生物工程下游技術(shù)復(fù)習(xí)重點(diǎn)

1、生物工程下游技術(shù)復(fù)習(xí)重點(diǎn)名詞解釋部分生物工程下游技術(shù)：各種生物工業(yè)生產(chǎn)過程獲得的生物原料，經(jīng)過提取、分離、加工、精制等方法得到其目的成分，最終制得產(chǎn)品。批式培養(yǎng)：指的是營養(yǎng)物質(zhì)和菌種一次性加入反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，直到結(jié)束才放出，期間除了空氣進(jìn)入和尾氣排出，與外界無其他物料交換。生物反應(yīng)器的放大：是以中試反應(yīng)設(shè)備的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為依據(jù)，設(shè)計(jì)制造大規(guī)模反應(yīng)系統(tǒng)以進(jìn)行工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：所謂動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是將動(dòng)物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長和繁殖。固定化培養(yǎng)：是將動(dòng)物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來，再進(jìn)行培養(yǎng)。吸附：指用固體吸附劑將細(xì)胞吸附

2、在其表面而使細(xì)胞固定化的方法。共價(jià)貼附：利用共價(jià)鍵將動(dòng)物細(xì)胞與結(jié)合的固定化方法離子/共價(jià)交聯(lián)法：如果對(duì)細(xì)胞用交聯(lián)劑處理，則在細(xì)胞之間形成交聯(lián)橋，使之絮結(jié)。包埋法：將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法半連續(xù)式培養(yǎng)：在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。灌注式培養(yǎng)：把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基微載體：指直徑60-250微米，能適用于貼壁細(xì)胞生長的微珠吸附平衡：溶液中的溶質(zhì)被吸附劑表面俘獲的同時(shí)，一部分被吸附的溶質(zhì)會(huì)脫離吸附

3、劑回到溶液，即解吸附，當(dāng)吸附的速率與解吸附的速率達(dá)到相等時(shí)，吸附劑上的溶質(zhì)量不再改變即為吸附平衡。基線：在實(shí)驗(yàn)條件下，色譜柱后僅有純流動(dòng)相進(jìn)入檢測器時(shí)流出的曲線成為基線。保留時(shí)間：試樣從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值時(shí)的時(shí)間，它包括組分隨流動(dòng)相通過柱子的時(shí)間t0和組分在固定相中滯留的時(shí)間調(diào)整保留時(shí)間：某組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間，它是組分在固定相中的滯留時(shí)間。死體積：色譜柱管內(nèi)固定相顆粒間空隙、色譜儀管路和連接頭間空隙和檢測器間隙的綜合。保留體積：指從進(jìn)樣到待測物在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過的流動(dòng)相的體積。調(diào)整保留體積：某組分的保留體積扣除死體積后的體積。蛋白質(zhì)復(fù)性：包涵體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液

4、中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞，當(dāng)除去變性劑后，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。膜：在流體相之間有一層薄的凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔開來成為兩部分，這一薄層物質(zhì)稱為膜。截流曲線：測定分子量不同的球形蛋白質(zhì)或水溶性聚合物的截留率，所得到的膜的截留率與溶質(zhì)分子量之間關(guān)系的曲線。全交換容量：每克干介質(zhì)或每毫升濕介質(zhì)具有的功能基含量工作容量：每克干介質(zhì)或每毫升濕介質(zhì)在一定的操作條件下的交換吸附蛋白質(zhì)的實(shí)際容量。電泳：指帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象2.填空題（1）細(xì)胞生長所需條

