遺傳學(xué)試驗教程

1、遺傳學(xué)實驗教程主編徐振平副主編 范雪輝陳偉王樹芳楊述芳新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系15 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark6 o Current Document 人類性染色質(zhì)標(biāo)本制備技術(shù)91222F eul g en3 1-33353 8-404143實驗一人類染色體標(biāo)本制備人體內(nèi)任何旺盛有絲分裂的細(xì)胞或者在體外適當(dāng)培養(yǎng)下能旺盛分裂的組織細(xì)胞群，均可作為細(xì)胞遺 傳學(xué)研究的材料，用于制備染色體標(biāo)本。常用的材料有外周血淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、羊水細(xì)胞、絨毛細(xì) 胞、胸腹水細(xì)胞、性腺活檢組織、精子、實體瘤組織，以及皮膚、肝和腎等組織。這些材料按下述方法 進(jìn)行處理后，都可作為

2、研究人類染色體的材料，用于染色體病的診斷和產(chǎn)前診斷等。【實驗?zāi)康摹苛私夂驼莆胀庵苎?xì)胞培養(yǎng)試劑的配制和消毒方法；學(xué)習(xí)、掌握培養(yǎng)細(xì)胞的染色體制備的一般 方法，掌握人類染色體的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)?！緦嶒炂鞑暮驮噭?儀器設(shè)備超凈工作臺、帶有照相裝置的光學(xué)顯微鏡、隔水式恒溫培養(yǎng)箱或CO2培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、電熱干燥箱、離心機、冰箱、分析天平( 1/10 000 )或電子天平、普通天平、高壓蒸氣滅菌鍋、小型真空泵、電吹風(fēng)、pH計、定時鐘、秒表。.器材 G 6型玻璃漏斗(細(xì)菌濾器)、蒸儲水瓶、蒸儲水器、10ml刻度離心管、10ml培養(yǎng)瓶(或青霉素小瓶、帶瓶塞)、2ml注射器、吸管、滴管、燒杯、量筒、錐形瓶、試

3、管架、三角燒瓶、染色缸、 酒精燈、各種試劑瓶、載玻片、鏡子、吸水紙、洗耳球、搪瓷盤、鋁制飯盒、酒精棉球、碘酒棉球以及 包布等。.試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)液(含 10%20%小牛血清)、NaHCO3、PHA、青霉素、 鏈霉素、 肝素溶液、 秋水仙素或秋水仙胺、1mol/L HCl、雙蒸水(ddH2O)、0.075mol/L KCl、甲醇、冰醋酸、 Giemsa染液液、pH6.8 的 PBS。【實驗內(nèi)容與方法】外周血的淋巴細(xì)胞在體內(nèi)外一般是不分裂的，它們都處于間期的 Go或Gi期，故在未經(jīng)培養(yǎng)的外周血中很難見到正在分裂的淋巴細(xì)胞。1960年Nowell發(fā)現(xiàn)從蕓豆(phaseolus vulg

4、aris )中提取的能使紅細(xì)胞凝集的物質(zhì)植物血球凝集素( phytohemgglutinin , PHA)可以刺激淋巴細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為幼稚的原始細(xì)胞樣(blast like )的細(xì)胞淋巴母細(xì)胞而具有重新分裂的能力。以外周血為材料制備淋巴細(xì)胞 染色體標(biāo)本由于具有取材方便、用血量少(0.31.0ml )及容易培養(yǎng)、培養(yǎng)時間短即可得到大量有絲分裂相等優(yōu)點，故該方法在國內(nèi)外的有關(guān)實驗室中以及臨床上被廣泛應(yīng)用，細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域中幾乎90%以上的研究取材于外周血。按容器是否密閉，培養(yǎng)方法可分兩種：一種是使用二氧化碳培養(yǎng)箱，培養(yǎng)容器 不需密閉，用循環(huán)的5%的CO2調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH ;另一種是使用普通的恒溫箱，

