性。測定結果與未加抑制劑的相應結果進展比擬。每組設4個復孔。1.9統(tǒng)計學處理統(tǒng)計分析使用SPSS10.0軟件包。統(tǒng)計學采用單因素方差分析、獨立樣本t檢驗、SPEARAN秩相關檢驗，計量資料用均數標準差表示,顯著性程度以P0.05判斷。2結果2.1奧沙利鉑對HeLa細胞生長的抑制作用4l/L以下的奧沙利鉑對HeLa細胞無生長抑制作用，各時間點在濃度加大到64l/L后處于平臺期，464l/L隨著奧沙利鉑劑量的增加和作用時間的延長,其對HeLa細胞的抑制率也明顯增加圖1。2.2顯微鏡觀察細胞形態(tài)電鏡下見未處理組HeLa細胞外表有較多微絨毛

13、,細胞核大而圓,染色質分散,核仁明顯。32l/L藥物處理48h后,較多HeLa細胞皺縮,體積變小，胞質電子密度增高,有較多大小不等的空泡形成;染色質聚集于核膜周圍,核固縮,有的碎裂成多塊圖2。2.3TUNEL染色檢測HeLa細胞凋亡結果不同濃度的奧沙利鉑作用48后,計數凋亡細胞。細胞核染為棕黃色者為凋亡陽性細胞,細胞核染為藍色者為陰性細胞，奧沙利鉑組較陰性對照組陽性細胞數明顯增多，且隨著濃度的增加，陽性細胞數也隨之增加。0、8、16、32、64?滋l/L組的細胞凋率%分別為1.11.2、7.41.1、14.22.4、22.52.1、25.46.3，與0?滋l/L組相比，4組濃度差異均有顯著意義

14、(P均=0.000，圖3)。2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡結果HeLa細胞經奧沙利鉑(8l/L、32l/L)作用24后,G1期前出現(xiàn)亞二倍體峰即凋亡峰,明顯高于對照組。細胞凋亡率對照組為1.2%0.1%,8l/L奧沙利鉑組為6.30%2.61%,32l/L奧沙利鉑組為19.2%3.1%,兩用藥組與對照組凋亡率比擬，差異均有統(tǒng)計學意義，t值分別為22.43,45.21P0.05，圖4。2.5奧沙利鉑對HeLa細胞aspase-3活性的影響不同濃度的奧沙利鉑(8l/L、16l/L、32l/L、64l/L)作用HeLa細胞株24h、48h和72h后,隨著奧沙利鉑濃度的增加和作用時間的延長,aspase

15、-3活性逐漸增強(表2)。在作用時間為24h時，采用SPEARAN秩相關檢驗，奧沙利鉑濃度與aspase-3活性相關系數r=0.691、P=0.003；在濃度為16l/L時，作用時間與aspase-3活性相關系數r=0.824、P=0.000。說明奧沙利鉑對HeLa細胞的aspase-3活性的影響可能具時間和濃度依賴性。2.6aspase-3抑制試驗結果16l/L奧沙利鉑參加抑制劑A-DEVD-H組aspase-3活性及細胞凋亡指數分別為0.1360.024和13.21.4,而未加抑制劑組分別為0.2480.016和21.62.3,兩組aspase-3活性相比擬t值為2.539，P0.05；兩

16、組細胞凋亡指數相比擬t值為26.900，P0.01，均有統(tǒng)計學差異。3討論宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤,是引起婦女癌癥相關死亡的重要原因，且發(fā)病率近年呈逐年上升趨勢和年輕化。過去認為宮頸癌屬于化療藥物不敏感腫瘤,僅在晚期及復發(fā)的患者中將化療作為綜合治療的一部分。大量臨床理論已經證明,部分治療手段不能控制腫瘤周圍肉眼看不見的微小轉移灶以及可能存在的全身亞臨床轉移。因此，近年來國內外對化療在宮頸癌中的應用進展了根底及臨床方面的研究,獲得了滿意效果,進步了患者5年生存率,從而確定了化療在宮頸癌治療中的地位,意識到化療在延長患者的生命和改善生活質量方面起著重要的作用并提出了新輔助化療的概念,且術前輔助

