齊魯醫(yī)學(xué)β-防御素-3在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌呼吸機相關(guān)性肺炎大鼠肺組織中的

1、精品醫(yī)學(xué)文檔 精品醫(yī)學(xué)文檔 7/7精品醫(yī)學(xué)文檔 -防御素-3在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌呼吸機相關(guān)性肺炎大鼠肺組織中的表達 作者單位：430022 武漢，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科，武漢 430022武慶平 桂平 姚尚龍【摘要】 目的 研究大鼠耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）呼吸機相關(guān)性肺炎（VAP）時肺組織中-防御素-3（BD-3）的表達，以探討其在VAP發(fā)病機制中的作用。方法 20只清潔級雄性SD大鼠隨機分為2組（n=10），非通氣肺炎組（N組）和呼吸機相關(guān)性肺炎組（V組）。N組大鼠經(jīng)口氣管插管后立即接種2109菌落形成單位（cfu）

2、的MRSA，V組大鼠經(jīng)口氣管插管并進行4h保護性機械通氣后氣管內(nèi)接種相同數(shù)量的細(xì)菌。接種后48 h處死大鼠，測定肺濕重與體重比（WW/BW），記錄肺肉眼和病理學(xué)評分，并進行肺組織細(xì)菌計數(shù)和脾培養(yǎng)，免疫組化檢測肺組織BD-3的表達。結(jié)果 與N組比較，V組WW/BW，肺病理學(xué)積分，肺組織細(xì)菌含量和菌血癥發(fā)生率均顯著升高（P均0.01），而BD-3的表達顯著降低（P0.01）。結(jié)論 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌呼吸機相關(guān)性肺炎（MRSA VAP）顯著重于非通氣肺炎，這可能與機械通氣降低了BD-3的表達有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；呼吸機相關(guān)性肺炎；防御素Expression of beta-

3、defensin-3 in lungs of rats with methicillin-resisitant Staphylococcus aureus ventilator-associated pneumonia GUI Ping Department of Anesthesiology , Union Hospital , Tongji Medical College , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430022 , China Abstract Objective To study the express

4、ion of beta-defensin-3(BD-3) in lungs of rats with methicillin-resisitant Staphylococcus aureus(MRSA) ventilator-associated pneumonia(VAP) and to investigate the role of BD-3 in the pathogenesis of VAP. Twenty specific pathogen-free male Sprague-Dawley rats weighing 242286g were randomly divided int

5、o 2 groups: nonventilated pneumonia group(group N, n=10) and ventilator-associated pneumonia group(group V, n=10). Rats in group N were infected intrabronchially with 2109 colony-forming units(cfu) MRSA immediately after oral intubation while rats in group V were infected intrabronchially with the s

6、ame amount of MRSA after oral intubation and 4 hours, protective mechanical ventilation. Rats from both groups were killed 48 h after inoculation. Lung wet weight to body weight ratios(WW/BW) were measured, lung macroscopic and microscopic scores were recorded, lung bacterial counts and spleen cultu

7、re were also done. Expression of BD-3 in lung of rats was detected by immunohistochemistry staining. Results WW/BW, lung microscopic score, bacterial pulmonary concentration and the incidence of bacteremia in group V were significantly higher than in group N(P0.01), while expression of BD-3 was sign

8、ificantly lower than in group N(P0.01). Conclusion Ventilator-associated pneumonia is more severe than nonventilated pneumonia，this may be related to the reduced expression of BD-3 by mechanical ventilation.Key words methicillin-resisitant Staphylococcus aureus; pneumonia, ventilator-associated; def

9、ensin呼吸機相關(guān)性肺炎（VAP）是重癥監(jiān)護室最重要的感染并發(fā)癥，接受機械通氣的病人8%-28%會并發(fā)VAP，其死亡率高達24%-50%1。VAP治療失敗率如此之高的原因之一就是多重耐藥病原體的感染，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是VAP常見的多重耐藥病原體2。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌呼吸機相關(guān)性肺炎（MRSA VAP）已成為重癥監(jiān)護室里的一大挑戰(zhàn)。-防御素-3（BD-3）是防御素家族中的一個成員，是上皮細(xì)胞分泌的一種重要的固有免疫效應(yīng)分子，具有廣譜高效的抗微生物活性，包括多重耐藥的金黃色葡萄球菌，BD-3還能趨化單核細(xì)胞3。本實驗擬建立MRSA VAP的大鼠模型，觀察BD-3表達的變

10、化，探討B(tài)D-3在MRSA VAP發(fā)病機制中的作用。材料與方法MRSA臨床分離株（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院檢驗科）；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉（Oxoid公司，英國）；小鼠抗人BD-3單克隆抗體（immundiagnostik公司，德國）；SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；683型小動物容量控制呼吸機（Harvard Apparatus公司，美國）；HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)（武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司）。MRSA臨床分離株接種于液體LB培養(yǎng)基（1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化鈉），于37C 220rpm的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)79 h，取菌液0.1