5、件為（）和（）。良好的物理環(huán)境和合適的化學(xué)環(huán)境（2）細(xì)胞生長是一個(gè)（）、（）、（）的體系。多相，多組分，非線性（3）生物反應(yīng)器的類型按其結(jié)構(gòu)可分為（）和（）。按操作方式可分為（）、（）和（）。機(jī)械攪拌發(fā)酵罐和氣升式發(fā)酵罐；批式、連續(xù)、半連續(xù)（4）機(jī)械攪拌發(fā)酵罐主要有（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）等七個(gè)部分組成。殼體、控溫部分、攪拌部分、進(jìn)氣孔、進(jìn)料口、監(jiān)測系統(tǒng)、附屬系統(tǒng)（5）機(jī)械攪拌發(fā)酵罐和氣升式發(fā)酵罐的主要分別是其（）和（）不同。結(jié)構(gòu)和混合方式（6）生物反應(yīng)器放大的核心問題是（），放大的目的是（）。傳質(zhì)過程、維持中試所得到的最佳細(xì)胞生長速率，產(chǎn)物的生成速率。（7）生物反應(yīng)過程參數(shù)檢

6、測方法可分為（）和（）。在線監(jiān)測和離線檢測（8）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有三種類型，分別是（）、（）和（）。貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)（9）細(xì)胞貼壁的步驟是（）、（）、（）、（）。貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細(xì)胞與表面接觸、細(xì)胞貼壁于培養(yǎng)表面、貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)表面上擴(kuò)展。（10）常用的細(xì)胞固定化方法主要有（）、（）、（）、（）和（）。吸附、共價(jià)貼附、離子/共價(jià)交聯(lián)、包埋和微囊化（11）無論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，就操作方式而言，深層培養(yǎng)可分為（）、（）、（）、（）和（）。分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式（12）流加式操作的總體原則是維持細(xì)胞生長相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營養(yǎng)成分既不（）也不（）。過剩、缺乏

7、（13）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中需添加血清，血清的主要作用是（）和（）。提供營養(yǎng)、對(duì)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。（14）色譜技術(shù)按照其分離機(jī)理可分為（）、（）、（）和（）。吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠過濾色譜（15）色譜技術(shù)按照固定相形狀可分為（）、（）和（）。紙色譜、柱色譜和薄層色譜（16）生物反應(yīng)器按其細(xì)胞培養(yǎng)的方式不同，可分為（）、（）和（）。懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器、貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器和包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器。（17）細(xì)胞在微載體表面的（）和（）是細(xì)胞生長的關(guān)鍵。貼附和鋪展（18）貼壁細(xì)胞在微載體表面上增殖，要經(jīng)歷（）、（）和（）三個(gè)階段。粘附貼壁，生長，擴(kuò)展成單層（19）細(xì)胞能否在微載體表面貼附，

8、一是取決于（），二是取決于（）。細(xì)胞與微載體接觸的幾率，細(xì)胞與微載體的相容性（20）控制細(xì)胞貼壁的速度的基本因素是（），而不是（）。微載體表面的電荷密度，表面極性。（21）色譜技術(shù)按照其操作壓力可分為（）、（）和（）。壓力分別是（）、（）、（）。低壓色譜、中壓色譜和高壓色譜；小于0.5兆帕，0.5-5兆帕，5-50兆帕（22）色譜技術(shù)按照分離時(shí)一次進(jìn)樣量的多少可分為（）、（）、（）和（）。一次進(jìn)樣量分別是（）、（）、（）、（）。分析色譜、半制備色譜、制備色譜和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模色譜；小于10mg，10-50mg，1-10g，大于20g每天。（23）分配色譜由（）、（）和（）構(gòu)成，其中（）為惰性物質(zhì)，

9、優(yōu)先吸附（）而對(duì)（）無吸附能力。載體、附著在載體表面的固定相和流動(dòng)相；載體；固定相、溶質(zhì)（24）專門用于純化生物大分子的色譜分離技術(shù)是（），它是基于固定相的（）與生物分子間的（）的不同來進(jìn)行相互分離的。親和色譜；配基；特殊生物親和力（25）柱色譜的裝置由（）、（）和（）構(gòu)成。進(jìn)樣及流動(dòng)相供給裝置，色譜柱，檢測器與流分收集器（26）柱色譜展開操作可分為（）、（）和（）。洗脫展開、前沿分析、置換展開（27）離心沉降法是根據(jù)固體與液體之間的（），利用離心機(jī)提供的（）實(shí)現(xiàn)固液分離。密度差、離心力（28）衡量離心力大小的主要指標(biāo)是（）。分離因數(shù)（29）微孔膜過濾是根據(jù)流體各組分（）的不同，利用（），過濾

