TNF-α單抗體內(nèi)體外試驗報告

1、細胞試驗TNF-a細胞毒性體外中和實驗1培養(yǎng)L929細胞2待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底 80%時，棄去培養(yǎng)基，用胰蛋白酶/EDTA在 37 C消化細胞2min。計算細胞數(shù)量，分裝至96孔培養(yǎng)板中，每孔約2X104 細胞，加入0.1ml1640培養(yǎng)基，37 C、5%CO2培養(yǎng)過夜。3在另一 96孔板中設(shè)置如下實驗組：A組：將0.05ng TNF-%與倍比 稀釋的純化單抗（0-100區(qū)g/ml混合。B組：將0.05ng TNF- %與倍比稀 釋的抗TNF-%單抗（0-100區(qū)g/ml混合。C組：含有倍比稀釋的純化單 抗（0-100 w g/ml） P 組：只含有 0.05 ng TNF-oo N組：只有 1

2、640 培養(yǎng) 基。各組加入200區(qū)l 1640W養(yǎng)基和終濃度1g/m的放線菌素D,37C、 5%CO2孵育2h。每組設(shè)置3個復(fù)孔。4棄去細胞培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基，將上述混合物加至孔內(nèi)，37C、5%CO2 培養(yǎng)24 ho5在孔內(nèi)加入10 MTT顯色液，石K續(xù)培養(yǎng)6h后，棄去培養(yǎng)液，加入 100 W l DMS慳止反應(yīng)并溶解藍色結(jié)晶，用PBS調(diào)零，測定A570值。6 細胞毒性按如下公式計算：細胞毒性 （%）=100-A570（A,B,P）/A570N 100%;細胞毒中和率按如下公式計 算：細胞毒中和率（）=100-（細胞毒性（A,B）/細胞毒性P）M00%。7半數(shù)抑制濃度（IC50）是能夠中和一半T

3、NF- %細胞毒作用時的scFv 濃度。參考文獻 山西醫(yī)科大學(xué)博士畢業(yè)論文利用噬菌體表面展示技術(shù)制備抗人腫瘤 壞死因子單鏈抗體及其人源化改造2004類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物造模方法佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis , AA)模型1材料1.1實驗動物選用Wistar大鼠50只，雄性，清潔級，周齡8-12周，體重140160g 2方法分組將50只雄性Wistar大鼠采用數(shù)字表法隨機分為 5組，分別編 號IV組，每組 10只。I組為正常對照組，II組為單純造模組 (AA+NS),m組為造模+甲氨喋吟組(AA+MTX), IV組為造模+益賽普 低劑量組(0.44mg/kg), V組為造模+益

4、賽普高劑量組(0.88 mg/kg)。 全部大鼠于層流架中飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。大鼠AA模型的建立在完全弗氏佐劑中加入卡介苗，用 20ml注射器、8號針頭反復(fù) 抽吸，充分乳化，將其配置為10 mg/ml濃度(原CFA中卡介苗濃度 為1 mg/ ml)的水包油乳劑。造模實驗第一天在第H、m、IV、V組大鼠的尾根部皮下注射 該乳劑0.2ml致炎。誘發(fā)佐劑性關(guān)節(jié)炎，而正常對照組大鼠的尾根部 皮下注射等量生理鹽水。給藥于致炎后第12天至第23天IV、V組皮下注射益賽普，IV組 予以益賽普0.44mg/ kg.d, V組予以益賽普0.88mg/kg.d。給藥容積 均為0.1ml/100g體重。連續(xù)12天

5、。田組大鼠給予甲氨喋吟 2.7mg/ kg.w灌胃，I組大鼠蒸儲水灌胃0.5ml/只.d;給藥時間均固定在每天 上午9: 00。一般狀態(tài)的觀察及關(guān)節(jié)腫脹度的評定觀察各組大鼠的體重、飲食及活動狀態(tài)的變化，體毛色澤改變，關(guān)節(jié)紅腫情況，與實驗的第 0d, 3d, 6d, 9d, 12d, 15d, 18d, 21d, 24d, 27d用排水法測右足體積，分別測量 3次，取平均值，并根據(jù) 關(guān)節(jié)紅腫程度進行AI的評定。血漿TNF-%檢測血漿TNF- 0c濃度的檢測采用雙抗體夾心 ELISA試劑盒?；そM織TNF- %表達滑膜組織標本切片免疫組織化學(xué)染色。AA大鼠滑膜組織病理學(xué)觀察統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以x

