2022醫(yī)學(xué)課件北京耐多藥肺結(jié)核控制項目試驗室相關(guān)問題

1、結(jié)核病細菌學(xué)檢驗的標準化與新診斷技術(shù)進展王甦民2022年4月第一頁，共七十四頁。強化結(jié)核病實驗室診斷標準化的必要性1、全球結(jié)核病控制的三大挑戰(zhàn)：耐藥結(jié)核病、HIV/艾滋病合并結(jié)核病、移民流動人口2、我國結(jié)核病疫情依然嚴重3、目前結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)的缺乏第二頁，共七十四頁。第三頁，共七十四頁。分類結(jié)核分枝桿菌屬原核生物界、厚壁菌門、裂植菌綱、放線菌目、分枝桿菌科的分枝桿菌屬，分枝桿菌屬種類甚多，目前已命名的有200多種，一般可分為緩慢生長和快速生長兩大類。第四頁，共七十四頁。結(jié)核分枝桿菌特點結(jié)核菌生長緩慢，在一般培養(yǎng)基上分裂一代需要10-20小時細胞壁厚度為1035nm，較一般細菌的細胞壁厚，

2、含有大量脂類，具有堅韌性和疏水性?？顾嵝允欠种U菌的重要特征。第五頁，共七十四頁。結(jié)核病細菌學(xué)檢查的重要作用細菌學(xué)檢查是結(jié)核病最客觀、最科學(xué)和最重要診斷方法和流行病學(xué)研究工具。因此結(jié)核病的實驗室檢驗仍然面臨著較多的問題。第六頁，共七十四頁。細菌學(xué)檢驗存在的問題不易于標準化操作誤差較大可到達30% 1、個人操作誤差 2、標本性狀 3、標本來源對結(jié)果的理解差異可影響檢驗結(jié)果對臨床治療的參考或指導(dǎo)意義。第七頁，共七十四頁。主要的細菌學(xué)檢驗技術(shù)1、痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù)2、分枝桿菌別離培養(yǎng)技術(shù)3、分枝桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)4、藥物敏感性實驗技術(shù)5、分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)第八頁，共七十四頁。標準的痰涂片抗酸染

3、色、鏡檢技術(shù)標本的收集，特別是痰標本的采集、保存制片和染色過程的標準化讀片操作的熟練程度和標準化對結(jié)果的理解第九頁，共七十四頁。痰標本的采集、保存和運送膿樣、干酪樣或膿性粘液樣痰為合格標本，痰量應(yīng)為3-5毫升。難以獲得合格標本時，也應(yīng)進行細菌學(xué)檢查，但應(yīng)注明標本性狀，以供分析結(jié)果時參考。容器上應(yīng)注明與檢驗單一致的病人姓名、編號及日期。不能及時檢驗的痰標本應(yīng)置4C冰箱保存，如需轉(zhuǎn)運，外送前要認真核對檢驗單與痰瓶上標注，放在專用的轉(zhuǎn)運箱內(nèi)運送。第十頁，共七十四頁。標本的采集 標本留取方法痰標本的留取應(yīng)在醫(yī)護人員的指導(dǎo)下進行。醫(yī)護人員應(yīng)告知病人如何咳痰，合格的痰標本是深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物

4、，并說明唾液檢出的可能性很小。檢驗人員檢查痰標本的性狀，并在登記本和檢驗報告單上注明按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分類登記。第十一頁，共七十四頁。如何正確留痰 查痰對于結(jié)核病的診斷是非常重要的，通過痰檢可以知道您是否痰中帶菌。如果痰中帶有結(jié)核菌說明您患有肺結(jié)核，具有傳染性，應(yīng)該及時遵醫(yī)囑治療。 送檢痰標本的質(zhì)量直接影響檢驗結(jié)果的準確性。請您一定按照以下要求和方法留取合格的痰標本。每個痰盒應(yīng)分別留取12口痰，請不要將1口痰分開放到2或3個痰盒中。正確的咳痰方法： 1、咳嗽前應(yīng)緩慢地深吸氣，吸氣后稍屏氣片刻。 2、軀干略向前傾，兩側(cè)手臂屈曲，平放在兩側(cè)胸壁下部，內(nèi)收并稍加力。 3、咳嗽時腹肌用力快速

