端粒結(jié)合蛋白在煤焦瀝青煙提取物致人支氣管上皮細(xì)胞惡變中的作用-答辯幻燈

1、端粒結(jié)合蛋白在煤焦瀝青煙提取物致人支氣管上皮細(xì)胞惡變中的作用碩士研究生： 李小龍導(dǎo) 師 ： 教 授 王 威 副教授1主要內(nèi)容引言材料與方法結(jié)果結(jié)論致謝2引言 煤焦瀝青已被世界衛(wèi)生組織確定為明確的人類致癌物，但其致癌機(jī)制尚不十分清楚。研究已發(fā)現(xiàn)絕大部分腫瘤細(xì)胞的端粒縮短，端粒酶活性增強(qiáng)，保持端粒的穩(wěn)定是防止細(xì)胞癌變的一個重要步驟。3端粒是真核細(xì)胞染色體末端非編碼DNA重復(fù)序列和與之相連的端粒結(jié)合蛋白的功能性復(fù)合體，端粒過度消耗或者結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致其功能障礙可引起細(xì)胞發(fā)生癌變。4該課題組已發(fā)現(xiàn)中溫煤焦瀝青煙可致BEAS-2B細(xì)胞端粒DNA相對長度縮短、端粒酶活力增高、POT1與TRF1的mRNA及蛋白

2、表達(dá)下調(diào)、TRF2的mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)。5該研究通過RNA干擾技術(shù)分別抑制POT1和hTERT基因表達(dá)來觀察煤焦瀝青煙染毒BEAS-2B細(xì)胞的端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2、POT1和hTERT的mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)等，分析他們在細(xì)胞惡變中的作用。6材料與方法永生化人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B。中溫煤焦瀝青煙短發(fā)夾RNA（shRNA）表達(dá)載體7溶解250mg中溫煤焦瀝青煙提取物于二甲基亞砜(DMSO) 50ml中，使用時培養(yǎng)液稀釋至1.88mg/ml染毒。根據(jù)POT1和hTERT的mRNA序列分別設(shè)計和合成各6組shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體。8BASE-2B細(xì)胞以煤焦瀝青組，DMSO溶劑對照

3、組和空白對照組分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至1代、10代、20代和30代時分別對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后1 d、4 d、7 d時分別進(jìn)行指標(biāo)檢測。9采用Realtime PCR檢測端粒縮短情況； Realtime PCR檢測POT1，TRF1 ，TRF2和hTERT的mRNA表達(dá)情況；Western Blot方法檢測及驗證POT1的蛋白及端粒酶表達(dá)情況。10采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t 檢驗，LSD檢驗，方差分析，Pearson相關(guān)性分析等方法，檢驗水準(zhǔn) = 0.05(雙側(cè))。11結(jié)果熒光顯微鏡下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞12抑制POT1基因的表達(dá)可導(dǎo)致hTERT的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，端粒D

4、NA相對長度縮短，TRF1與TRF2的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，且各指標(biāo)之間存在相關(guān)性。13POT1干擾1代、10代、20代、30代各組細(xì)胞POT1mRNA表達(dá)量注：*表示經(jīng)LSD檢驗與各組1d，空白對照組及各P-NC組比較，P0.05；#表示與空白對照組及DMSO(P-NC)組比較， P0.05。14POT1實驗組細(xì)胞POT1蛋白相對表達(dá)量注：*表示經(jīng)LSD檢驗分別與各T-NC組及正常對照組比較，P0.05。15POT1基因抑制后CTP組細(xì)胞的克隆形成率16抑制hTERT基因的表達(dá)表達(dá)可導(dǎo)致POT1、TRF2的mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，端粒DNA相對長度縮短，TRF1的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，且各指

5、標(biāo)之間存在相關(guān)性。17hTERT干擾1代、10代、20代、30代各組細(xì)胞TERTmRNA表達(dá)量注：*表示經(jīng)LSD檢驗與各組1d，P-NC組及空白對照組比較，P0.05；#表示與空白對照組及DMSO(P-NC)組比較， P0.05。18hTERT實驗組細(xì)胞端粒酶相對表達(dá)量19TERT基因抑制后CTP組各組細(xì)胞的克隆形成率20結(jié)論抑制POT1基因表達(dá)可促進(jìn)CTP對BASE-2B細(xì)胞的惡變作用，提示抑制POT1表達(dá)后，降低了端粒的保護(hù)作用，激發(fā)了TRF1及TRF2基因的表達(dá)使端粒長度縮短，細(xì)胞核異常，端粒酶活力降低，細(xì)胞惡變加速。21抑制hTERT基因表達(dá)后可減弱CTP對BASE-2B細(xì)胞的惡變作用，提示抑制hTERT基因可啟動端粒延長替代機(jī)制，從而延緩或減弱細(xì)胞惡變。2223致謝衷心感謝我的導(dǎo)師吳逸明教授在學(xué)習(xí)方面對我的嚴(yán)格要求、工作中的諄諄教誨和生活中的親切關(guān)懷。衷心感謝王威老師在生活和學(xué)術(shù)中給予的支持和幫助，他的學(xué)術(shù)風(fēng)范，治學(xué)態(tài)度，厚德博學(xué)使