核糖體展示技術(shù)

1、核糖體展示技術(shù)生物工程1001班 郭倩倩 1 核糖體展示技術(shù) (Ribosome Display Technology, RDT) 是由Plckthun 實(shí)驗(yàn)室在多聚核糖體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來的一種利用功能性蛋白相互作用進(jìn)行篩選的新技術(shù)，它將正確折疊的蛋白及其 mRNA同時(shí)結(jié)合在核糖體上， 形成mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體，使目的蛋白的基因型和表型聯(lián)系起來，可用于抗體及蛋白質(zhì)文庫(kù)選擇、蛋白質(zhì)體外改造等。運(yùn)用此技術(shù)已成功篩選到一些與靶分子特異結(jié)合的高親和力蛋白質(zhì)， 包括抗體、 多肽、 酶等， 是蛋白質(zhì)篩選的重要工具。2原理 核糖體展示技術(shù)通過聚合酶鏈反應(yīng) （PCR）擴(kuò)增DNA文庫(kù)，同時(shí)引入

2、T7 啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及莖-環(huán)結(jié)構(gòu)， 將其轉(zhuǎn)錄成 mRNA，在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中進(jìn)行翻譯， 使目的基因的翻譯產(chǎn)物展示在核糖體表面，形成“mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)” 復(fù)合物，構(gòu)成核糖體展示的蛋白文庫(kù)， 然后用相應(yīng)的抗原從翻譯混合物中進(jìn)行篩選， 以乙二胺四乙酸（EDTA）解離結(jié)合的核糖體復(fù)合物或以特異抗原洗脫整個(gè)復(fù)合物，并從中分離mRNA。通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT- PCR） 提供下一輪展示的模板，所得 DNA進(jìn)入下一輪富集，部分 DNA可通過克隆進(jìn)行測(cè)序分析等。3 啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。啟動(dòng)子（Promoters）就像“開關(guān)”，決定基因的

3、活動(dòng)。啟動(dòng)子也應(yīng)由DNA組成。啟動(dòng)子本身并不控制基因活動(dòng)，而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄因子的這種蛋白質(zhì)結(jié)合而控制基因活動(dòng)的。質(zhì)粒設(shè)計(jì)時(shí)都需要加入啟動(dòng)子序列，以保證目的基因的表達(dá)。啟動(dòng)子可分為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子兩大類，后者包括CMV，SV40，T7, pMC1，PGK啟動(dòng)子等 。4產(chǎn)生 Kawasaki 曾建議采用類似的途徑從肽庫(kù)中篩選多肽配體。在此之前，利用前期多肽抗體進(jìn)行免疫沉淀，已經(jīng)分離到了與核糖體和多肽偶聯(lián)的mRNA。Mattheakis等人首次將前人的設(shè)想付諸實(shí)踐，建立了篩選多肽類配體的多聚核糖體展示技術(shù)，并從一個(gè)庫(kù)容為1012的肽庫(kù)中，篩選到親和力常數(shù)達(dá)到109 (nmol級(jí)) 的固定

4、化單抗的多肽配體。Gersuk等人利用該技術(shù)也篩選到前列腺癌腫瘤標(biāo)記的多肽配體。體外翻譯時(shí)，蛋白或多肽的折疊與翻譯同步進(jìn)行。與核糖體結(jié)合的天然多肽也具有酶活性。5 這些研究結(jié)果說明，如果某種蛋白質(zhì)的折疊不受核糖體蛋白通道的影響，那么與核糖體的解離就不是該蛋白獲得天然構(gòu)像的必要條件。1997年，Plckthun實(shí)驗(yàn)室在以上研究成果的基礎(chǔ)上，對(duì)Mattheakis的多聚核糖體展示技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，建立了體外篩選完整功能蛋白(如抗體）的新技術(shù)：核糖體展示技術(shù)。67操作步驟1.基因片段的改造 為了使基因片段能有效轉(zhuǎn)錄和翻譯,5端應(yīng)接上T7啟動(dòng)子序列和SD序列，去掉3端的終止密碼子,從而成功地使核糖體停留

5、在mRNA3末端,將蛋白質(zhì)和mRNA連接在一起。在對(duì)基因片段改造時(shí),常進(jìn)行多次延伸PCR：分別將需要的基因片段和間隔序列各自擴(kuò)出來用引物 4 和引物 5 做連接 PCR 將目的基因和間隔子連接起來，引物5含有SD序列, 引物4含有3端莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列。 PCR產(chǎn)物再進(jìn)行延伸PCR,引物6含有T7啟動(dòng)子序列和5端莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列,下游產(chǎn)物同前。最后得到的PCR產(chǎn)物,5端接上T7啟動(dòng)子和莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及SD序列,3端則融合了間隔序列并含有3端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。82.體外轉(zhuǎn)錄和翻譯 體外表達(dá)可以利用來自原核的E.coliS30無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng),或真核的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液和麥胚提取物的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng),至于何種系統(tǒng)更