5、培養(yǎng)瓶口要密封或用瓶塞塞緊。后一種在一般實驗室內(nèi)即可做到。止匕外，按培養(yǎng)的血量或淋巴細(xì)胞數(shù)目，可分標(biāo)準(zhǔn)法、半微量或 微量全血法( whole blood microculture )兩種。微量全血方法采血量少，尤其在對小兒、新生兒的研究中更為適用。在需要大量染色體標(biāo)本(如進(jìn) 行G、Q顯帶的研究)以及需要積累大量有絲分裂細(xì)胞，尤其是早期分裂細(xì)胞(如高分辨染色體的研 究)時，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法仍然適用。巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)至72小時左右時，大多數(shù)細(xì)胞已處于第二次增殖周期內(nèi)，在收獲細(xì)胞前加入一定量的秋水仙素或秋水仙胺將細(xì)胞阻止于有絲分裂中期，可導(dǎo)致積累大量含有可見的中期染色體的細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液離心、低滲和固

6、定處理，最后將細(xì)胞懸液滴于濕冷清潔的玻片上?？諝庵凶匀桓稍?即得可供分析的中期染色體標(biāo)本。從染色體標(biāo)本中不僅能精確計數(shù)染色體的數(shù)目，而且能用來檢驗個別染色體畸變（變異）。近年來，由于各種顯帶技術(shù)與高分辨染色體技術(shù)的問世與不斷改進(jìn)，使淋巴細(xì)胞培養(yǎng)已成為遺傳學(xué)研究中的一種常用方法。一 人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)以半微量全血法為例，有關(guān)器械的清洗和消毒、細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制及消毒見附錄。.采血 用一次性 2ml注射器抽取肝素稀釋液 0.2ml ,濕潤針管，然后將多余的肝素排除。以碘酒及酒精清洗并消毒供血者肘部皮膚，用橡皮管結(jié)扎靜脈回流的上端，將肝素預(yù)先潤濕的注射器刺入肘部 靜脈，抽取靜脈血0.52ml,然后

7、轉(zhuǎn)動針管，使血液和肝素混合。.接種和培養(yǎng)在無菌室內(nèi)的超凈工作臺上，或用酒精消毒培養(yǎng)瓶的翻口瓶塞后插入針頭，將抽得的抗凝血迅速接種到5ml含適量PHA （約0.2ml ）及小牛血清的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種全血0.4ml左右（6號針頭1520滴），輕輕搖勻，置37 c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)研究需要與具體情況（如各實驗室條件、試劑的影響等）可培養(yǎng)4872小時，一般有絲分裂的高峰多在培養(yǎng)6072小時之間。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法由于用血量大，不易為受檢者接受。一般的程序是：取靜脈血510ml,室溫下靜置12小時，或低速離心（400500r/min ）數(shù)分鐘。此時可見血漿及介于血漿與紅細(xì)胞層之間的白細(xì)胞層，將血漿及白細(xì)胞層吸

8、出混勻，以0.60.8ml接種到已配制的混合培養(yǎng)液5ml中，剩余的紅細(xì)胞層仍可按上述全血法進(jìn)行培養(yǎng)。.積累中期細(xì)胞 在終止培養(yǎng)前46小時，用1ml注射器（裝 5號針頭）加入濃度為 5以g/ml的 秋水仙素2滴，使培養(yǎng)液中的秋水仙素終濃度為0.05以g/ml。輕輕搖勻，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至72小時。加入秋水仙素的目的在于抑制紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停止在中期。以下步驟則不需無菌操作。二染色體標(biāo)本的制備1.收獲細(xì)胞取出培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)液搖勻后傾入10ml刻度離心管中，在粗天平上配平后放入離心機，以1 000r/min 離心810min ,吸棄上清液，保留細(xì)胞懸液約0.5ml。2 .低滲處理往離心管