5、收縮，使腹壁內(nèi)陷。一次深吸氣，可連續(xù)咳嗽三聲。 4、停止咳嗽后，收縮腹肌將剩余的氣體盡量呼盡。 5、重復(fù)緩慢吸氣動作或平靜呼吸片刻，準備再次咳嗽的動作。* 注意：局部人如果突然深吸氣容易誘發(fā)咳嗽，您可以嘗試緩慢或分幾次吸氣，爭取肺泡內(nèi)充分充氣，以增加咳嗽的效率。在這一過程中，要注意動作的連貫性，一氣呵成。同時，也可以叩擊前胸，或由家屬協(xié)助叩擊后背胸壁。這樣震動支氣管內(nèi)的分泌物，能夠增加咳嗽排痰的力度。第十二頁，共七十四頁。直接痰涂片檢查法 萋爾-尼爾遜氏ZiehlNeelsen抗酸染色法 熱染法第十三頁，共七十四頁。細菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法操作流程涂痰膜自然干燥復(fù)紅加熱初染5分鐘自然干燥鏡檢

6、流水沖洗美蘭復(fù)染30秒鹽酸酒精脫色流水沖洗流水沖洗第十四頁，共七十四頁。載玻片一新載玻片必須經(jīng)95%乙醇脫脂，檢查無劃痕后 方可使用。二一張載玻片只能涂抹1份痰標本。三載玻片只允許一次性使用，嚴禁清洗后重復(fù)用于AFB檢查。四載玻片正面一側(cè)1/3處標注實驗室序號(如使用的載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫)。五載玻片正面另一側(cè)2/3中央處均勻涂抹成面積為1020 mm的卵圓形痰膜。 第十五頁，共七十四頁。染色一嚴格按照操作標準完成染色程序。二染色后的痰膜應(yīng)呈均勻亮藍色，無紅色斑塊。三將染色后的玻片放置在報紙上，如果透過痰膜不

7、能分辨報紙上的文字，那么說明該玻片涂抹過厚，或染色過程有誤。四染色后的痰膜脫落局部應(yīng)小于整個涂抹面積的10%。 第十六頁，共七十四頁。一為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴禁油鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。二仔細觀察300以上的視野。三每個工作日，一名鏡檢人員的玻片閱讀量一般不應(yīng)超過25張。四連續(xù)閱讀1012張玻片后，應(yīng)休息20分鐘左右。鏡檢讀片第十七頁，共七十四頁。痰涂片抗酸菌濃度與陽性結(jié)果機率 檢出菌數(shù) 每毫升標本估算菌數(shù) 陽性結(jié)果機率0/100或更多視野 1000 101-2/300視野 5000 - 10000 501-9/100視野 約30000 801-9/10視野 約50000 90cv1-

8、9/每視野 約100000 96.2cv10或更多/每視野 約500000 99.95cv第十八頁，共七十四頁。查痰次數(shù)與陽性機率關(guān)系為什么診斷前強調(diào)三涂兩培3S 2C 1 2 3 4 5第十九頁，共七十四頁。細菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法顯微鏡檢報告方式：0條/300視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陰性1-8條/300視野：實報菌數(shù)3-9條/100視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽性+1-9條/10視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽性2+1-9條/1視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽性3+10條/1視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽性4+第二十頁，共七十四頁。細菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法本卷須知：選擇痰標本中膿性、血樣、干酪樣的局部涂片陽

9、性率較高；一張玻片只涂一份標本，玻片一次性使用，防止交叉污染；翻開痰盒、涂抹痰膜時容易產(chǎn)生氣溶膠，應(yīng)注意正確操作和自身防護；石炭酸復(fù)紅初染時必須加溫。第二十一頁，共七十四頁。細菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法優(yōu)點：是直接發(fā)現(xiàn)原菌的檢查方法，適用于痰、尿、便、體液、組織等幾乎一切標本，有重要的臨床診斷價值。是發(fā)現(xiàn)和確定傳染源的重要途徑，是考核和評價療效的重要指標，有重要的流行病學(xué)意義；操作簡便，價格低廉，適于各級實驗室開展；快速，數(shù)小時可報告結(jié)果。第二十二頁，共七十四頁。細菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法缺點：敏感性低：通常每毫升含5000-10000條以上抗酸菌才可得到陽性結(jié)果；特異性較低：只能報告“抗酸菌陽