10、分離微米級(jí)的（）、（）和（）的過程。尺寸大小、高分子聚合膜、細(xì)胞、細(xì)胞碎片、生物大分子（30）膜的用途有（）、（）、（）和（）。濃縮、純化、分離、反應(yīng)促進(jìn)（31）防止或減輕膜污染措施有（）、（）和（）。對(duì)料液進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)對(duì)膜進(jìn)行預(yù)處理，改變操作條件（32）凝膠過濾的用途有（）、（）和（）。分組分離、分級(jí)分離、分子量測定（33）常用的離子交換劑有（）和（）兩種類型。通用型離子交換樹脂功能基，生化專用離子交換介質(zhì)（34）在電泳技術(shù)中，表面活性劑（SDS等）強(qiáng)烈破壞蛋白質(zhì)分子間的（），使蛋白質(zhì)分子為表面溶劑分子所包圍，阻止了（），同時(shí)消除了不同蛋白質(zhì)固有的（）。非共價(jià)作用，蛋白質(zhì)之間的相互作用，電

11、荷差異。（35）控制電泳介質(zhì)的有效黏度，包括（）和（）。選擇適當(dāng)?shù)哪z孔徑；添加能增加介質(zhì)黏度的物質(zhì)。（36）在電泳技術(shù)中，指示劑前沿呈兩邊向上的曲線形，稱為（）現(xiàn)象，這說明凝膠的（）。如果指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向下的曲線形，稱為（）現(xiàn)象。此現(xiàn)象常常是由于（）引起的。微笑、不均勻冷卻、皺眉、垂直電泳時(shí)電泳槽的裝置不合適3.簡答題部分（1）簡述機(jī)械攪拌發(fā)酵罐的優(yōu)缺點(diǎn)答：優(yōu)點(diǎn)：適應(yīng)性好，從小型到中型、大型的細(xì)胞培養(yǎng)過程都可以用，放大容易其缺點(diǎn)：罐內(nèi)的接卸攪拌剪切力容易損傷細(xì)胞，造成細(xì)胞培養(yǎng)過程的減產(chǎn)。（2）動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，比較嬌嫩，所以對(duì)培養(yǎng)的要求更高一些。在設(shè)計(jì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的裝置時(shí)需注意考慮哪些方

12、面？答。1.降低電攪拌造成的機(jī)械剪切力2.在通氣時(shí)要防止氣泡與細(xì)胞接觸，因?yàn)闅馀菘蓳p傷細(xì)胞3.在進(jìn)行ph調(diào)整時(shí)避免化學(xué)環(huán)境的劇變，不能直接加入酸堿，對(duì)細(xì)胞造成損傷，應(yīng)通過改變co2,o2,n2的比例進(jìn)行調(diào)整。（3）請簡述生物反應(yīng)器在線監(jiān)測的過程。答：將能夠感應(yīng)檢測參數(shù)變化的傳感器直接放到生物反應(yīng)器中的測量點(diǎn)上，傳感器將測量點(diǎn)的待測參數(shù)變化轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，經(jīng)放大，送到顯示系統(tǒng)和控制單元。（4）簡述能夠在生物反應(yīng)器上有效使用的傳感器應(yīng)滿足的條件。答：（1）反應(yīng)靈敏快速。（2）傳感器結(jié)構(gòu)應(yīng)簡單整潔，不能有清洗死角以免帶菌產(chǎn)生污染。（3）傳感器應(yīng)當(dāng)有很高的可靠性和長時(shí)間的穩(wěn)定性。（4）傳感器應(yīng)當(dāng)能夠耐受

