蛋白質(zhì)組學(xué)課件

1、蛋白質(zhì)組學(xué)課件蛋白質(zhì)組學(xué)內(nèi)容1：什么是蛋白質(zhì)組學(xué)，為什么研究蛋白質(zhì)組學(xué)2：蛋白質(zhì)組學(xué)研究?jī)?nèi)容3：蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略（本公司提供的服務(wù)） 3.1：比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。 3.2：蛋白質(zhì)翻譯后研究方法。4：蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病，植物，動(dòng)物等方面的的應(yīng)用 1：蛋白質(zhì)組學(xué)定義及研究意義1.1：蛋白質(zhì)組學(xué)定義（proteome) 一個(gè)基因組，一個(gè)細(xì)胞或組織，一種生物在一定時(shí)間，一定條件下所表達(dá)的全部蛋白組成，存在形式，活動(dòng)方式及時(shí)空動(dòng)態(tài)。1.2：為什么除基因組學(xué)外還要研究蛋白質(zhì)組學(xué)： （1）蛋白質(zhì)是功能的執(zhí)行者。 （2）基因組與蛋白質(zhì)組不一樣：轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪切，翻譯后的修飾等等，導(dǎo)致蛋白質(zhì)組遠(yuǎn)比基因組復(fù)

2、雜。 （3）與基因組相比，蛋白質(zhì)組具有以下特點(diǎn)：多樣性，無(wú)限性，動(dòng)態(tài)性，相互作用，時(shí)空變化，需要多種技術(shù)，組學(xué)間的互助 2：蛋白質(zhì)組學(xué)研究?jī)?nèi)容2.1：蛋白質(zhì)的表達(dá)模式 （1）生理、病理或不同發(fā)育狀態(tài)下蛋白質(zhì)組表達(dá)差異蛋白質(zhì)信息庫(kù)。 （2）蛋白質(zhì)及其組成質(zhì)點(diǎn)的分離、分析、鑒定。2.2：蛋白質(zhì)的功能模式 （1）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。 （2）蛋白之間相互作用，翻譯后修飾，細(xì)胞定位等。 2.1：蛋白質(zhì)組學(xué)研究?jī)?nèi)容 2.3：蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略（本公司提供的服務(wù)）：比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。 （1）：經(jīng)典雙向電泳方法 （2）：DIGE （3）：SILAC （4）：iTRAQ：蛋白質(zhì)翻譯后研究?jī)?nèi)容。 （1）：磷酸化

3、修飾分析 （2）：糖基化分析 （3）：二硫鍵分析 （4）：其他 1：常規(guī)雙向電泳一、雙向電泳概述： 雙向電泳(Two-dimensional electrophoresis)的基本原理是利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI)和分子量(Mr)不同而分離蛋白質(zhì)：第一向電泳等電聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同將蛋白質(zhì)分離，第二向電泳十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDSPAGE）利用蛋白質(zhì)的分子量大小不同將蛋白質(zhì)分離。 雙向電泳一次可以從細(xì)胞、組織

4、或其它生物樣本中分離上千種蛋白質(zhì)，凝膠上的斑點(diǎn)都對(duì)應(yīng)著樣品中的蛋白質(zhì)，且各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，分子量和含量的信息都能通過質(zhì)譜鑒定和軟件分析獲得。因此其在蛋白質(zhì)組分析、疾病標(biāo)志物檢測(cè)、細(xì)胞差異分析、藥物開發(fā)、癌癥研究等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。二：雙向電泳分離蛋白質(zhì)混合物具有以下優(yōu)勢(shì)： 1、經(jīng)典方法、應(yīng)用范圍廣、適用于各類材料； 2、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，可大規(guī)模多個(gè)樣本篩選和分析。 1：雙向電泳 基于2D的經(jīng)典定量分析方法。 1、樣品準(zhǔn)備和定量：抽提對(duì)照組和各種不同實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì)。 2、蛋白質(zhì)分離：蛋白質(zhì)經(jīng)過2D分離后染色（銀染、考染等）。 3、蛋白質(zhì)的定性與定量分析：通過與對(duì)照組相Image Master

