植物基因表達(dá)啟動子

1、關(guān)于植物基因表達(dá)的啟動子第一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 真核啟動子比原核更復(fù)雜、序列也更長，它不像原核啟動子那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以起動轉(zhuǎn)錄，而是需要多種蛋白質(zhì)因子的相互協(xié)調(diào)作用。不同真核啟動子之間大小、序列很不相同。不同物種的啟動子有時不能互用，如動物和植物之間。真核啟動子中包含了許多調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的元件，它們控制著基因表達(dá)的強(qiáng)弱或者時空差異。根據(jù)對基因表達(dá)的必須性，這些元件分為2類：核心啟動子元件和上游啟動子元件第二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 （1） TATA框(TATA box)：位于5端轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約20-30個核苷酸的地方。T

2、ATA框是一個短的核苷酸序列，其堿基順序?yàn)門ATAATAA。TATA框是RNA聚合酶的重要的接觸點(diǎn)，它能夠使酶準(zhǔn)確地識別轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)并開始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)TATA框中的堿基順序有所改變時，mRNA的轉(zhuǎn)錄就會從不正常的位置開始。 （2） CAAT框(CAAT box)：位于5端轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約70-80個核苷酸的地方。CAAT框是啟動子中另一個短的核苷酸序列， 其堿基順序?yàn)镚GCTCAATCT。CAAT框是RNA聚合酶的另一個結(jié)合點(diǎn)，一般認(rèn)為它控制著轉(zhuǎn)錄的起始頻率，而不影響轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)。當(dāng)這段順序被改變后，mRNA的形成量會明顯減少。 1. 核心啟動子元件(core promoter element):

3、 指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，包括TATA盒和 CAAT盒。核心元件單獨(dú)起作用時只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。第三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 11281 tttcccgcct tcagtttagc ttcatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac 11341 tcgccgtaaa gactggcgaa cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga 11401 aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca cacttgtcta ctccaaaaat

4、atcaaagata 11461 cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc 11521 tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag 11581 gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg 11641 ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 1

5、1701 ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 11761 acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 11821 tggagagaac acgggggact cttgac花椰菜花葉病毒35S啟動子=CaMV35S啟動子TATA框(TATA box)CAAT框(CAAT box)第四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.上游啟動子元件(upstream promoter element):包括通常位于70

6、bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)更遠(yuǎn)的上游元件。這些元件與相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合能提高或改變轉(zhuǎn)錄效率。不同基因具有不同的上游啟動子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達(dá)分別有不同的時間與空間表達(dá)調(diào)控。這些上游啟動子元件中，最普遍的是增強(qiáng)子元件。第五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3.增強(qiáng)子（enhancer） 是一種能夠提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件。最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長約200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物和原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子。增強(qiáng)子通常長100200bp，也和啟動子一樣由若干組件構(gòu)成，基本核心組件

7、常為812bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。增強(qiáng)子的作用有以下特點(diǎn)： 第六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月增強(qiáng)子可以遠(yuǎn)距離作用。通?？删嚯x1-4 kb、個別情況下離開所調(diào)控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。 增強(qiáng)子作用與其序列的正反方向無關(guān)。將增強(qiáng)子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒就不能起作用，可見增強(qiáng)子與啟動子是很不相同的。 第七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月增強(qiáng)子要有啟動子才能發(fā)揮作用。沒有啟動子存在，增強(qiáng)子單獨(dú)不能表現(xiàn)活性。增強(qiáng)子對啟動子沒有嚴(yán)格的專一性。同一增強(qiáng)子可以影響不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄。例如當(dāng)含有增強(qiáng)子的病毒基因組整合入宿主

8、細(xì)胞基因組時，能夠增強(qiáng)整合區(qū)附近宿主某些基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)增強(qiáng)子隨某些染色體段落移位時，也能提高移到的新位置周圍基因的轉(zhuǎn)錄。第八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月帶增強(qiáng)子的35S啟動子第十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 靜止子(silencer) 最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，以后在T淋巴細(xì)胞的T抗原受體基因的轉(zhuǎn)錄和重排中證實(shí)這種負(fù)調(diào)控順式元件的存在。目前對這種在基因轉(zhuǎn)錄降低或關(guān)閉中起作用的序列研究還不多，但從已有的例子看到：靜止子的作用可不受序列方向的影響，也能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用，并可對異源基因的表達(dá)起作用。第十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于