13、消毒蒸汽的溫度和壓力。（5）簡述流加式培養(yǎng)的操作方法：答：細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/2-1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰退期或衰退期后進(jìn)行終止回收整個(gè)反應(yīng)體系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋白。（6）簡述無血清動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究成為了熱點(diǎn)的原因有哪些？（1） 答：血清中除營養(yǎng)因子外，還有其他多種復(fù)雜的成分，對(duì)其作用尚未作出充分確定（2） 血清的存在對(duì)產(chǎn)物純化形成主要障礙，甚至使產(chǎn)物難以成為藥物產(chǎn)品（3） 血清中常污染有病毒，雖然有的細(xì)胞培養(yǎng)看不出明顯影響，但畢竟增加了未知因素，使操作者無法控制（4）可降低

14、成本。（7）簡述優(yōu)良的微載體應(yīng)具備的特性1） 答：不含能毒害細(xì)胞的成分2） 微載體須與細(xì)胞有良好的相容性目的是讓細(xì)胞更容易貼壁3） 密度應(yīng)略大于培養(yǎng)基：輕度攪拌微載體能懸浮在培養(yǎng)基中，停止攪拌又能較快地沉降下來-容易分離。一般要求在1.03-1.05之間，最大不宜超過1.1。4） 干態(tài)的微載體粒徑在40-120微米范圍，生理鹽水溶脹后增大到60-250微米，粒度分布地均勻，徑差不大于20-25微米，表面光滑以利于細(xì)胞鋪展。5） 良好的光學(xué)透明性，便于顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。6） 能在PBS中耐120-125，20-30min高溫滅菌7） 基質(zhì)應(yīng)是非剛性材料：避免在培養(yǎng)過程中相互碰撞而損傷細(xì)胞。

15、8） 不吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，特別是血清。9） 收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品容易，不影響蛋白質(zhì)分離純化10） 價(jià)廉，能重復(fù)使用。（8）簡述制備動(dòng)物細(xì)胞微囊化的簡單過程。答：動(dòng)物細(xì)胞與海藻酸溶液混合攪拌，經(jīng)過微囊發(fā)生器將微球滴入氯化鈣溶液中，形成凝膠，然后再用聚賴氨酸處理，使微球表面成膜，最后用檸檬酸處理去除球內(nèi)的鈣離子，以便球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動(dòng)物細(xì)胞得以懸浮在其中。（9）請簡述色譜分離的基本原理。答：使用外力使含有樣品的流動(dòng)相（氣體、液體或超臨界流體）通過一固定于柱或平板上，與流動(dòng)相互不相容的固定相表面。由于處于柱起始端樣品中各組分與兩相（固定相與流動(dòng)相）的作用程度不同，因此，與固定相作用強(qiáng)的組分隨

16、流動(dòng)相流出的速度較慢，而與固定相作用弱得組分隨流動(dòng)相流出的速度較快。由于流出的速度的差異，使得混合組分最終形成各個(gè)單組份的“”帶其或“區(qū)”，從而達(dá)到分離的目的。（10）簡述色譜分離的基本特點(diǎn)。答：（1）分離效率高（2）應(yīng)用范圍廣（3）操作參數(shù)多（4）高靈敏度在線監(jiān)測（5）快速分離（6）過程自動(dòng)化操作（11）請簡述親和色譜的基本過程答：把具有特異親和力的一對(duì)分子的任何一方作為配基，在不傷害其生物功能情況下，與不溶性載體結(jié)合，使之固定化，裝入色譜柱，然后把含有目的物質(zhì)的混合液作為流動(dòng)相，在有利于固定相配基和目的物質(zhì)形成絡(luò)合物的條件下進(jìn)入色譜柱。目的物質(zhì)被吸附，雜質(zhì)直接流出。變換過柱溶液，使配基與其

