免疫熒光檢測

1、免疫熒光技術(shù)（檢測抗核抗體（ANA ）的實驗方案）熒光免疫技術(shù)是以熒光物質(zhì)標記的特異性抗體或抗原作為 標準試劑，用于相應(yīng)抗 原或抗體的分析鑒定和定量測定。熒光免疫技術(shù)包括熒光抗體染色技術(shù)和熒光免疫測定兩 大類。熒光抗體染色技術(shù) 是用熒光抗體對細胞、組織切片或其他標本中的 抗原或抗體進行 鑒定和定位檢測，可在熒光顯微鏡下直接觀察結(jié)果，稱為熒光免疫顯微技術(shù)，或是應(yīng)用流 式細胞儀進行自動分析檢測， 稱為流式熒光免疫技術(shù)。熒光免疫測定主要有時間分辨熒光 免疫測定和熒光偏振免疫測定等。本次實驗以熒光免疫顯微技術(shù)檢測抗核抗體（ANA）為例進行實習?？购丝贵w（antinuclear antibody , A

2、NA僅稱抗核酸抗原抗體，是一組將自身真核細胞的 各種成分脫氧核糖核蛋白（DNP）、DNA可提取白核抗原（ENA）和RNA?作為靶抗原的自身抗體 的總稱，能與所有動物的細胞核發(fā)生反應(yīng)，主要存在于血清中，也可存在于胸水、關(guān)節(jié)滑膜液和尿液中?？购丝贵w實驗原理以小鼠肝細胞或某些培養(yǎng)細胞（如Hep-2）作抗原片，將病人血清加到抗原片上。如 果血清中含有ANA就會與細胞核成分特異性結(jié)合。加入熒光素標記的抗人IgG抗體又可與ANA吉合，在熒光顯微鏡下可見細胞核部位呈現(xiàn)熒光。試劑與器材.抗原片 現(xiàn)多用商品試劑。如需自行制備，方法如下：（1）肝印片制備：取4-8周齡小鼠，斷頸殺死后，剖腹取肝。將肝臟剪成平面塊，

3、用 生理鹽水洗去血細胞，用濾紙吸干滲出的漿液。將切面輕壓于載玻片上，使其在載玻片上 留下薄層肝細胞。冷風吹干，乙醇固定，冰箱可保存 1周。（2）Hep-2細胞抗原片制備：Hep-2細胞是建株的人喉癌上皮細胞。經(jīng)適宜培養(yǎng)在載玻 片上形成單層細胞抗原片，用洗滌洗去培養(yǎng)基。干燥后，用無水乙醇固定。（3）肝切片制備：取小鼠肝組織作冰凍切片，厚 46。-30c保存?zhèn)溆谩?異硫氧酸熒光素（FITC）標記的抗人IgG抗體（FITC-抗人IgG抗體）有商品供應(yīng)， 臨用時按效價稀釋。. L PBS.緩沖甘油 取甘油9份加PBS 1份。.待測血清、陽性和陰性對照血清臨床標本篩選獲得。.器材 熒光顯微鏡、孵箱、有蓋

4、濕盒、染色缸、吸管、試管等操作方法.準備：檢查加樣板，生物載片恢復室溫，標記。.稀釋：PBS-Tweer|g沖液稀釋血清，設(shè)陰陽性對照。.加樣：加樣板放于泡沫塑料板上，加 25/1稀釋后血清，至加樣板的每一反應(yīng) 區(qū)，避免氣泡。加完所有標本后開始溫育。.溫育：將生物薄片蓋于加樣板的凹槽里，反應(yīng)開始，室溫溫育30分鐘。.沖洗：用燒杯盛PBS-Tweerlg沖液流水沖洗生物薄片，然后立即將其浸入盛有 PBS-Tweer|g沖液的小杯中至少1分鐘。不必混搖。.加樣：滴加20口 熒光素標記的抗人球蛋白（結(jié)合物）至一潔凈加樣板的反應(yīng) 區(qū)，完全加完方可繼續(xù)溫育。熒光素標記的抗人球蛋白用前需混勻并以PBS-T