9、2022年6月1.組成型啟動子可以在所有細(xì)胞、組織和器官中持續(xù)發(fā)揮作用的啟動子。如看家基因的啟動子。組成型啟動子用來控制基因的持續(xù)表達(dá)，如抗病、抗蟲、抗不良環(huán)境的基因。在植物基因工程中，用于控制基因組成型表達(dá)的啟動子主要有2個來源：微生物和植物。二、 啟動子的類型第十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 1病毒來源的組成型啟動子CaMV35S 啟動子 CaMV 35S 啟動子是花椰菜花葉病毒（cauliflower mosaic virus，CaMV) 雙鏈DNA病毒基因組中啟動35S RNA基因轉(zhuǎn)錄的啟動子， CaMV 35S promoter，它可以利用宿主細(xì)胞核 RNA 聚合

10、酶進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄，并且不依賴于病毒的產(chǎn)物。 第十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月35S啟動子的結(jié)構(gòu)+9-90-343Domain A Domain B Domain A:與在根部起作用有關(guān)。Domain B：是煙草轉(zhuǎn)錄因子ASF-1的結(jié)合部位，與在植物葉片、莖等綠色組織中起作用有關(guān)。上游部分：與轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度有關(guān)（增強(qiáng)子功能）。含有重復(fù)的-343 -90部分的35S啟動子比350bp的35S啟動子的強(qiáng)度大10倍。35S啟動子的核心長度為60bp左右；其上游有其它元件，控制啟動子的轉(zhuǎn)錄效率和特異性，其中包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子第十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 CaMV 35S 啟動

11、子是一個組成型啟動子，不僅可以能在雙子葉植物中高效啟動基因表達(dá)，而且在許多單子葉植物中也可以高效啟動基因表達(dá)。另外 CaMV 35S 啟動子內(nèi)部沒有我們常用的酶切位點(diǎn)，因而容易克隆和使用，在植物基因工程中得到了廣泛的應(yīng)用。 35S 啟動子控制的GUS基因在煙草中表達(dá)莖葉片橫切面根花幼苗第十五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月由于CaMV 35S 啟動子在植物中成功的應(yīng)用，人們也克隆了其它病毒的啟動子，如cassava（木薯） vein mosaic virus (CsVMV) promoter ， Australian banana streak virus (BSV) promote

12、rs，mirabilis mosaic virus (MMV) promoter and figwort（玄參）mosaic virus (FMV) promoter，這些啟動子也能夠在植物中高效高效啟動基因的轉(zhuǎn)錄。第十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 利用病毒來源的啟動子進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因有令人擔(dān)心的問題，如： 轉(zhuǎn)基因食物與感染人類的病毒存在時，啟動子可能與病毒基因重組、導(dǎo)致病毒基因的大量表達(dá)。 植物細(xì)胞可能不識別病毒來源的啟動子序列，把它當(dāng)作外源DNA，對它進(jìn)行修飾、使它失去作用，導(dǎo)致基因沉默。第十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月原核生物組成型啟動子之二：農(nóng)桿菌胭脂堿合

13、成酶基因啟動子 Nos promoterNos promoter35S promoterNos promoter煙草衛(wèi)矛第十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1.2 植物來源的組成型啟動子 在植物中有很多看家基因，在各種類型細(xì)胞和所有時間內(nèi)都表達(dá)。啟動這些基因表達(dá)的啟動子就是組成型啟動子?，F(xiàn)在許多這類啟動子已經(jīng)被克隆，并在植物基因工程得到了應(yīng)用。 肌動蛋白（actin）是細(xì)胞基本骨架的成分，actin基因家族的基因都是組成型基因，其啟動子就是組成型啟動子。通過檢測報告基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)1.5kb的擬南芥actin2基因啟動子幾乎在擬南芥所有器官和整個發(fā)育過程中都起作用，僅在種皮、胚軸、

14、子房和花粉囊中不起明顯作用。 水稻的actin1基因啟動子僅不在木質(zhì)部中起作用。第十九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月擬南芥ACTIN2基因啟動子分析第二十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Ubiquitin（泛素蛋白）也是細(xì)胞中重要的基本成分，參與了許多重要生命過程，如蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA修復(fù)等。來自玉米的Ubiquitin1基因的啟動子（pUbi）是用得比較多的植物啟動子之一，特別是在單子葉植物中，在玉米中pUbi的作用是35S啟動子的10倍。 來自煙草的Ubi.U4基因的啟動子(-263bp)在煙草中的作用比3

15、5S啟動子好。第二十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.特異啟動子 在基因工程中利用組成型啟動子高表達(dá)基因常常帶來許多麻煩，如影響植物的正常生長發(fā)育，轉(zhuǎn)基因植物安全性等問題，所以我們希望在時空上能夠控制基因的表達(dá)，因此就要用細(xì)胞、組織、器官特異啟動子。轉(zhuǎn)35S-Kn1-Nos基因的煙草轉(zhuǎn)35S-Kn1-Nos基因的地黃第二十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1組織特異啟動子（tissue-specific promoter） 就是只在特定的組織或者器官（根、葉片、子房、花粉、花原基、種皮等）中起作用的啟動子。植物維管組織特異啟動子第二十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2