9、中加入8ml已溫浴達(dá) 37 c的0.075 mol/L KCl溶液，用吸管混勻，置37 C恒溫水浴箱中低滲1525min （精確的低滲時間可自行摸索）3 ： 1）并用吸管混勻,.預(yù)固定低滲處理完成后，加入 1ml新配制的固定液（甲醇：冰醋酸為平衡后放入離心機，以 1 000r/min 離心810min 。吸棄上清液。.固定加入 6ml固定液，用吸管將沉淀的細(xì)胞輕輕混合成細(xì)胞懸液，室溫下靜置20min后，1000r/min 離心 810min。吸棄上清液。.再固定 加入4ml固定液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞混勻，室溫下靜止15min或更長時間。（如由于某種原因，不能立即制片時，可將離心管口蓋好，置冰

10、箱中過夜或更長時間）。.制片將上述細(xì)胞混懸液離心（1 000r/min , 8min ）,吸棄上清液，視離心管中沉淀（細(xì)胞）的多少加入 0.20.4ml左右的固定液，用吸管輕輕混成細(xì)胞懸液（混合后的液體呈淡乳白色即表示細(xì)胞濃度適當(dāng)）。用吸管吸取細(xì)胞懸液以2035cm高的距離滴于清潔預(yù)冷的玻片上，每片滴23滴，滴完后立即對準(zhǔn)玻片吹氣以助細(xì)胞的分散，并立即將玻片放在酒精燈火焰上來回過幾下（勿烤干），靜置并空氣中晾干。最好先滴片一張，置高倍鏡下觀察，如染色體分散良好，即可制片，如分散不好，可按上 述方法再次固定。必要時可采用甲醇：冰醋酸（1 ： 1）固定液進(jìn)行固定，將會獲得滿意的染色體標(biāo)本。.染色

11、若所制備的標(biāo)本用于染色體的非顯帶分析，則將晾干的玻片標(biāo)本用Giemsa染液（以1份Giemsa原液加9份pH 6.8的PBS液混合而成）染色 510min。然后在自來水管下用細(xì)水流自玻片一端 輕輕沖洗，晾干或吹干后鏡檢。.觀察 將制片置于低倍鏡下觀察，選擇染色體分散好，無胞漿背景的中期分裂相（圖 后換高倍鏡、油鏡觀察染色體形態(tài)，在鏡下初步計數(shù)。圖1- 1顯微鏡下的人類非顯帶中期染色體三外周血淋巴細(xì)胞短期培養(yǎng)及制備染色體標(biāo)本注意事項外周血淋巴細(xì)胞短期培養(yǎng)及制備染色體標(biāo)本弁不困難，但如操作不嚴(yán)或試劑質(zhì)量不好則可能使培養(yǎng)結(jié)果及標(biāo)本制作不佳或失敗。.防止污染是培養(yǎng)成功與否的先決條件，收獲前的所有操作過

12、程應(yīng)保持高度無菌，嚴(yán)防細(xì)菌和病 毒污染。.培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在 37 0.5 C,為能精確有效地控溫，在普通的隔水式恒溫培養(yǎng)箱上可加裝一個電子控溫儀。.培養(yǎng)基的 pH值應(yīng)調(diào)整到 7.27.4之間，偏酸時細(xì)胞發(fā)育不良，偏堿時細(xì)胞會出現(xiàn)輕度固縮。.在采血或接種時，注意不要使用太多的肝素，因肝素過多會抑制淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，但也不宜太 少，否則易出現(xiàn)凝血現(xiàn)象。如果培養(yǎng)物中出現(xiàn)膜狀凝塊，可輕搖培養(yǎng)瓶使凝塊散開。.注意培養(yǎng)過程中蓋緊培養(yǎng)瓶口（開放式培養(yǎng)除外），以免培養(yǎng)液的pH值發(fā)生較大變化。如果培養(yǎng)液變黃，說明偏酸，此時可加入無菌的2%NaHCO 3溶液或另加入 23ml培養(yǎng)液進(jìn)行調(diào)整。. PHA的質(zhì)量