17、親和物分離，獲純化的目的產(chǎn)物。（12）非線性色譜與線性色譜中樣品色譜行為的根本不同表現(xiàn)在哪些方面。書中第八章有答案。（13）產(chǎn)物提純過程分為哪兩個(gè)階段？每個(gè)階段的目的都是什么？答：初級(jí)分離：分離細(xì)胞和培養(yǎng)液，破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物，溶解包涵體，復(fù)原蛋白質(zhì)，濃縮產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)等。主要決定產(chǎn)物的得率純化精制：在初級(jí)分離的基礎(chǔ)上，用各種高選擇性手段，主要是各種層析技術(shù)，將目標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能分開，使產(chǎn)物的純度達(dá)到有關(guān)要求。主要決定產(chǎn)物的純度（14）請簡述化學(xué)滲透法的作用機(jī)理，并說明與機(jī)械破碎法相比有哪些優(yōu)缺點(diǎn)。答：作用機(jī)理：某些有機(jī)溶劑，抗生素，表面活性劑，金屬螯合劑，變性劑等化學(xué)藥品都可以改變

18、細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)容物有選擇地滲透出來，這種處理方法叫滲透法。優(yōu)點(diǎn)（相對(duì)機(jī)械破碎）對(duì)產(chǎn)物釋放有一定選擇性，如可以釋放分子量小的，分子量大的（如核酸）阻滯在胞內(nèi)，又如可以釋放不同部位，核酸釋放量少，粘度低，便于進(jìn)一步提取。細(xì)胞外形保持完整，碎片少，利于進(jìn)一步分離缺陷1 時(shí)間長，效率低。2 化學(xué)試劑具有毒性，對(duì)產(chǎn)物有毒害作用通用性差，某種試劑只能用于某些特定的細(xì)胞。（15）簡述微波加熱法破碎細(xì)胞的作用機(jī)理。答：微波加熱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)，尤其是水分子吸收微波能產(chǎn)生大量熱量，使胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖裂，形成微小孔洞，進(jìn)一步加熱可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少

19、，細(xì)胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋。（16）減少包涵體的形成，都有哪些策略。答：1)降低重組菌的生長溫度：2)添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑3)供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件如供氧，ph等。（17）簡述膜過濾操作的優(yōu)缺點(diǎn)。答：優(yōu)點(diǎn)：1 容易做到封閉式操作，不受環(huán)境污染2 設(shè)備投資少，操作安全；3 加工量可大可小，十分方便；4 有利于分離密度差小而難以離心的固體，可直接用于下游的層析過程。缺點(diǎn)：1 技術(shù)難以掌握，影響因素多；2 穩(wěn)定性和重復(fù)性不好；3 膜堵塞問題難以解決！（18）膜材料的基本要求有哪些？答：（1）耐壓：（2）耐高溫:（3）耐酸堿（4）化學(xué)相容性：（6）成本低。（5）生物相容

20、性：（19）生化用離子交換劑的特點(diǎn)有哪些？答：1、具有親水性及生物相容性2、孔結(jié)構(gòu)主要有3種：凝膠孔（溶脹時(shí)孔變大）、大孔樹脂（孔在干、濕態(tài)都存在）和瓊脂糖介質(zhì)的孔（孔徑大小與瓊脂糖濃度有關(guān)）。3、電荷密度：電荷密度要適當(dāng)。4、粒度：粒徑小，分布均勻則分離效果好。5、純度有四個(gè)等級(jí)，分別是分工業(yè)級(jí)，分析級(jí)，生物技術(shù)級(jí)，分子生物級(jí)。（20）簡述電泳過程發(fā)熱會(huì)造成哪些后果？應(yīng)如何解決？答：電泳過程發(fā)熱會(huì)造成蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)區(qū)帶擴(kuò)散，分辨率下降對(duì)策：1）減少發(fā)熱：降低電流，提高電壓；提高傳熱表面積；提高材質(zhì)的傳熱系數(shù)；提高冷卻系統(tǒng)的溫差2）減少擴(kuò)散：增加緩沖系統(tǒng)或介質(zhì)的黏度可以減少擴(kuò)散；在微重力作