6、適合,目前尚有爭(zhēng)議.體外轉(zhuǎn)錄與體外翻譯可以偶聯(lián)進(jìn)行,也可以分別進(jìn)行.目前,已有以DNA 為模板的體外蛋白翻譯系統(tǒng)和以RNA為模板的體外轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)的商用系統(tǒng)問世。（1）對(duì)于含二硫橋的ScFv抗體(單鏈抗體）和其它蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)錄和翻譯應(yīng)分別進(jìn)行,因?yàn)楹卸驑虻牡鞍踪|(zhì)要在氧化條件下才能正確折疊,但轉(zhuǎn)錄時(shí),T7 RNA聚合酶要求具還原性的-巰基乙醇維持其穩(wěn)定性。如果目標(biāo)蛋白在還原性條件下能正確折疊,則體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)體系效果可能更好.。9（2）若分別進(jìn)行,則需要控制RNase的影響。VRC過渡態(tài)類似物作為RNase抑制劑,能有效抑制核酸酶,提高E.coli核糖體展示效率。翻譯結(jié)束后立即冷卻反應(yīng)混

7、合物,所有篩選步驟在冰上進(jìn)行降低RNase的影響。另外,3端和5端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)也可以使mRNA避免核酸外切酶RNase和核酸內(nèi)切酶RNase E的影響。103.親和篩選 體外翻譯反應(yīng)結(jié)束后,將翻譯混合物稀釋4倍終止反應(yīng)。反應(yīng)試劑中始終保持5 mmol/L Mg2+濃度，穩(wěn)定mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三元復(fù)合體。可以直接用于篩選實(shí)驗(yàn)，也可以于4保存，核糖體復(fù)合物在4至少可以穩(wěn)定10 d，但產(chǎn)量會(huì)逐漸減少。體外篩選時(shí)加入1%-2%脫脂奶粉和0.2%肝素可以降低抗原-抗體的非特異性反應(yīng),肝素還能抑制核酸酶。11親和篩選 分為固相篩選和液相篩選，主要有ELISA和磁珠法。Hanes等認(rèn)為,ELISA方法中

8、，抗原包被在塑料表面上，而塑料表面的疏水作用有可能會(huì)影響吸附蛋白的空間構(gòu)象，從而導(dǎo)致篩選出的抗體分子不能識(shí)別抗原的天然表位;磁珠法是在抗原上連接捕獲標(biāo)簽，如生物素，然后在形成抗原-抗體復(fù)合物后,采用磁珠-鏈霉親和素捕獲該標(biāo)簽,進(jìn)行親和篩選。mRNA的分離 篩選完后，加入含20 mmol/L EDTA的冰冷緩沖液洗脫mRNA。洗脫下來的mRNA用DNase處理去除殘留的DNA模板，進(jìn)行RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR）反應(yīng)重新引入T7啟動(dòng)子和SD序列等核糖體展示必需元件用于下一輪展示或直接進(jìn)行Northern雜交，評(píng)價(jià)篩選效率。將最后一輪篩選到的靶標(biāo)基因與質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，可以得到單個(gè)靶標(biāo)克

9、隆。進(jìn)一步采用體外或體內(nèi)(分泌型或包涵體型)表達(dá)方式表達(dá)單鏈抗體分子,進(jìn)行活性鑒定。124.體外分子定向進(jìn)化 用核糖體展示技術(shù)對(duì)未變異的文庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí),可以通 過易錯(cuò)PCR或(DNA shuffering)等方法引入突變和重組技術(shù),增加分子多樣性,從而提高獲得高親和力、良好穩(wěn)定性或增加酶活性靶標(biāo)分子的機(jī)率。Plckthumx小組利用核糖體展示技術(shù)篩選到1.1 nmol高親和力的ScFv,之后通過引入DNA重排技術(shù),又將其親和力提高。13優(yōu)勢(shì) 核糖體展示技術(shù)完全在體外進(jìn)行,與噬菌體或酵母菌展示技術(shù)相比具有建庫(kù)簡(jiǎn)單、庫(kù)容量大、分子多樣性強(qiáng)、篩選方法簡(jiǎn)便、無需選擇壓力,還可通過引入突變和重組技術(shù)來提

10、高靶標(biāo)蛋白的親和力等優(yōu)點(diǎn),是一種篩選大型文庫(kù)和獲取分子進(jìn)化強(qiáng)有力的方法。14問題1.如何進(jìn)一步地提高該系統(tǒng)的穩(wěn)定性；特別是如何防止mRNA的降解和形成穩(wěn)固的蛋白質(zhì)-核糖體-mRNA三聚體無疑是該技術(shù)的關(guān)鍵問題。2.如何提高大分子蛋白質(zhì)在核糖體上的展示也是未來研究需要關(guān)注的問題。15發(fā)展趨勢(shì)及前景 隨著對(duì)核糖體展示技術(shù)的進(jìn)一步研究,以上問題將逐步得到解決,核糖體展示技術(shù)作為一種新興的克隆展示技術(shù),必將在蛋白質(zhì)相互作用研究、新藥開發(fā)以及蛋白組學(xué)等方面顯示出更為廣泛的應(yīng)用空間。16 核糖體展示技術(shù)克服了傳統(tǒng)篩選技術(shù)庫(kù)容量小和篩選效率低等缺陷。該技術(shù)完全在體外進(jìn)行,其文庫(kù)容量不受細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響,庫(kù)容量和篩選效率得到很大提高,可與其他技術(shù)相組合,在體外分子高效表達(dá)和定向進(jìn)化方面具有廣泛的應(yīng)用前景。17綜上所述，核糖體展示技術(shù)，這種體外