11、ml，用液體LB培養(yǎng)基進行10倍系列稀釋，各取0.1 ml接種于固體LB培養(yǎng)基（1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化鈉、2%瓊脂粉），于37C的細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后計算菌液的濃度，用生理鹽水稀釋成1010 cfu/ml備用。清潔級雄性SD大鼠20只，體重242286 g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，隨機分為2組（n10）：非通氣肺炎組（N組）和呼吸機相關(guān)性肺炎組（V組）。腹腔注射20%烏拉坦1.3 g/kg麻醉后，N組大鼠直視下應(yīng)用額鏡經(jīng)口氣管插管（16G211的靜脈套管針代替氣管導(dǎo)管），確認(rèn)導(dǎo)管在氣管內(nèi)后，經(jīng)氣管導(dǎo)管注入0.2 ml 1010cfu/ml的菌液，拔出氣管導(dǎo)管

12、；V組大鼠直視下應(yīng)用額鏡經(jīng)口氣管插管，確認(rèn)導(dǎo)管位置正確后，連接到683型小動物容量控制呼吸機進行保護性機械通氣，通氣參數(shù)設(shè)置如下：潮氣量6 ml/kg，呼吸頻率88次/min，呼氣末正壓5 cmH2O，吸入氧濃度21%，大鼠口腔填塞紗布條以防止漏氣，通氣4 h后經(jīng)氣管導(dǎo)管注入0.2 ml 1010cfu/ml的菌液，拔出氣管導(dǎo)管。2組大鼠均于接種后48 h處死。處死大鼠前稱體重（BW），開胸完整分離出肺并稱重（WW），計算肺濕重與體重比（WW/BW）。記錄肺肉眼評分，每一葉的評分按以下標(biāo)準(zhǔn)進行：正常（0），瘢痕（1），輕度充血（2），紅色充血（3），灰色充血（4）和淺黃色充血（5）4。從每一葉

13、肺（左肺、右肺前葉、右肺中葉、右肺后葉和右肺副葉）固定位置各取1 cm左右大小的組織塊，用于組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測，肺組織浸于4的多聚甲醛固定，于一系列濃度梯度的乙醇中脫水，石蠟包埋、切片，一部分切片HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變，組織病理學(xué)評分按以下標(biāo)準(zhǔn)進行：正常（0），膿性粘液栓（1），支氣管炎（2），支氣管肺炎（3），融合性支氣管肺炎（4）和肺膿腫（5）5。另一部分切片用于免疫組化法檢測肺組織BD-3表達， DAB染色，陽性染色為胞漿染成棕黃或棕褐色。陰性對照采用PBS代替一抗。每張切片隨機選取5個視野（200），圖象采用HMIAS-2000型全自動彩色圖像分析系統(tǒng)進行蛋白半

14、定量分析，以光密度反映BD-3蛋白含量。余下的肺組織稱重后加1 ml生理鹽水勻漿，取勻漿液0.1 ml 10倍系列稀釋后培養(yǎng)計數(shù)，肺組織細(xì)菌濃度以log10 cfu/g肺組織表示。分離出脾臟后，無菌生理鹽水沖洗，勻漿后涂抹接種于LB瓊脂平板，如有菌落生長，挑取菌落革蘭染色，排除假陽性，真陽性表明發(fā)生了菌血癥。采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，菌血癥發(fā)生率的比較采用u檢驗，P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果2組大鼠發(fā)生的都是雙側(cè)不對稱多病灶性肺炎，病變多以右肺后葉最為嚴(yán)重，見圖 1。V組肺炎較N組重，無論是組織病理學(xué)方面還是細(xì)菌學(xué)方面

15、。與N組比較，WW/BM和病理學(xué)評分顯著升高（P均0.05），見表 1，肺細(xì)菌濃度和菌血癥發(fā)生率也顯著升高（P均0.01），見表2。圖 1 2組右肺后葉病理學(xué)結(jié)果（HE染色，200）表 1 2組WW/BM，肉眼評分和病理學(xué)評分的比較（n=10，）組別WW/BW（102）肉眼評分病理學(xué)評分N組0.990.1112.11.511.71.2V組1.210.10*12.61.313.41.2*與N組比較，* P0.01表 2 2組肺細(xì)菌濃度和菌血癥發(fā)生率的比較（n=10，）組別肺細(xì)菌濃度（log10cfu/g）菌血癥發(fā)生率N組8.70.420%(2/10)V組12.20.9*90%(9/10)*與N組