10、性，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌；鏡下只能觀察菌體形態(tài)，不能區(qū)分死、活菌。第二十三頁，共七十四頁。涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng) 室內(nèi)質(zhì)控標本收集、染色液制備、涂片染色程序、顯微鏡鏡檢、顯微鏡的保養(yǎng)和維護、結(jié)果的報告和登記、痰片的分類保存等應(yīng)按照國家參比實驗室的統(tǒng)一標準嚴格進行操作。復(fù)查方式：自查：試驗員當(dāng)日對已查涂片抽樣復(fù)查。互查：由本實驗室其他試驗員抽查當(dāng)日10%涂片。第二十四頁，共七十四頁。涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng)室間質(zhì)控以現(xiàn)場和非現(xiàn)場督導(dǎo)為主要方式。現(xiàn)場督導(dǎo)：質(zhì)控實驗室人員赴被質(zhì)控實驗室就實驗室布局、平安防護、污染物處理、涂片染色操作、顯微鏡維護狀況、日常實驗記錄等進行考核和指導(dǎo)，并以盲法、按比例抽

11、取涂片復(fù)查。非現(xiàn)場督導(dǎo)：防治人員依據(jù)盲法、按比例的原那么抽取涂片交實驗室復(fù)查。第二十五頁，共七十四頁。復(fù)檢玻片樣本量1.樣本量估算：盲法復(fù)檢的關(guān)鍵是復(fù)檢結(jié)果能否真正代表被督導(dǎo)實驗室的實際水平。世界衛(wèi)生組織推薦80%靈敏度、100%特異性針對陰性玻片、誤差為0的可接受數(shù)量以及95%可信限樣本量表，可以極大地減少樣本量，保證了盲法復(fù)檢在統(tǒng)計學(xué)意義上可以代表被評估實驗室的總體水平。第二十六頁，共七十四頁。復(fù)檢樣本量計算表上一年陰性玻片的總數(shù) 玻片陽性率2.5%5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0%300185 129 101 80 67 59 50 400217 143 108 8

12、6 70 61 51 500243 154 114 89 71 62 52 700281 167 121 92 75 65 54 1000318 180 128 96 76 66 55 2000376 197 135 100 79 68 56 5000423 208 141 103 80 69 57 10000441 213 142 104 80 69 5720000450 215 143 104 82 69 57第二十七頁，共七十四頁。復(fù)檢樣本量計算表說明： a、玻片陽性率：指所有檢測的玻片中陽性玻片的比例平均陽性率。b、上一年陰性玻片總數(shù)：每年玻片的總數(shù)減去全年陽性玻片數(shù)。c、抽樣時，當(dāng)上

13、一年陰性玻片數(shù)量和玻片陽性率不在選擇點，陰性玻片數(shù)值采用區(qū)間上限，玻片陽性率采用區(qū)間下限。第二十八頁，共七十四頁。復(fù)檢結(jié)果評價盲法復(fù)檢的目的不是為了驗證某個病人診斷正確與否,而是評價整個實驗室操作水平。評價的內(nèi)容除了玻片鏡檢結(jié)果存在的誤差之外，還包括檢查標本的質(zhì)量合格標本與不合格標本的比例、涂抹的大小和厚度、染色質(zhì)量如何等,以便采取糾正措施，提高實驗室的工作質(zhì)量。第二十九頁，共七十四頁。1.誤差分類：分為定性誤差和定量誤差1定性誤差包括高假陽性和高假陰性高假陽性High False Positive HFP：陰性片被錯誤地判讀為2以上的陽性。高假陰性High False Negative HF

14、N：2以上的陽性玻片被錯誤地判讀為陰性。第三十頁，共七十四頁。2定量誤差包括量化誤差、低假陽性和低假陰性量化誤差Quantification Error ，QE：同一張陽性玻片初檢者和復(fù)檢者陽性判斷級別的差異。低假陽性Low False Positive ，LFP：陰性玻片被錯誤地判斷為1及以下的陽性。低假陰性Low False Negative， LFN：1及以下玻片被錯誤地判斷為陰性。第三十一頁，共七十四頁。常見“誤差原因誤差類型 可能原因 建議 假陽性（FP） 1)例如染料沉渣或結(jié)晶等被誤識為抗酸桿菌2)原始報告后著色的抗酸桿菌退色1）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)。2）對假陽性玻片重新染色并復(fù)檢。 假