5、weerlg沖液稀釋。.沖洗：用燒杯盛PBS-Tweer沖液流水沖洗生物薄片，然后立即將其浸入盛有 PBS-Tweer|g沖液的小杯中至少1分鐘。不必混搖。.封片：將蓋片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至蓋片：每反應(yīng)區(qū)約104。從PBS-Tweer|g沖液中取出1張生物薄片，用紙擦干背面和四邊。還要擦拭反應(yīng) 區(qū)間隙。將生物薄片面朝下放在已準備好的蓋玻片上，立即查看并調(diào)整使蓋片嵌入載片的凹槽中。然后繼續(xù)下1張。結(jié)果判定熒光顯微鏡下觀察.細胞核發(fā)黃綠色熒光為陽性染色細胞，不發(fā)熒光為陰性。抗原片中出現(xiàn)陽性染 色細胞為ANN印性，否則為陰性。陽性待檢血清可作進一步稀釋后測定效價。.根據(jù)細胞核

6、著染色熒光的圖像，可區(qū)分為：均質(zhì)型：細胞核呈均勻一致的熒光；周邊型（核膜型）：細胞核周圍呈現(xiàn)熒光；斑點型（顆粒型）：細胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點 狀火光；核仁型：核仁部分呈現(xiàn)熒光?；旌闲停簝煞N以上核染色；應(yīng)用細胞片做抗原片可檢出著點型（ACA）注意事項. PBS-Tweerlg沖7ft在4c下可存放兩周。.根據(jù)每次實驗的標本量決定需要稀釋的FITC標記的抗人球蛋白的量，稀釋后可在4c下可存放1周。.血清或FITC標記的抗人Ig應(yīng)滴加至加樣板上，不能直接滴到載片上。.載片蓋到加樣板上后，確保反應(yīng)區(qū)與液滴完全接觸后，才開始記時溫育。.沖洗載片時水流要緩慢，以免沖洗掉基質(zhì)。載片上的反應(yīng)區(qū)應(yīng)保持濕潤，不要 將載片

7、風干。.封片進不可用力擠壓蓋玻片，以免損壞基質(zhì)?？勺笥遗矂由w玻片以使其正確嵌 入載片凹槽里。.封片介質(zhì)含有熒光穩(wěn)定劑，應(yīng)保存在2-8C。封好的載片可于4c長期保存。實驗討論方法評價間接免疫熒光技術(shù)是檢測 ANA最常用的方法。該方法簡便、敏感，且可根據(jù)核染色形態(tài)確定核抗原的類型。鼠肝印片細胞分布不均勻，多有重疊，沖洗時易丟失。Hep-2細胞具有核大、有絲分裂旺盛、核內(nèi)細胞器較明顯、具備人源性抗原的特征，對診斷和鑒別不同類型的自身免疫 病十分有利。檢測抗核抗體（ANQ的實驗方案AN嫡介抗核抗體（antinuclearantibodies , ANAS經(jīng)典定義：針對細胞核成分的一大組抗體譜。抗核抗體

8、新概念（FANA?狹義定義傳統(tǒng)定義：顧名思義是指抗細胞核抗原成分的自身抗體的總稱現(xiàn)代定義：是指抗細胞內(nèi)所有抗原成分的自身抗體的總稱。對ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸（nucleic acid）和核蛋白（nucleoprotein） 抗體的總稱？廣義定義靶抗原分布：細胞核細胞核、細胞漿、細胞骨架、細胞分 裂周期抗核抗體檢測方法檢測細胞內(nèi)抗原自身抗體 “金標準” IIFANA僉測方法進展：僅限于IIF改良法（底物選擇、制備方法）試圖將 ELISA發(fā)推廣 為最基本的篩選方法未獲成功復制細胞抗原全部成分極其困難？抗原存在的相對濃度、自然抗原決定簇的二級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)熒光染色模型可初步判斷

