細胞培養(yǎng)液配制

1、關(guān)于細胞培養(yǎng)液的配制第一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 培養(yǎng)基的選擇 依據(jù): 經(jīng)驗、文獻、嘗試 常用: RPMI1640、DMEM 培養(yǎng)基的來源 市售干粉培養(yǎng)基-自己配制 液體培養(yǎng)基-直接使用(注意有效期) 第二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月培養(yǎng)基的除菌方法 過濾除菌: (1) 正壓過濾-效率高 (2) 負壓過濾-效率低 高壓蒸氣滅菌: 不含谷氨酰胺，滅菌后另外添加培養(yǎng)基附加成分的添加 按使用說明或?qū)嶒炓筇砑?配制時加: 碳酸氫鈉、抗生素、血清等 臨用前加: 生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等 第三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月RPMI164

2、0培養(yǎng)液配制過程 準備物品 (1) 不銹鋼過濾器, 濾膜(0.45m,0.22m),磁力攪拌器,天平,燒杯,量筒,鹽水瓶 (2) 培養(yǎng)粉,1N HCl,NaHCO3,青霉素,鏈霉素,胎牛血清,新鮮三蒸水 消毒物品 濾器中放置0.45m和0.22m濾膜, 包裝, 高壓蒸氣消毒第四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月配制步驟 (1) 10.4g/包培養(yǎng)粉溶至1L三蒸水中, 磁力攪拌20min(2) 加2g NaHCO3/L, 繼續(xù)攪拌10min(3) 加青霉素100U/mL(80萬U溶至4ml三蒸水, 取0.5ml) 鏈霉素100U/mL(100萬U溶至5ml三蒸水, 取0.5ml)(4)

3、加1N HCl約3mL, 調(diào)pH至7.2, 繼續(xù)攪拌第五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月(5) 按要求加血清（血清一般需經(jīng)56，30min滅活） 例如: 10%胎牛血清 無血清培養(yǎng)液 900ml 滅活胎牛血清 100ml(6) 正壓過濾除菌 (氣壓適當(dāng), 防止濾膜破裂)(7) 分裝,貯存于4，2周內(nèi)用完。(8) 無菌試驗: 取樣, 37放置2472h, 無細菌、霉菌污染方可使用第六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項 谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，分解，放置兩周以上時，根據(jù)需要添加谷氨酰胺。配制母液（200 mmol/L, 即29.22g/L）, 每100ml加入0.52

4、ml母液，終濃度14 mmol/L 抗生素在37穩(wěn)定性維持34d, 可控制輕度污染。防污染重在無菌操作 第七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 培養(yǎng)液配制過程 （以RPMI1640為例）第八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 物品準備(1）濾器、 微孔濾膜、磁力攪拌器、天平、燒杯、量筒、pH計、貯液瓶等。 第九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月(2) 培養(yǎng)粉、 NaHCO3、 1N HCl、青霉素、鏈霉素、血清、新鮮制備的三蒸水第十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. 濾器消毒準備第十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月取孔徑為0.45m和0.2

5、2m濾膜各一張，浸入三蒸水中 第十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月將浸濕后的濾膜光面向上依次置于濾器上第十三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月將裝有濾膜的濾器包裝后高壓蒸氣消毒第十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.液體配制第十五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 將培養(yǎng)粉倒入容器中第十六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月加入新鮮制備的三蒸水磁力攪拌器充分攪拌第十七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月按照實驗的具體要求分別加入 NaHCO3和青鏈霉素（青霉素100U/mL：80萬U溶至4ml三蒸水, 取0.5ml； 鏈霉素100U/mL：

6、100萬U溶至5ml三蒸水, 取0.5ml)第十八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月按要求加入一定比例的血清（血清一般需經(jīng)56，30min滅活） 例如: 配制含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液1升，應(yīng)加入 無血清培養(yǎng)液900ml 滅活胎牛血清100ml第十九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月加入1N HCl約3mL,調(diào)整pH至7.27.4第二十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月磁力攪拌器充分攪拌準備過濾第二十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 無菌條件下裝好濾器，檢查氣體以及液體管道是否通暢。 (一般使用氧氣。注意氣壓適當(dāng), 防止濾膜破裂，)第二十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月將液體倒入無菌濾器，接通氣體第二十三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 過濾后的液體分裝于貯液瓶第二十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月分裝過程嚴格無菌