6、士 s表示，應(yīng)用SPSS13.旅計軟件做統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，相關(guān)性用直線相關(guān)分析。以P0.05作為具有統(tǒng)計學(xué)意義的判定標準。參考文獻河北醫(yī)科大學(xué)碩士畢業(yè)論文腫瘤壞死因子受體一抗體融合蛋白對大 鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎及血清與滑膜中 TNF- %、HIF-1 0c和VEGF表達的影2008克羅恩氏病動物造模方法 三硝基苯磺酸法炎性腸病（infammatory bowel disease , IBD）是一類嚴重影響人們生活質(zhì)量的慢性疾病， 根據(jù)其病理特征可分為克羅恩氏?。–rohn s disease CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis ,UC）1。三硝基苯磺酸（TNBS）

7、誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型，是研究 舊D最常用的鼠類模型之一。模型最早由Morris等14于1989年在大鼠上建立，而后又于1995年在小鼠15上成功誘導(dǎo)。模型以直腸給藥的方式，將TNBS與酒精的混合物灌入動物結(jié)腸中誘導(dǎo)炎癥。其中酒精用來破壞腸黏膜屏障，從而使TNBS能夠進入腸壁，并與腸道細菌和機體自身蛋白作用形成抗原，誘導(dǎo)免疫致敏反應(yīng)。模型建立后，實驗動物會出現(xiàn)精神萎靡、體重減輕、腹瀉、便血、腸壁增厚等癥狀。其免疫反應(yīng)以TH1型反應(yīng)為主，表現(xiàn)為細胞因子如腫瘤抑制因子a（TNF-a）干擾素丫（IFNy、）白介素12 （IL-12）等分泌水平上調(diào)16試齊I：TNBS致敏液：濃度為1 mol/L的TNBS

8、（Sigma公司）水溶液、水、無水乙醇按體積比 3.5: 11.5: 15混合， 制成含3.5%TNBS的50%酒精溶液；麻醉劑：戊巴比妥鈉（Sigma公司） 按照質(zhì)量體積比配成 1%溶液；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution , PBS）; 10%中性甲醛 固定液；便隱血檢測試紙（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；小鼠灌腸（胃）針頭及100屋微量注射器（上海玻利鴿工貿(mào)有限公司 ）。腸炎誘導(dǎo)操作：戊巴比妥鈉按照體重 0.01 ml/g ,腹腔注射麻醉小鼠。用連有灌腸針的微量注射器抽取 TNBS致敏液60r 小心的將針頭探入小鼠肛門內(nèi)，深至 34 cm,過程中避免碰傷腸壁，

9、 緩緩?fù)迫胨幰?。對照組給予相同體積的50%酒精溶液，灌腸完畢后緩慢拔出針頭。為確保致敏液與腸道充分作用，將小鼠頭朝下，固定在一個45o角傾斜的平面上，靜置30 min。間隔1 h后，再進行一次同樣的給藥操作。小鼠蘇醒后，將小鼠放回籠中。另外建模的方式還有惡吵酮腸炎模型，選用雄性20 - 25 g S JL/ J小鼠（6 - 8周齡）予乙醒一過性麻醉后 ，經(jīng)肛門插管深入距肛緣 4 cm處，緩慢注入惡口坐酮150（1 L （6 mg溶于50 % 乙醇中），為確保注入的惡唾酮在結(jié)腸內(nèi)彌散分布，可將小鼠尾巴提起持續(xù)倒置 30 so 3 d后處死可見結(jié)腸產(chǎn)生 UC的病理改變，組織學(xué)特征和分布與人類 UC

10、類似。結(jié)腸炎動物模型研究證實依那西普與英夫利昔抑制腸上皮細胞凋亡的能力相當(dāng)Fries W, et al. Int J Med Sci. 2008;5:169-80.目前認為上皮細胞屏障喪失完整性是克羅恩病(CD)發(fā)病制中的第一步，腸上皮細胞的凋亡率是腸粘膜屏障功能的決定因素之一。TNF-alpha作為克羅恩病的主要促炎介質(zhì)之一，是啟動腸上皮細胞凋亡程序的外部信號。本研究目的是要弄清楚實驗性結(jié)腸炎對腸上皮細胞凋亡的影響，以及兩種TNF拮抗劑(英夫利昔和依那西普)的治療作用。另外還要檢驗TNFR1(-/-)小鼠中TNFR1的重要性。結(jié)果顯示，給藥3小時以及 6小時后，英夫利昔和依那西普均可有效降低游離型TNF-alpha水平(與基線相比，兩種處理均達統(tǒng)計學(xué)顯著意義，p0.01)。用TUNEL染色以及免疫組化檢測 FasL、Bax的表達水平來評估回腸腸上皮細胞凋亡，結(jié)果提示動物模型腸上 皮細胞凋亡率在腸炎誘導(dǎo)劑處理后第3、第6小時上升。TNF拮抗劑治療組以及 TNFR1(-/-)動物卻沒有這些現(xiàn)象。抗