13、好壞直接關(guān)系到人體淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的成敗，市售的PHA由于廠家、出廠時間、批號不同而有差異，精確的用量應(yīng)自行摸索。一般使用量為每毫升培養(yǎng)液200300 w g （市售10mg安甑瓶PHA用2ml生理鹽水稀釋，每瓶培養(yǎng)物加 0.20.3ml ）。PHA的量也不宜過大，否則會導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集。.所用的玻璃器皿及其它用品都要清洗干凈，各種試劑盡量選用分析純級。.配制培養(yǎng)液等溶液所用雙蒸水宜用玻璃蒸儲器制備。.離心機最好用水平式的，速度宜用 1 000r/min ,如速度太高，沉降在管底的細(xì)胞團(tuán)不易打散； 速度太低， 分裂相易丟失。如果低滲后離心速度過高，則會使分裂細(xì)胞過早破裂，在最后制成的標(biāo)本中，完整的分

14、裂相過少。.秋水仙素的使用濃度和處理時間直接影響分裂相的數(shù)量及染色體的長度，量大使染色體縮短變 粗，量少則分裂相少；時間長則染色體收縮。.低滲時間的長短關(guān)系到染色體分散的好壞，時間不足染色體分散不好，低滲過度則染色體分散過度甚至丟失。.固定應(yīng)徹底， 固定液要新鮮配制，吹打時用力要勻，不要過猛， 以避免細(xì)胞破碎和染色體丟失。細(xì)胞懸液濃度要適宜，太高，染色體分散不好，太稀則不易找到好分裂相。.培養(yǎng)液在抽濾除菌時不要等全部培養(yǎng)液抽干，最后一點要棄之，這樣可防止空氣中的細(xì)菌進(jìn)入 已除菌的培養(yǎng)液中。.制片中如發(fā)現(xiàn)染色體分散不佳，可重復(fù)固定或延長固定時間。.滴片時如玻片冷卻不夠或有油污會影響細(xì)胞和染色體的

15、分散。另外，要使染色體分散良好， 還要注意細(xì)胞懸液的濃度和滴片的技巧等。.培養(yǎng)液中小牛血清的質(zhì)量和比例也是影響細(xì)胞培養(yǎng)成敗的重要因素。.培養(yǎng)失敗的常見原因有：培養(yǎng)瓶等器材未清洗干凈；培養(yǎng)用水不合格；pH值過高或過低;細(xì)菌污染； PHA質(zhì)量有問題；供血者細(xì)胞免疫水平低下；血清質(zhì)量不佳等?！咀鳂I(yè)與思考】.固定液的作用是什么？在使用固定液時應(yīng)注意什么？.低滲液起到什么作用，在使用過程中應(yīng)注意什么問題？實驗二 人類某些遺傳性狀（疾病）的調(diào)查分析人類單基因遺傳的性狀或疾病在上下代之間的傳遞遵循孟德爾定律，如ABO血型、苯硫月尿嘗味能力、眼瞼的單與雙、耳垂的有或無，能卷舌和不能卷舌及額前發(fā)際的形狀等均屬于

16、單基因控制的性狀，在一 個大的群體中，通過調(diào)查分析這些性狀，可以對該群體的某一基因頻率及基因型頻率做出估計。一、苯硫月尿嘗味試驗苯硫月尿（phenylthiocarbamide , PTC）是一種白色結(jié)晶狀藥物，由于其含有N-C = S基團(tuán)而有苦澀味，但對人無毒副作用。不同種族、民族和個體之間，對該物質(zhì)的嘗味能力不同，人體對苯硫月尿的嘗味能力是由一對等位基因（Tt ）所控制的性狀，T對t為不完全顯性。正常嘗味者能嘗出濃度小于1/750 000PTC溶液的苦味，為純合嘗味者，基因型為 TT;而T t基因型的個體（雜合子）嘗味能力稍低，只能嘗出濃度為1/40 0001/500 000的PTC溶液的