5、7.0分析出實(shí)驗(yàn)組中差異點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定差異點(diǎn)蛋白質(zhì),同時(shí)應(yīng)用軟件分析出其表達(dá)量的變化。2：DIGE 簡(jiǎn)介： DIGE 雙向熒光差異凝膠電泳，利用熒光染料（Cy2, Cy3, Cy5）能與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基反應(yīng)而使蛋白質(zhì)被標(biāo)記，標(biāo)記后蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量基本不受影響，等量混合標(biāo)記好的蛋白質(zhì)后進(jìn)行雙向電泳，蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化則通過不同熒光的強(qiáng)度來(lái)體現(xiàn)。技術(shù)優(yōu)勢(shì)： 1：高效性，同一塊凝膠上可以電泳兩個(gè)樣品，減輕了工作量； 2：與常規(guī)銀染相比靈敏度更高； 3：檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍更大； 4：定量精確, 采用內(nèi)標(biāo)而消除了膠與膠之間的實(shí)驗(yàn)誤差； 5：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ImageMaster7.0（DIGE）軟件可以得到

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)可信的結(jié)果，降低了操作者之間的偏差。2：DIGE DIGE熒光定量方法流程圖. 1、樣品準(zhǔn)備：提取對(duì)照組和不同實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì),定量,cy3和cy5交叉標(biāo)記，同時(shí)將所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的樣品等量混合后cy2標(biāo)記，作為內(nèi)標(biāo)。 2、蛋白質(zhì)分離：等量混合三種熒光素標(biāo)記后的蛋白質(zhì)，2D電泳分離，熒光顯色。 3、蛋白質(zhì)定量分析：Image Master 7.0（DIGE)分析同一蛋白質(zhì)不同處理后的表達(dá)量變化。3: 化學(xué)標(biāo)記法iTRAQ簡(jiǎn)介： iTRAQ試劑是可與氨基酸末端氨基及賴氨酸側(cè)鏈氨基連接的胺標(biāo)記同重元素。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。 在串聯(lián)質(zhì)

7、譜中，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(113-119，121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以鑒定出蛋白質(zhì)和分析出同一蛋白質(zhì)不同處理的定量信息。iTRAQ 結(jié)構(gòu) iTRAQ包括三部分：報(bào)告部分、肽反應(yīng)部分、平衡部分。 1、報(bào)告部分：有八種，因此iTRAQ可同時(shí)標(biāo)記8組樣品。 2、肽反應(yīng)部分：能與肽N端及賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價(jià)連接而標(biāo)記上肽段，幾乎可以標(biāo)記所有蛋白質(zhì)。 3、平衡部分：保證iTRAQ標(biāo)記的同一肽段的質(zhì)荷比相同。 3: 化學(xué)標(biāo)記法iTRAQ與傳統(tǒng)基于雙向電泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：1：靈敏度高，檢測(cè)限低，可檢測(cè)出低豐度蛋白；2：分離能力強(qiáng),分析范圍廣,iTRAQ可以對(duì)任何

8、類型的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，包括高分子量蛋白質(zhì)、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。3: 高通量：同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行分析，提高了實(shí)驗(yàn)通量，可同時(shí)對(duì)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)或不同處理的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析； 4：結(jié)果可靠：定性與定量分析結(jié)果更加可靠；5：自動(dòng)化程度高：液相與質(zhì)譜連用，自動(dòng)化操作，分析速度快，分離效果好。 3: 化學(xué)標(biāo)記法iTRAQ iTRAQ法。 1：樣本經(jīng)過不同處理后，提取蛋白質(zhì); 2：蛋白質(zhì)經(jīng)過還原，封閉后胰蛋白酶酶切; 3：肽段混合物分別用不同的iTRAQ標(biāo)記; 4：等量混合各種iTRAQ試劑標(biāo)記的肽段; 5：MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)及分析。 4: SILACSILAC即細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技