15、陰性（FN） 1）觀察玻片的視野數(shù)量不足2）鏡檢技術(shù)能力差3）染色操作不規(guī)范（抗酸桿菌顏色暗淡、背景對比不足或過高）4）顯微鏡存在問題5）染液質(zhì)量差 1、2、3）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)4）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作狀態(tài)5）重新購置質(zhì)量合格的染料并重新配制染液 量化誤差（QE） 1）觀察玻片視野數(shù)量不足2）陽性玻片的分級報告標準掌握差3）鏡檢技術(shù)能力差4）顯微鏡存在問題 1.2.3）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)4）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作狀態(tài) 第三十二頁，共七十四頁。實驗室診斷的新進展1、擴大開展液體培養(yǎng)和藥敏試驗2、引入現(xiàn)代分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)3、引入現(xiàn)代免疫學(xué)快速檢測技術(shù)第三十三頁，共七十四頁。1、現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測主要技術(shù)

16、實時熒光定量PCR環(huán)介導(dǎo)等溫擴增基因檢測 ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP)分子線性探針Hain 技術(shù) (2022WHO推薦)基因芯片技術(shù)GeneXpert MTB/RIF 快速診斷技術(shù)第三十四頁，共七十四頁。1.1聚合酶鏈反響PCR PCR誕生于1985年，由美國 Muliis等創(chuàng)造。PCR是一種根據(jù)脫氧核糖核酸DNA復(fù)制原理而設(shè)計的體外DNA或核糖核酸RNA擴增方法，由高溫變性、低濕退火及適溫延伸等反響組成一個周期，經(jīng)過n個周期后，理論上可以獲得2n雙鏈DNA分子，使DNA特定區(qū)段大量擴增。此檢測技術(shù)靈敏度高、特異性強、簡便、快速

17、，但也存在假陰性、假陽性、污染等方面的問題，研究人員對其進行了不懈的研究，使該技術(shù)不斷得到改善，新的PCR及其衍生技術(shù)不斷建立。 第三十五頁，共七十四頁。實時熒光定量PCR 實時定量PCR(Real Time Quantitative PCR) 是指在PCR反響體系參加熒光基團，利用熒光積累能夠監(jiān)控PCR擴增的每一個循環(huán)，在靶擴增的同時可獲得定量的結(jié)果.即在同一個反響體系內(nèi)完成擴增和擴增產(chǎn)物的檢測,從而省去了靶擴增后復(fù)雜的定量檢測工作。第三十六頁，共七十四頁。實時熒光定量PCR該技術(shù)的優(yōu)勢在于其擴增產(chǎn)物的自動和實時檢測,減少了常規(guī)產(chǎn)物檢測步驟,也減少了人工判斷結(jié)果的主觀性，提高了結(jié)果的客觀性和

18、可比較性。同時工作效率大大提高。研究發(fā)現(xiàn)，該方法的特異性和敏感性較普通有所提高。與Southern雜交和酶促化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測的靈敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。第三十七頁，共七十四頁。1.2環(huán)介導(dǎo)等溫擴增基因檢測 ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP)檢測是連續(xù)等溫進行的。擴增效率十分高，反響靈敏。采用4條引物，識別6個位點，特異性強。不需要特殊的試劑與儀器，總費用很低。反響不需要開蓋，在一管內(nèi)完成全部檢測。利用Bst酶的鏈置換功能進行反響。參加反轉(zhuǎn)錄酶，可以完成的一步法檢測。第三十八頁，共七十四頁。Purification for

19、 Ultra Rapid Extraction (PURE)LAMP 方法PURE 方法等溫反響高擴增效率高特異性實驗周期短(幾乎一個小時)簡單去除核酸擴增抑制因子縮短處理時間Pre-treatment kitLAMP testSampleLysisMixtureFilterDNA第三十九頁，共七十四頁。LAMP 檢測陰性陽性不需要離心, 等溫, 快速 (整個過程只需一個小時)；DNA與SYBR Green結(jié)合現(xiàn)示綠色 ，Bst聚合酶于30分鐘到一個小時內(nèi)可將 毫微微克/毫升 (fg/ml)或500-100拷貝/毫升的DNA 或RNA擴增到10微克左右。 第四十頁，共七十四頁。LAMP 敏感度