21、用下進(jìn)行電泳；4.論述題部分（1）生物反應(yīng)器的主要控制參數(shù)有哪些？如何進(jìn)行控制的？1） 答：溫度的控制：溫度是影響發(fā)酵過程的一個(gè)重要參數(shù)，不僅因?yàn)樯锉旧韺?duì)溫度敏感，而且生物生長和產(chǎn)物合成的所必需的酶在一定的溫度下才能發(fā)揮較高的活性。溫度控制器使用溫度探頭感應(yīng)反應(yīng)器內(nèi)的溫度，當(dāng)溫度大于設(shè)定值時(shí)，將電加熱器關(guān)閉，通入的冷水很快使溫度降低。當(dāng)溫度低于設(shè)定值時(shí)，控制儀打開電加熱器，使溫度升高?？刂苾x使用開、關(guān)控制的辦法，配合冷水將溫度控制在一定范圍。2） 溶氧的控制：溶氧的濃度取決于氧氣進(jìn)入培養(yǎng)液的速度和生物消耗氧氣的速度，如果前者大于后者，氧氣濃度增加，否則降低，而在這兩者中，我們能夠控制的只有氧

22、氣進(jìn)入培養(yǎng)液的速度。氧氣進(jìn)入培養(yǎng)液的速度取決于四個(gè)因素：攪拌速度、鼓入的空氣速度、鼓入的氣體中氧氣的含量和反應(yīng)器內(nèi)氧氣的分壓。增加氧氣的濃度和增加反應(yīng)器內(nèi)氧氣的分壓具有類似的效果，都能夠提高氧氣進(jìn)入液相的推動(dòng)力。3） pH的控制：有效的pH對(duì)于工藝過程的成功非常重要。pH的控制依靠向反應(yīng)器內(nèi)滴加酸或堿溶液完成（當(dāng)然是對(duì)于微生物而言）。當(dāng)pH探頭測得反應(yīng)器內(nèi)pH高于設(shè)定值時(shí)，pH放大控制儀向酸泵發(fā)出信號(hào)滴加酸溶液，否則，向堿泵發(fā)出信號(hào)滴加堿溶液。（2） 論述常用的固定化方法主要有哪些？它們都有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？答：常用的細(xì)胞固定化的方法主要有吸附、共價(jià)貼附、離子/共價(jià)交聯(lián)、包埋和微囊化。吸附：定義：是

23、指用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、條件溫和，是動(dòng)物細(xì)胞固定化中最早研究使用的方法。缺點(diǎn)：載體的負(fù)荷能力低，細(xì)胞容易脫落，由于細(xì)胞吸附于支持物表面，因此容易受到機(jī)械剪切力的作用。共價(jià)貼附定義：利用共價(jià)鍵將動(dòng)物細(xì)胞與結(jié)合的固定化方法優(yōu)點(diǎn)：此法可減少細(xì)胞的泄露，缺點(diǎn)：須引入化學(xué)試劑，對(duì)細(xì)胞活性有影響，且因貼附而導(dǎo)致擴(kuò)散限制小，細(xì)胞得不到保護(hù)。離子/共價(jià)交聯(lián)法定義：如果對(duì)細(xì)胞用交聯(lián)劑處理，則在細(xì)胞之間形成交聯(lián)橋，使之絮結(jié)。缺點(diǎn)：交聯(lián)試劑會(huì)使一些細(xì)胞死亡，也會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)散限制。包埋法定義：將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法優(yōu)點(diǎn)：步驟簡單，條件溫和，負(fù)荷量大，細(xì)胞

24、泄露少，抗機(jī)械剪切缺點(diǎn)：擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳基質(zhì)濃度，且大分子機(jī)制不能滲透到高聚物網(wǎng)格內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴性細(xì)胞的固定化。微囊法是用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長好，密度高。（3） 請舉兩個(gè)機(jī)械破碎細(xì)胞的方法，并從設(shè)備、作用機(jī)理、溫控、優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行比較。1） 答：高壓勻漿法（1）設(shè)備：高壓勻漿器：由高壓泵和勻漿閥組成。（2）作用機(jī)理：高壓泵將電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)變成勻漿閥柱桿的直線運(yùn)動(dòng)，從高壓室（幾十兆帕）壓出細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過碰撞環(huán)的撞擊后改變