16、022年6月2.2果實(shí)特異性啟動子 果實(shí)是食用器官，利用果實(shí)特異性啟動子可以改良果實(shí)品質(zhì)、生產(chǎn)疫苗。 蘋果和番茄果實(shí)中1-aminocyclopropane-1-carboxylate (1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸，ACC) oxidase gene（ E8 gene）和polygalacturonase (多聚半乳糖醛酸酶，PG) genes 啟動子在果實(shí)成熟是起作用。番茄PG啟動子用來提高番茄果實(shí)中胡蘿卜素的含量；番茄E8啟動子表達(dá)virus-F protein，生產(chǎn)疫苗，提高了老鼠系統(tǒng)免疫能力。第二十五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.3種子/籽粒特異啟動子種子/籽粒是很多植物

17、的收獲器官，具有重要經(jīng)濟(jì)價值，其質(zhì)量和品質(zhì)一直受到人們的關(guān)注，如食品中蛋白質(zhì)、油脂、維生素的含量提高、棉花纖維長度的提高、有用物質(zhì)（蛋白、酶、疫苗的生產(chǎn)等）都可以通過種子/籽粒特異啟動子啟動有關(guān)基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。這類啟動子有：soybean -conglycinin基因啟動子在胚成熟的中、后期起作用；sunflower helianthinin基因啟動子在發(fā)育的種子中起作用；French bean phaseolin基因啟動子只在發(fā)育的種子的胚乳和胚起作用；cotton a-globulin 基因啟動子可以在棉花、煙草、擬南芥發(fā)育的種子中起作用。種皮特異啟動子：A pea -1,3-gluca

18、nase 基因（PsGNS2）只在種皮中起作用。第二十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.4塊根/塊莖儲藏器官特異啟動子 B33 and PAT 21是土豆的糖蛋白的主要成員，分析表明B33 and PAT 21基因的表達(dá)最主要是在塊莖形成的過程中，表明B33 and PAT 21基因的啟動子是塊莖特異性的。 Sporamin（紅薯特殊貯藏蛋白 ） and -淀粉酶是紅薯塊根中2個主要的可溶性蛋白，研究表明Sporamin 幾乎都在塊根中表達(dá)（1%4.5% 在莖中)。第二十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.5 花/花序特異啟動子 花是重要的觀賞器官，花色、花形、花的壽

19、命和香氣等是花卉重要性狀。 1.45 kb的菊花內(nèi)源ubiquitin extension protein 基因啟動子(UEP1) 在花中的作用是在葉片中作用的9倍，比 CaMV 35S啟動子在菊花中的作用高 4085倍?？刂茢M南芥花瓣中蠟質(zhì)合成的基因（CER6）啟動子也可以在菊花花瓣中特異起作用。 擬南芥leafy, ap1, ap3，PI 等花器官發(fā)育基因的啟動子第二十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Pleafy-barnase-Tnos無花植物表達(dá)載體第二十九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.6 花粉/花藥特異啟動子 煙草花粉特異啟動子 TA29,番茄花粉特異啟動

20、子 lat52，水稻花粉特異 RA8 gene啟動子、玉米ZmC5基因啟動子、ZM13啟動子都是花粉特異啟動子. 花粉特異啟動子被廣泛用來創(chuàng)造核雄性不育植物?；ǚ厶禺悊幼觔arnase(RNase) 載體已經(jīng)用來轉(zhuǎn)煙草、油菜、水稻、玉米等；花粉特異啟動子還可以進(jìn)行基因刪除，防止外源基因通過花粉污染其它非轉(zhuǎn)基因（作物）植物，提高轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性。第三十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.7根特異啟動子Agrobacterium rhizogenes rolD 基因啟動子（373-426bp）、90bp的35S啟動子具有根特異性；煙草的TobRB7啟動子、Arabidopsis

21、thaliana pyk10啟動子、松樹PmPR10-1.14啟動子。第三十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月(A) 2-day-old seedling; (B) 3-day-old seedling showing GUS-staining throughout the whole plant, with exception of the elongation zone of the root; (C) 5-day-old seedling with a reduction of gus-activity in cotyledons; (D) 7-day-old seedling

22、 showing that the hypocotyl is no more stained; (E) 10-day-old seedling with no GUS-staining in the upper parts of the plant; (F) 14-day-old seedling; (G) stained roots showing gus-activity along the whole main root; (H) transition zone between hypocotyle and root. (IT) Gus-activity under control of