20、101001000NCcopies/reaction模板: 純化的 TB 基因組DNA反響條件: 67, 40min第四十一頁，共七十四頁。LAMP結(jié)果分析儀器特點：1.LAMP檢測專用，每隔6秒測定反響產(chǎn)物的濁度2.可以設(shè)定相應(yīng)的反響條件與檢測要求3.測定結(jié)果可直接輸入電腦進行實時分析 4.檢測結(jié)果圖像等可以打印5.可同時檢測32個樣本，聯(lián)管適用第四十二頁，共七十四頁。1.3、分子線性探針Hain 技術(shù) 原理：基于PCR擴增的檢測方法。擴增后的產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反響判斷結(jié)果，可以鑒定TB和NTM、鑒定TB復(fù)合群、快速檢測RIF、INH、EMB、喹諾酮類、氨基糖苷類

21、耐藥性第四十三頁，共七十四頁。 GenoType 分支桿菌試劑盒系列GenoType MTBC 來自于培養(yǎng)標本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種間的鑒定GenoType Mycobacteria Direct來自于病人標本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定GenoType Mycobacterium CM來自于培養(yǎng)物的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌的鑒定GenoType Mycobacterium AS來自于培養(yǎng)物的其他非結(jié)核分枝桿菌的鑒定GenoType MTBDRplus 結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性檢測GenoType MTBDRsl 結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇、喹諾酮類、氨基糖苷

22、類耐藥性檢測第四十四頁，共七十四頁。技術(shù)設(shè)備TwinCubator 手工雜交儀第四十五頁，共七十四頁。自動操作-全自動雜交儀GT-Blot48 或 GT-Blot 20第四十六頁，共七十四頁。GenoType MTBDRplus結(jié)果MTBC及其對利福平和/或異煙肼的耐藥性第四十七頁，共七十四頁。 適用于培養(yǎng)物和痰液。 檢測快速，對于直接采集的樣本或陽性培養(yǎng)物在數(shù)小時后內(nèi)即可完成檢測； 檢測INH單耐藥型TB、MDR和XDR； 符合WHO推薦的線性探針分析標準。GenoType MTBDRplus/sl 優(yōu)點第四十八頁，共七十四頁。驗證數(shù)據(jù)產(chǎn)品目的材料靶點敏感性 專屬性 對照方法 *GenoTy

23、pe Mycobacterium CM普通分支桿菌的鑒定陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA97 %93,5 %測序；生化技術(shù)GenoType Mycobacterium AS其他菌種的鑒定陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA96 %94 %測序；生化技術(shù)GenoType MTBC結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的菌種區(qū)分陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA100 %100 % 生化技術(shù)；分子遺傳學(xué)方法GenoType MTBDRplus結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的鑒定及其對利福平和/或異煙肼的耐藥性直接采集的標本（顯微鏡檢查陽性，經(jīng)過純化）；陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA直接采集的標本RMP: 96,8 %INH: 90,2 %固體/液體

24、培養(yǎng)物RMP: 98,7 %INH: 92 %直接采集的標本RMP: 95%INH: 100 %固體/液體培養(yǎng)物RMP: 100 %INH: 100 %傳統(tǒng)的藥敏試驗 (DST)GenoType MTBDRsl結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的鑒定及其對氟喹諾酮類和/或氨基糖苷類/環(huán)肽和/或乙胺丁醇的耐藥性直接采集的標本（顯微鏡檢查陽性，經(jīng)過純化）；陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA 直接采集的標本氧氟沙星： 88,9 %阿米卡星/卷曲霉素： 75 %乙胺丁醇： 38,5 %固體/液體培養(yǎng)物*氧氟沙星： 90,6 %阿米卡星/卷曲霉素： 84,8 %乙胺丁醇： 69,2 %直接采集的標本氧氟沙星： 100 %阿米