16、比較，* P0.01BD-3主要表達于支氣管上皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞，見圖2。N組和V組的平均光密度值分別是1.160.10和0.770.11，與N組比較，V組的BD-3表達顯著降低（P0.01）。圖 2 2組右肺中葉BD-3的表達（DAB顯色，200）討論VAP是重癥監(jiān)護室最重要的感染并發(fā)癥，MRSA VAP成為一重大挑戰(zhàn)。VAP的病理學(xué)特點是雙側(cè)不對稱多局灶性肺炎，尤以下肺最為嚴(yán)重，不同階段的病變共存6。VAP是感染和呼吸機相關(guān)性肺損傷共同作用的結(jié)果。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)氣管接種108或109 cfu的MRSA引起的肺炎病變較輕，而經(jīng)氣管接種2109 cfu的MRSA引起的肺炎病理學(xué)改變符合VAP病理

17、學(xué)特點，所以本實驗采用經(jīng)氣管接種2109 cfu的MRSA。本實驗采用的通氣模式在原先的基礎(chǔ)上7進行了改進，采用的是小潮氣量加呼吸末正壓通氣保護性通氣，一是因為大潮氣量通氣能導(dǎo)致明顯的肺損傷，小潮氣量加呼吸末正壓通氣是重癥監(jiān)護室最常用的通氣模式，因而更貼近臨床，二是因為新的小動物呼吸機能達到這種要求。VAP的評估主要從病理學(xué)和細(xì)菌學(xué)兩方面進行，與N組比較，WW/BM，病理學(xué)評分，肺細(xì)菌濃度和菌血癥發(fā)生率均顯著升高，表明4 h 的保護性通氣后經(jīng)氣管接種2109 cfu的MRSA能成功制作MRSA VAP大鼠模型。BD-3是重要的抗微生物肽，在肺的固有免疫中發(fā)揮重要作用。低濃度的BD-3能殺滅革蘭

18、陰性細(xì)菌（大腸埃希菌，銅綠色假單胞菌），革蘭陽性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌，化膿性鏈球菌），白假絲酵母菌甚至多重耐藥的金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素的屎腸球菌，表現(xiàn)出廣譜的抗微生物活性，在生理范圍內(nèi)增加鹽濃度并不會降低BD-3的抗微生物活性，BD-3的濃度即使達到500 g/ml也不會產(chǎn)生明顯的溶血3,8。BD-3還能趨化單核細(xì)胞，在正常肺組織中表達很少，BD-3基因5，端有轉(zhuǎn)錄因子STAT結(jié)合位點，BD-3的表達調(diào)節(jié)呈非NF-B依賴形式，所以TNF-，IL-1和IL-6都不能上調(diào)其表達9。而IFN-發(fā)揮效應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路主要是JAK-STAT途徑10，所以其能上調(diào)BD-3的表達。侵入機體細(xì)菌的組分（革

19、蘭陰性細(xì)菌的脂多糖和革蘭陽性細(xì)菌的脂磷壁酸）通過Toll樣受體和CD14分子激活肺巨噬細(xì)胞分泌IFN-11，IFN-進而上調(diào)氣道上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞表達BD-3，所以N組BD-3的表達呈強陽性。上皮細(xì)胞分泌的BD-3和BD-3趨化來的巨噬細(xì)胞有助于殺滅細(xì)菌或者限制細(xì)菌的蔓延。V組的肺炎顯著重于N組，2組接種的MRSA數(shù)量相同，唯一的不同是V組在接種前進行了4 h的保護性機械通氣，說明4 h的保護性機械通氣已經(jīng)造成了一定程度的肺損傷。在機械通氣的患者，氣管插管使有菌的上呼吸道和無菌的下呼吸道直接相通，口咽部定植的細(xì)菌和胃腸道返流的細(xì)菌從氣管套囊周圍滲漏到下呼吸道引起VAP12。本實驗使用的是清

20、潔級大鼠，并引入外源性的細(xì)菌，與實際的病理生理過程有一定的區(qū)別。先期的離體研究發(fā)現(xiàn)4 h 的機械拉伸能顯著抑制IFN-誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞BD-3的表達13，本在體實驗表明4 h的保護性機械通氣也能顯著減少支氣管上皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞BD-3的表達。BD-3表達減少不利于細(xì)菌的局限和清除，所以V組的肺細(xì)菌濃度和菌血癥的發(fā)生率顯著高于N組。綜上所述，4 h的保護性機械通氣后經(jīng)氣管接種2109 cfu的MRSA能成功制作MRSA VAP大鼠模型，BD-3表達減少可能是MRSA VAP顯著重于非通氣肺炎的原因之一。參考文獻1 Chastre J , Fagon JY. Ventilator-associ

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