9、相應(yīng)抗體性質(zhì)范圍或確定抗體特異性IIF法：HEp-2細胞底物（90蛆上實驗室采用）完整的ANAs抗原譜（細胞核、漿、骨架、周期）可預測分析ANA抗原范圍經(jīng)驗性強ELISA法：采用高度純化抗原或全細胞抗原抗原譜有限（十余種）假陰性結(jié)果#操作簡單快速其他方法：金標法、比濁法ANAE抗原多核甘酸：雙鏈DNA單鏈DNA RNA組蛋白：H1, H2A H2B H3, H4, H2A-H2壺合物核漿的核糖核蛋白:U1-nRNP、Sm SS-A(Ro)、SS-B(La)、Ku、Mi-1、Mi-2、核點、 增殖性細胞核抗原核仁抗原：Scl-70、U3-nRNP原纖維蛋白、RN幽聚酶 I、PM-Scl(PM-1

10、)、7-2-RNP(To)、 4-6-S-RNA、核仁形成中心(NOR核膜抗原：板層素(層粘連蛋白)著絲點：著絲點蛋白ANA險出率與年齡和性別有關(guān)與個體的免疫穩(wěn)定性相關(guān)使用足夠敏感的方法，每個人都可檢測出一些 ANA天然ANA生理性自身免疫維持機體內(nèi)環(huán)境的生理穩(wěn)定。滴度較低，親和力弱，大多為IgM型。ANA僉測方法初篩抗核抗體：IIF最佳基質(zhì)：聯(lián)合生物薄片（HEp-2細胞/猴肝冰凍組織）區(qū)分抗核抗體的靶抗原：ELISA、印跡法和免疫印跡法ANAW 篩IFT: HEp-2細胞/靈長類肝臟完整的抗原譜（細胞核及細胞漿）可預測靶抗原協(xié)助檢測其它項目（如 ANCA ENAELISA:采用高度純化的抗原

11、初篩 ANA抗原譜有限操作簡單快速采用滴定平板技術(shù)進行間接免疫熒光實驗為了使實驗操作標準化，歐蒙開發(fā)了滴定平板技術(shù) ：滴加標本或標記抗體至加樣板的 反應(yīng)區(qū)，然后將生物薄片載片蓋在加樣板表面的凹槽里，這時，載片上的所有生物薄片均 與液滴接觸，反應(yīng)同時開始。系統(tǒng)的幾何結(jié)構(gòu)決定了液滴的位置和高度。因為液體被局限 在一封閉的空間里，所以不再需要傳統(tǒng)的“濕盒”。并且可在一致的反應(yīng)條件下同時溫育 任何數(shù)量的標本。準備：檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時可 使用家用洗滌劑或Extran MA 01 （默克公司），再用水徹底沖洗。需要消毒時，可于3%的Sekusept Extr

12、a （漢高公司）中浸泡1小時。只有當載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號筆對玻片進行標記。稀釋：按照試劑盒使用說明稀釋血清標本。每次實驗均需加入陽性和陰性對照。對照血清使用前必須混勻。加樣：在加樣板的每個反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標本后 才開始溫育（一次最多200份）。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積：10 口/ 反應(yīng)區(qū)3 x 3 mm）25仙l/反應(yīng)區(qū)5 x 5 mm）70仙l/反應(yīng)區(qū)7 x 9 mm）溫育：將載片蓋在加樣板對應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。確保每個標本均能夠與生物薄片相接觸，而標本之間不相互接觸。室溫溫育30分鐘。清洗：用燒杯盛PBS-T

13、weeng沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tweerlg沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。沖洗1秒鐘小杯內(nèi)浸洗5分鐘加樣：將熒光標記的抗人免疫球蛋白（酶結(jié)合物）加入潔凈加樣板的每個反應(yīng)區(qū)。完 全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育（最多可加50個載片）。使用連續(xù)加樣器。加樣前應(yīng)使用加樣器混勻。為節(jié)約時間，可在第一步溫育的同時滴加酶結(jié)合物至另一個加樣板的 反應(yīng)區(qū)中。加樣體積：10 W 反應(yīng)區(qū)（3 x 3 mm）20仙1/反應(yīng)區(qū)5 x 5 mm）60仙1/反應(yīng)區(qū)7 x 9 mm）溫育：從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊 緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝

14、下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基 質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn) 在開始，注意避免陽光直射載片。室溫溫育30分鐘。清洗： 用燒杯盛PBS-Tweer|g沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有 PBS-Tween 緩沖液的小杯中浸洗至少 5分鐘?？稍诿?50ml磷酸鹽緩沖液中加10滴(150 口)伊文氏 藍進行復染。沖洗1秒鐘小杯內(nèi)浸洗5分鐘封片：在蓋玻片上滴加甘油/PBS。使用聚苯乙烯封片板。從 PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)間隙。將載片的生物薄片朝 下置于準備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻

15、片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位 置，正確放置。然后再進行下一個載片的操作。封片體積：10仙1/反應(yīng)區(qū)3 x 3 mm)10仙1/反應(yīng)區(qū)5 x 5 mm)20仙1/反應(yīng)區(qū)7 x 9 mm)結(jié)果判斷：熒光顯微鏡下觀察熒光。具體操作熒光工作臺的布置清洗載片的擦拭封片ANA勺結(jié)果-可篩查上百種不同的抗間接免疫熒光法的獨特優(yōu)勢（一種基質(zhì)體 ）用HEp-2細胞檢測自身抗體AN聯(lián)光模型核均質(zhì)型核仁型核顆粒型胞漿型AN嫡認實驗（1）IFT:HEp-2細胞/靈長類肝臟：特殊的熒光模型如著絲點、 核膜型、核糖體P蛋白、肌動蛋白ELISA:ANA分項（含ENA譜）：包被高度純化抗原斑點法/印跡法ENA譜

16、：采用各種高度純化的抗原ELISA:抗 ENA 譜印跡法：抗ENA譜印跡法：抗ENA普免疫印跡法ANA1認實驗（2）Westernblot:HEp-2 細胞提取物定性適宜特別需要 （如區(qū)分靶抗原Ro 52或Ro 60）檢測目前無法純化的靶抗原的抗體（如PM-Scl、Ku）結(jié) 論初篩實驗：免疫熒光技術(shù)（HEp-2細胞/靈長類肝臟）ELISA（純化的多種核抗原）確認實驗：ELISA印跡法斑點法WesternblotANAif與相關(guān)疾病相關(guān)疾病的ANA譜ANA的各種熒光模型、靶抗原及相關(guān)性高滴度的ANA僅出現(xiàn)在自身免疫性疾病中ANATO性率20-自身免疫性疾病(%)系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動期95100非活

17、動期80 -100藥物誘導的紅斑狼瘡100混合性結(jié)締組織病100類風濕性關(guān)節(jié)炎40進行性系統(tǒng)性硬化癥20 50多發(fā)性肌炎及皮肌炎干燥綜合30-慢性活動性肝潰瘍性結(jié)腸其它風濕8570-70-95征50炎80炎8026SLE抗核抗體的檢出率靶抗原檢出率(為dsDNA30-90Sm5-30核糖體P蛋白5-15周期蛋白I (PCNA3ssDNA70-95組蛋白40-80U1-nRNP15-40SS-A20-60SS-B10-20Ku5-10心磷脂、b2-GP120-40抗細胞抗體熒光模型 (immunofluorescent pattern)常見的熒光染色模型有6種：核均質(zhì)型(homogeneous

18、pattern , H)核顆粒型(Granulogus pattern , S)核仁型(nucleous pattern , N)核膜型(membranous pattern , MM著絲點型(centromert pattern , ACA胞漿型(cytoplasmic pattern , ACYAHEp-2細胞/靈長類肝臟：核均質(zhì)型ssDNA / dsDNA靶抗原：單鏈、非天然DNA(喋吟和嚅咤磴基對)雙鏈、天然DNA (脫氧核糖核酸結(jié)構(gòu))相關(guān)性：ssDNA類風濕SLE干燥綜合征皮肌炎類風濕性關(guān)節(jié)炎獻血員SLE抗dsDNA綠蠅短膜蟲%30% - 90%組蛋白靶抗原：組蛋白 H1、H2A H