25、卡星/卷曲霉素： 100 %乙胺丁醇： 100 %固體/液體培養(yǎng)物氧氟沙星： 100 %阿米卡星/卷曲霉素： 100 %乙胺丁醇： 100 %傳統(tǒng)的藥敏試驗 (DST)GenoType Mycobacteria Direct結(jié)核分支桿菌復(fù)合群鳥分支桿菌M. avium、胞內(nèi)分支桿菌M. intracellulare、堪薩斯分支桿菌M. kansasii、瑪爾摩分支桿菌M. malmoense的鑒定經(jīng)純化后的直接采集的標本RNA涂片陽性樣本97,5% 涂片陰性樣本83,3 %涂片陽性樣本99 %培養(yǎng)第四十九頁，共七十四頁。結(jié)論DNA-Strip技術(shù)系列涵蓋了分枝桿菌菌種鑒定、TB-復(fù)合群的區(qū)分和

26、藥敏試驗。所有檢測都采用通用試劑盒和相同的方案進行擴增和雜交。 所有檢測均可在4-5小時內(nèi)完成。本法適用于大樣本量的檢測每天檢測數(shù)百份樣品。第五十頁，共七十四頁。1.4、基因芯片技術(shù)科學(xué)的開展人類的進步要求進行大規(guī)?；蛐畔⒌慕馕?鑒于基因芯片的多種用途和其遠大的開展前景，不少生命科學(xué)研究機構(gòu)和生物技術(shù)公司都先后參與了這項技術(shù)的研究。據(jù)不完全統(tǒng)計目前僅國內(nèi)就有十多家單位從事該技術(shù)的研究與開發(fā)工作，全世界估計至少有二三十家。它已象半導(dǎo)體技術(shù)一樣成為一個重要的產(chǎn)業(yè)方向。當(dāng)前已正被廣泛地應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，包括生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷學(xué)和基因組學(xué)研究。第五十一頁，共七十四頁。什么是基因芯片基因芯片指對數(shù)以千記

27、的DNA片段同時進行處理分析的技術(shù)，諸如基因組DNA突變譜和mRNA表達譜的檢測等Trends in Biotechnology)。 該技術(shù)系指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。第五十二頁，共七十四頁。基因芯片技術(shù)的主要特點技術(shù)操作簡單 自動化程高 序列數(shù)量大 檢測效率高 應(yīng)用范圍廣 本錢相對低第五十三頁，共七十四頁。博奧 分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)主要分為樣品制備、芯片反響和結(jié)果判讀三局部。首先，將檢測菌的DNA從培養(yǎng)、別離純化的菌株或者直接從臨床樣品中提取出來；然后，對樣品中的靶基因

28、進行擴增和熒光標記；接著，將擴增并熒光標記的基因序列與芯片上的探針進行雜交反響；最后芯片掃描成像，用配套軟件進行判讀。第五十四頁，共七十四頁。芯片掃描結(jié)果 1第五十五頁，共七十四頁。 臨床驗證第五十六頁，共七十四頁。1.5GeneXpert MTB/RIF快速診斷技術(shù)Cepheid MTB/RIF: 可直接檢測痰液，檢測結(jié)核分支桿菌的同時，鑒定是否有利福平耐藥性， 2小時出結(jié)果。GeneXpert檢測平臺采用實時熒光定量PCR檢測原理。所有檢測均無需提取核酸，手工操作時間不超過2分鐘。第五十七頁，共七十四頁。GeneXpert 最大程度簡化TB檢測！將痰液參加處理瓶，放置15分鐘；將處理后的樣

29、品參加樣品反響盒；將該盒子放置在GeneXpert中，輕松按下“開始鍵；得到結(jié)果2小時：檢測是否含有結(jié)核分支桿菌的同時，可對利福平耐藥性進行判讀。第五十八頁，共七十四頁。Xpert MTB/RIF檢測操作步驟1、痰液參加處理瓶， 放置15分鐘。2、取處理后的痰液 2mL參加Xpert反響 試劑盒3、將反響試劑盒放入 GeneXpert儀器， 點擊“開始手工操作至此結(jié)束！4、自動過濾洗滌樣品5、自動超聲破碎，純化 樣品6、熒光定量PCR擴增7、巢氏PCR擴增8、自動結(jié)果判讀 MTB/RIF第五十九頁，共七十四頁?！癝ample in. Answer out. 全自動操作 完全封閉系統(tǒng) 污染可能性