25、方向從出口管噴出，使細(xì)胞經(jīng)歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大的變形，從而達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。也就是細(xì)胞經(jīng)歷了高流速下的剪切、碰撞、高壓到常壓。細(xì)胞懸浮也經(jīng)歷一次高壓勻漿后。只有一部分細(xì)胞破碎，不能達(dá)到100%的細(xì)胞破碎率。（3）溫控和能耗如何控制濃度：勻漿過程中產(chǎn)生的熱會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)和酶的失活。溫度在35以下，失活問題可以忽略。因此低溫操作是必須的。高壓勻漿一般需多級(jí)操作，每次循環(huán)前往往進(jìn)行級(jí)間冷卻能耗：能耗主要來自提供動(dòng)力（如壓力）消耗的能量和控制低溫操作耗費(fèi)的能量。提高壓力可以增加細(xì)胞的破碎率，但是同時(shí)增加了能耗。將破碎過程中產(chǎn)生的熱量移走也需要付出代價(jià)。（4）存在的問題不適合團(tuán)塊狀或絲狀真菌

26、（導(dǎo)致堵塞）以及較小的革蘭氏陽性菌，2 質(zhì)地堅(jiān)硬者如包涵體易損傷勻漿閥，也不適用（但是也有很多人在實(shí)驗(yàn)室中用此方法來研究含有包涵體的大腸桿菌的破碎。）3 溫度高易失活，能耗大4 一次操作不能達(dá)到100%的細(xì)胞破碎率。因此需一次操作后回收破碎液進(jìn)行第二次，第三次或更多次。2） 高速珠磨法（1）設(shè)備：珠磨機(jī)（2）作用機(jī)理：細(xì)胞和級(jí)細(xì)的研磨劑（一般為無鉛玻璃珠）在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間及珠子與細(xì)胞之間相互剪切、碰撞，促使細(xì)胞壁破裂，釋放內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出。從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。（3）溫控和能耗：控制溫度：采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫控，效果較好，能耗：能耗與細(xì)

27、胞破碎率成正比。珠磨機(jī)提高細(xì)胞破碎率需要增加裝珠量或延長破碎時(shí)間或提高轉(zhuǎn)速。這些操作不僅導(dǎo)致電能消耗的增加，而且產(chǎn)生了較多的熱量。為了控制溫度，需增加制冷費(fèi)。（4）優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)所有細(xì)胞都適用，包涵體也可以。因?yàn)榘w質(zhì)地堅(jiān)硬，可以充當(dāng)研磨劑。2 兼具破碎和冷卻的雙重功能，減少失活的可能性3 適當(dāng)條件下，一次操作就能達(dá)到較高的破碎率。缺點(diǎn)：參數(shù)多，轉(zhuǎn)速，珠子的直徑和用量，細(xì)胞濃度等等。確定起來比較困難，一般憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)。（4） 從細(xì)胞破碎到蛋白質(zhì)復(fù)性可以走不同的工藝路線。此工藝路線主要有哪三種？分別有哪些特點(diǎn)？1）機(jī)械破碎（高壓勻漿、高速珠磨法）-離心法提取出包涵體-加變性劑溶解-除去變性劑此

28、路線利用了包涵體與細(xì)胞碎片的密度差，用離心法將包涵體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，獲得了干凈的包涵體，在對(duì)包涵體溶解復(fù)性。這樣首先就擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡單化了。缺點(diǎn)：要經(jīng)過幾次離心才能除去大部分細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長2）機(jī)械破碎-膜分離除可溶性蛋白-變性劑溶解包涵體-除變性劑復(fù)性此路線應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片卻和包涵體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的直流，因此這條路線的問題較多。優(yōu)點(diǎn)：膜分離是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少3）化學(xué)破碎（加變性劑），離心除細(xì)胞碎片-除變性劑復(fù)性。此路線是用化學(xué)法破菌，所采用的試劑既可以破菌有可以溶解包涵體，將兩道