19、2B H3 H4（主要抗原H1和H26功能：形成核小體相關(guān)性：藥物誘導性LE:100% （唯一的標志抗體）SLE:40% - 80%其它風濕性疾?。?少見HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗 RNP/SmU1-nRNP靶抗原：與U1-nRNA連接的3個蛋白分子（70K、A和C蛋白）功能：切割pre-mRNA相關(guān)性：MCTD: 95% - 100%SLE: 15% - 40%抗SmB體靶抗原：與U1-、U2-、U4-、U5-或U6-nRNA連接的6種不同蛋白分子（core proteins B, B , D, E, F, G ）功能：切割pre-mRNA相關(guān)性：SLE: 5% - 30%HEp-2細胞

20、/靈長類肝臟：抗核糖體P蛋白抗核糖體P蛋白抗體抗原：核糖體的亞單位（60S）, 3個蛋白分子組成：P0 P1、P2 （38、19、17 kDa）在碳末端具有相似的免疫反應(yīng)表位。功能：蛋白合成易位過程中的輔蛋白相關(guān)性：SLE 5% - 15%原發(fā)性干燥綜合征的抗體譜靶抗原陽性率 （%SS-A40-95SS-B40-95ssDNA40-95HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗SS-A/SS-B抗SS-A抗體靶抗原：與 Y1, Y3, Y4 或Y5型RNA連接的2個蛋白（52 kDa和60 kDa）功能：調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)譯活性相關(guān)性：干燥綜合征：40% - 95%SLE:20% - 60%抗SS-B抗體靶

21、抗原：與 小分子RNA （U6-RNA, pre-tRNA ） 結(jié)合的磷脂蛋白（48 kDa）功能：RNA多聚酶III的輔蛋白相關(guān)性：干燥綜合征：40% - 95%SLE: 10% - 20%進行性系統(tǒng)性硬化征的抗體譜靶抗原陽性率 （%著絲點80-95Scl-7025-75ssDNA30-60 TOC o 1-5 h z 原纖維蛋白5-10RNA聚合酶4PM-Scl （重疊綜合征）3NOR-90 （核仁形成區(qū)）少見Ku （多肌炎型重疊綜合征）1-7HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗著絲點抗體抗著絲點抗體靶抗原：連接動粒（著絲點）上的4個蛋白分子：A-、B-、C-、D-蛋白，分子量（17、80、14

22、0、50kDa）主要的靶抗原：著絲點 B蛋白（與IIFT相關(guān)性: 100%功能：與紡錘體纖維連接相關(guān)性：硬皮?。?8%局限性硬化征（CREST綜合征）:80%-95%HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗Scl-70抗Scl-70抗體靶抗原：DN附撲異構(gòu)酶I （100 kDa）功能：DNA制和翻譯過程的輔蛋白相關(guān)性：硬皮?。?5% - 75%HEp-2/靈長類肝臟：抗 PM-Scl抗PM-Scl抗體靶抗原：多個蛋白分子的復合物主要的靶抗原100 kDa（與DNA拓撲異構(gòu)酶I不同）功能：未知相關(guān)性：硬皮病：2% - 5%肌炎：8%重疊綜合征：24%HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗RN陷聚酶RN陷聚酶I、II和III靶抗原：多個蛋白亞單位組成的核仁酶復合物功能：多聚酶I:轉(zhuǎn)錄rRNA基因多聚酶II:轉(zhuǎn)錄mRNA基因多聚酶III:轉(zhuǎn)錄tRNA基因相關(guān)性：硬皮?。?%HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗原纖維蛋白抗原纖維蛋白（U3-nRNP抗體靶抗原：與基礎(chǔ)蛋白（34 kDa） 連接的U3-nRN用口其它5個蛋白功能： 分離pre-rRNA相關(guān)性：皮肌炎：5% - 10%HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗NORHEp-2細胞/靈長類肝臟：抗Ku多肌炎和皮肌炎的抗體譜靶抗性率 （%ssDNA40-50Jo-125-35PM-Scl