17、化療越來越受到重視9。鉑類藥物是目前宮頸癌新輔助化療的主要用藥，傳統(tǒng)的金屬鉑類化合物抗腫瘤藥,如順鉑進入人體后多積聚于肝、腎、膀胱,造成明顯腎損害,血液非蛋白氮升高及胃腸道反響等毒性,從而限制了臨床使用劑量的進步。奧沙利鉑為順鉑類衍生物,可克制順鉑的缺乏之處,對各種順鉑耐藥的腫瘤細胞株無穿插耐藥,而且該藥無明顯腎毒性,耳毒性極微,血液學毒性較輕,神經系統(tǒng)毒性主要為劑量依賴性的自限性外周神經病變，與順鉑相比,奧沙利鉑能更有效抑制DNA合成,具有更強的細胞毒作用,可以誘發(fā)DNA一級和次級損傷,引起人類腫瘤細胞凋亡1。因此,奧沙利鉑的問世,擴大了鉑類化合物抗腫瘤藥的應用范圍,單一或結合治療多種類型腫

18、瘤已顯示出良好的應用前景,臨床上已經有代替順鉑作為一線治療的使用。大量體外研究已證明,許多抗癌藥物的抗腫瘤作用不是殺傷腫瘤細胞而是誘導腫瘤細胞凋亡或兩種形式并存。由于藥物殺傷腫瘤細胞可導致細胞壞死,產生嚴重的炎癥反響,因此,誘導腫瘤細胞凋亡也成為了現(xiàn)代抗腫瘤藥物治療的新策略。對宮頸癌放療前的輔助化療，尤其需要尋找誘導腫瘤細胞凋亡的藥物，因為藥物殺傷腫瘤細胞導致細胞壞死、缺氧，而缺氧可以降低腫瘤細胞對放療的敏感性。對于奧沙利鉑是否能誘導人宮頸癌細胞凋亡,國內外報道甚少。本實驗說明,464l/L的奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細胞生長有明顯的抑制作用,并且呈時間和劑量依賴性;原位末端標記技術(TUNE

19、L)檢測顯示奧沙利鉑在一定濃度可誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡且呈劑量依賴性，流式細胞儀可檢測到細胞凋亡峰,電鏡下部分細胞呈現(xiàn)典型凋亡特征,證明了一定濃度的奧沙利鉑可誘導HeLa細胞凋亡。aspases活性的變化是細胞凋亡的重要調節(jié)機制,目前認為aspases是一切凋亡信號傳導的共同通路,正常情況下,aspases在細胞內以無活性的酶原形式存在,當凋亡過程被啟動后凋亡信號可傳導至aspases酶原,使其部分肽鏈發(fā)生水解,形成具有活性的aspases,然后各種aspases如同凝血過程一樣產生“瀑布式層層激活,最終導致細胞發(fā)生凋亡,目前已發(fā)如今人體內的aspases共有14種,其中起核心作用的是a

20、spase-310-12。監(jiān)測aspase-3是否被激活可以幫助判斷奧沙利鉑誘導HeLa細胞凋亡是否與aspase-3活化有關。本實驗證明,奧沙利鉑在一定濃度可誘導HeLa細胞凋亡,aspase-3活性測定發(fā)現(xiàn)細胞凋亡過程中確有aspase-3的激活,其活性強度亦呈劑量時間依賴性增高。抑制試驗發(fā)現(xiàn)aspase-3活性與凋亡細胞百分率均下降,證明aspase-3參與了奧沙利鉑作用HeLa細胞的凋亡過程。另外還發(fā)現(xiàn)抑制試驗對細胞凋亡僅是部分抑制,未加A-DEVD-H組細胞凋亡指數為21.62.3,參加抑制劑組細胞凋亡指數為13.21.4,是由于細胞凋亡受多基因網絡的調節(jié),還存在著不依賴于aspas

21、e-3激活的凋亡途徑,因此對奧沙利鉑誘導宮頸癌細胞凋亡的機制尚需深化的研究?！緟⒖嘉墨I】RAYNDE,FAIVRES,HANEYS,etal.ellularandleularpharalgyfxaliplatinJ.lanerTher，2002,1(3):227-235.PASETTL,DANDRER,RSSIE,etal.xaliplatin-relatedneurtxiity:handhy?J.ritRevnlHeatl,2022,59(2):159-168.ASSIDYJ,ISSETJL.xaliplatin-relatedsideeffet:barateristisandanageentJ.Seinnl,2002,29(5Suppl5):11-20.王琳，秦叔逵，錢軍，等.奧沙利鉑結合氟尿嘧啶類藥物二線治療晚期胃癌的臨床研究J.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2022，133:361-362.KEAGEJ.Ne-generatinplatinudrugsinthetreatentfisplatin-res