30、小 減少人為錯誤 結(jié)果精確度高 檢測時間短無需專業(yè)技術(shù)人員和特殊實驗室第六十頁，共七十四頁。研究人數(shù) 1,700 Patients 秘魯、南非、阿塞拜疆、印度 涂片陽性樣品： 靈敏性98.2%,特異性99.2% 涂片陰性, 培養(yǎng)陽性樣品： 三次檢測靈敏性 90.2% 一次檢測靈敏性72.5% 對利福平耐藥性檢測： 靈敏性97.6%,特異性98.1%第六十一頁，共七十四頁。結(jié)論GeneXpert檢測Mtb簡單、易于操作，對操作者技術(shù)要求不高：只需要把痰液、反響液參加儀器即可得出診斷報告；GeneXpert檢測Mtb快速：整個過程大約2小時。GeneXpert檢測Mtb對操作人員平安：整個檢測過程

31、全封閉、一次性完成。高靈敏性：BCG176 cfu/ml；H57Rv112 cfu/ml耐藥性診斷：可對利福平耐藥性進行檢測第六十二頁，共七十四頁?，F(xiàn)代免疫學(xué)診斷技術(shù)1、體液免疫診斷技術(shù)：是利用結(jié)核分枝桿菌或其提取物抗原檢測結(jié)核病患者血清抗體的方法。目前，通過檢測抗結(jié)核桿菌的抗體(IgG)診斷結(jié)核病的商品化試劑盒已較多。采用的方法包括：酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA)和免疫金標記技術(shù)的免疫層析法和膠體金標記的滲濾法等，采用的抗原也各不相同。第六十三頁，共七十四頁。體液免疫學(xué)診斷技術(shù)的意義在國內(nèi)應(yīng)用較廣泛，是結(jié)核病的輔助診斷方法之一,尤其對肺外結(jié)核、菌陰肺結(jié)核的診斷具有應(yīng)用價值。缺乏之處：單獨使用時

32、，其檢測的特異性和靈敏度都有些缺點。目前國際上反對使用該項技術(shù)的呼聲在增加。原因主要是特異性問題。 第六十四頁，共七十四頁。2、細胞免疫學(xué)診斷技術(shù)細胞免疫診斷技術(shù)應(yīng)用較少，過去主要應(yīng)用PPD皮試技術(shù)，近年來英國和澳大利亞研制了ELISpot 、T-Spot技術(shù)和 QFT-Gold 。此項技術(shù)用于感染情況的檢測是一項特異性較強、靈敏度較高很有希望的新技術(shù)。第六十五頁，共七十四頁。酶聯(lián)免疫斑點(ELISpot)技術(shù) 是檢測細胞分泌細胞因子的一種實驗方法，采用可定量的夾心ELISA方法，利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6 & CFP-10刺激和激活免疫活性細胞使其產(chǎn)生IFN-，并檢測IFN-的濃

33、度變化進行診斷的方法。通過ELISpot酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對加底物后形成的斑點分析后得出結(jié)果。ELISpot具有較高的特異性和敏感性。第六十六頁，共七十四頁。ELISPOT技術(shù)原理細胞免疫主要由T淋巴細胞發(fā)動，T淋巴細胞分成效應(yīng)T淋巴細胞和記憶T淋巴細胞。記憶T淋巴細胞在首次感染病原體后長期存在免疫系統(tǒng)中。當(dāng)再次受到感染刺激后。這些記憶T淋巴細胞發(fā)出信號分子并增殖成為效應(yīng)T淋巴細胞，效應(yīng)T淋巴細胞分泌細胞因子，如 干擾素(INF- )。所以無論是否有臨床病癥，檢測效應(yīng)T淋巴細胞在血中的水平可作為機體是否被感染的指標。第六十七頁，共七十四頁。ELISPOT在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用在MTB潛伏感染診斷中的應(yīng)用早期診斷MTB潛伏感染對控制結(jié)核病意義重大。目前診斷MTB潛伏感染仍沿用100年來使用的 TST，但 TST不能區(qū)分MTB感染患者和接種BCG的健康人以及感染環(huán)境中的分枝桿菌患者。Lalvani在土耳其檢查了暴露于肺結(jié)核家庭環(huán)境中的908名健康兒童。皮試結(jié)果說明580名兒童患有潛伏性肺結(jié)核,需要進行藥物治療,以免轉(zhuǎn)化為活動性肺結(jié)核;而ELISPOT結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有380名兒童