23、 the promoter construct C, (I) 2-day-old seedling; (K) 3-day-oldseedling; (L) 5-day-old seedling; (M) 7-day-old seedling without GUS-staining in the hypocotyl; 第三十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月(N) 10-day-old seedling showing GUS-staining in cotyledons, in the midrib region and marginal parts of the leaves a

24、nd in hydathodes; (O) 14-day-old seedling with a strong reduction of gus-activity in the upper part of the plant; (P) stained roots showing a strong gus-activity along the whole main root; (Q) close-up of stained roots showing gus-activity preponderantly in the central region of the root or in the w

25、hole root; (R) close-up of a stained root showing gus-activity in the outer parts of the root; (S) close-up of stained root tips and root hairs; (T) lateral roots with GUS-staining only in the root tip; (UW) stained cross sections of main roots; (X) stained cross section near the root tip; (Y) close

26、-up of a pod abscission site.第三十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月根特異啟動子在提高植物利用肥料、適應(yīng)土壤環(huán)境、提高對土壤病害抗性等基因過程方面具有重要作用第三十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.8 葉片/綠色組織特異啟動子屬于光誘導(dǎo)型啟動子 研究最清楚的是編碼 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶）小亞基的 rbcS multigene family的啟動子 。 另外，chlorophyll a/b-binding (Cab) protein genes的啟動子.。第三十

27、五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞器特異啟動子 葉綠體基因工程：在葉綠體表達(dá)外源基因。優(yōu)點(diǎn)：1）葉綠體基因組小，沒有位置效應(yīng)，轉(zhuǎn)基因不會沉沒；2）表達(dá)量高，可以達(dá)到10000葉綠體/細(xì)胞；3）花粉中沒有葉綠體，所以沒有基因逃逸，安全。 Chloroplast transformation vectors most often include a light-responsive promoter psbA, a photosystem II promoter， and rbcL, the promoter for the ribulose-1,5-bisphophate carb

28、oxylase large subunit gene, and the 16S rRNA (Prrn), a strong and constitutive plastid operon promoter. 第三十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月葉綠體基因工程在植物抗蟲、抗除草劑、生產(chǎn)藥物蛋白方面具有極大的優(yōu)勢。研究表明，葉綠體基因工程培育的抗除草劑植物的抗性有時比核轉(zhuǎn)基因的高10000倍第三十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3.誘導(dǎo)型啟動子（Inducible Promoters）特異啟動子是依靠植物自身的能力實(shí)現(xiàn)基因的不同時空表達(dá)，利用誘導(dǎo)型啟動子則可以人們主動控制

29、基因表達(dá)。3.1 Stress/wound-inducible promoters：病原菌、害蟲、低溫、高溫、水澇、干旱、高鹽、創(chuàng)傷等都可以引起植物的一些特殊反應(yīng)（基因表達(dá)的結(jié)果），由此而得到一些受這些因素誘導(dǎo)的啟動子。 馬鈴薯創(chuàng)傷啟動子 wun1（創(chuàng)傷啟動子） and proteinase inhibitor II ( pin2，蛋白酶抑制劑) gene promoters both direct high wound- and pathogen-inducible expression, but have little to no constitutive expression witho

30、ut stimulus。The 1.2 kb wun1 promoter fused to reporter genes showed very high levels of expression at the site of wounding and pathogen attack。Reporter gene induction was maximal at 10 h. The Arabidopsis rd29A and rd29B基因啟動子受到干旱、高鹽的誘導(dǎo)。第三十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2 外源誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：1）可以隨意控制（誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)的劑量）；2）重

31、復(fù)控制；3）植物內(nèi)部背景低。Most inducible/repressible promoter systems are two-component systems with molecular on-off switches that vary in complexity. They include a transcription factor gene whose product, when selectively expressed, binds to a target promoter that contains the transcription factors cis-actin

32、g element. The target promoter is fused to the transgene of interest and the binding of the transcription factor modulates its expression 第三十九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月35S啟動子轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)錄因子+ 誘導(dǎo)劑（Cu2+, 酒精,等 )基因表達(dá)外源誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)作用示意圖結(jié)合轉(zhuǎn)錄功能基因誘導(dǎo)型啟動子第四十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng): It is composed of the promoter of the a

33、lcohol dehydrogenase gene, alcA, and an alcohol activated transcription factor gene (alcR) driven by the CaMV 35S promoter. The transcription factor (ALCR) binds in the presence of ethanol to specific sites in a chimeric alcA:CaMV 35S minimal promoter (TATA box region), activating transcription of a target gene. The alc system is extremely sensitive to ethanol and is induced rapidly and in a dose-dependent manner. The target gene is induced by soil root drenching (0.5% v/