9、術(shù)(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，其基本原理是在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用于SILAC主要的穩(wěn)定同位素氨基酸是Lys和Arg, 細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中同位素氨基酸將被細(xì)胞用于合成蛋白質(zhì)，細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)5-6代后，細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)將被同位素標(biāo)記，等量混合標(biāo)記的蛋白質(zhì)后經(jīng)過SDS分離和質(zhì)譜分析，通過比較一級(jí)質(zhì)譜圖中三個(gè)同位素型肽段的面積大小進(jìn)行相對(duì)定量，同時(shí)二級(jí)譜圖對(duì)肽段進(jìn)行序列測(cè)定從而鑒定蛋白質(zhì)。由于SILAC標(biāo)記技術(shù)是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，幾乎不影響細(xì)胞的功能，

10、同時(shí)靈敏度高，因此其在蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，如比較蛋白質(zhì)組學(xué)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)與DNA相互作用，蛋白質(zhì)與RNA相互作用等領(lǐng)域。 4: SILAC 技術(shù)優(yōu)勢(shì)目前比較蛋白質(zhì)組學(xué)最先進(jìn)方法 （1）高效性：SILAC是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)100%； （2）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實(shí)驗(yàn)內(nèi)差異； （3）高通量、靈敏度高：可同時(shí)鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質(zhì)，且檢可測(cè)測(cè)到納克級(jí)水平； （4）相容性：可以對(duì)多種在DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)的蛋白進(jìn)行標(biāo)記； （5）靈活性：在缺乏L-賴氨酸和L-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同

11、位素標(biāo)記的這兩種氨基酸，操作方便。 4: SILAC SILAC法。 1、標(biāo)記：在缺乏Lys和Arg的培養(yǎng)基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培養(yǎng)細(xì)胞，使蛋白質(zhì)被標(biāo)記成“中型”或“重型”； 2、細(xì)胞處理，如藥物處理； 3、細(xì)胞裂解、提取蛋白質(zhì)； 4、等量混合對(duì)照與處理組蛋白質(zhì)、SDS電泳、染色； 5、割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶消化，質(zhì)譜分析。：蛋白質(zhì)翻譯后研究?jī)?nèi)容（1）：磷酸化修飾分析（2）：糖基化分析（3）：二硫鍵分析（4）：其他 （1）：磷酸化修飾位點(diǎn)鑒定 2.3.2 ：其他修飾位點(diǎn)鑒定（2）：糖基化分析（3）：二硫鍵分

12、析（4）：其他 4：蛋白質(zhì)組學(xué)在植物，動(dòng)物，微生物等方面的的應(yīng)用植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究?jī)?nèi)容： （1）：作物蛋白質(zhì)組學(xué) A: 不同組織器官蛋白質(zhì)組學(xué) B: 作物遺傳多樣性 作物品種資源的親緣關(guān)系鑒定 作物品種鑒定 C: 作物發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué) D: 作物抗逆、抗病相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué) E: 病原菌致病相關(guān)蛋白 F: 蛋白質(zhì)標(biāo)記遺傳作圖與數(shù)量性狀QTL定位 （2）：豆科植物與根瘤菌互作蛋白質(zhì)組學(xué) （3）：禽獸蛋白質(zhì)組學(xué) （4）：其他 4：蛋白質(zhì)組學(xué)在植物，動(dòng)物，微生物等方面的的應(yīng)用動(dòng)物科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用 （1）：家禽、昆蟲等物種遺傳多樣性分析 （2）：家蠶、害蟲等物種免疫與抗逆生理研究 （3）：畜禽產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)形狀研究 （4）：畜禽疾病生理研究 （5）：水生生物疾病生理研究 （6）：其他 微生物研究中的應(yīng)用。 （1）：病原微生物治病相關(guān)蛋白的鑒定 （2）：食源性病原微生物相關(guān)蛋白的鑒定 （3