17、苦澀味，這種個體為PTC雜合嘗味者。 當(dāng)PTC濃度大于1/24000才能嘗出其苦味的人，稱為PTC味盲，基因型為t t ;有的味盲個體甚至對 PTC結(jié)晶也嘗不出苦味來。因此，人類對 PTC嘗味能力屬于不完全顯性遺傳（半顯性遺傳）。而且已知純合體味盲（ tt ）者容易患結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，因此可以把PTC的嘗味能力，作為一種輔助性診斷指標(biāo)。我國漢族人群中，PTC味盲約占10%。（一）器材和試劑.器材試管、試管架、滴管。.試劑 PTC溶液的配制：取 PTC粉末0.65g ,加蒸儲水 500ml搖勻，在室溫下放置12天即完全溶解成原液。原液的PTC濃度約為1/750 o PTC嘗味使用液配制：將PTC原

18、液編為1號液，將1號液用蒸儲水稀釋 1倍編為2號液，將2號液再稀釋一倍為3號液以此類推，直至配成14號PTC溶液，14號液濃度為 1/6 000 000 ,將配好的 14種不同濃度 PTC溶液分別置于消毒好的瓶內(nèi)。（二）操作程序.讓受試者坐在椅子上，仰頭張嘴。首先用滴管滴510滴14號液于舌根部，讓受試者徐徐下咽品味，并用蒸儲水作對照試驗。.詢問受試者能否鑒別此兩種溶液的味道，若不能鑒別或不能斷定，則依次用13號、12號 溶液重復(fù)試驗（應(yīng)注意與蒸儲水交替測試），直到明確鑒別出PTC的苦味為止。. tt基因型的閾值范圍為16號液，Tt基因型的閾值范圍為710號液，TT基因型的閾值范圍為1114號

19、液。為簡化操作程序，也可只用6、7、10、11和13號5種溶液進(jìn)行測試，嘗不出 6號苦味者為tt基因型，嘗出 7號和10號液的苦味者為Tt基因型，嘗出 11號者為TT基因型。.統(tǒng)計所測人員的測試結(jié)果，按 Hardy-Weinberg定律計算出所測人群中的PTC嘗味基因的基因型頻率和基因頻率。（三）注意事項PTC嘗味試驗所用滴管在滴液體時，注意不要接觸受試者的口腔。二、人類ABO血型檢測方法A Bi ）控制。人類的紅細(xì)胞表面有A和B兩種抗原，血清中有抗B （ B ）和抗 A （a）兩種天然抗體，依抗原和抗體存在的情況，可將人類的血型分為A、B、AB和O四種血型。由于A抗原只能和抗 A結(jié)合，B抗原

20、只能和抗B結(jié)合，因此可以利用已知的A型標(biāo)準(zhǔn)血清（即A型人的血清，又叫抗B血清）和 B型標(biāo)準(zhǔn)血清（即 B型人的血清，又叫抗A血清）來鑒定未知血型，兩種標(biāo)準(zhǔn)血清內(nèi)所含每一種抗體將凝集含有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞。因此一種血液其紅細(xì)胞在A型標(biāo)準(zhǔn)血清中發(fā)生凝集者為 B型，在B型標(biāo)準(zhǔn)血清中凝集者為A型，在兩種標(biāo)準(zhǔn)血清中都凝集者為AB型，在兩種標(biāo)準(zhǔn)血清中都不凝集者為O型。（一）器材和試劑.器材顯微鏡、雙凹玻片或普通載玻片、采血針、青霉素小瓶、膠布、記號筆、牙簽或小玻棒、棉球、小鏡子。.試劑 A 型（抗B）和B型（抗 A）標(biāo)準(zhǔn)血清、70%酒精、0.9%生理鹽水。（二）操作程序一般實驗室常用的方法有試管法與玻片法。試

21、管法的優(yōu)點是敏感，較少發(fā)生假凝集；玻片法則簡便 易行，但玻片法如控制不好，易發(fā)生不規(guī)則的凝集現(xiàn)象。本實驗用玻片法。.取一清潔的雙凹玻片（或用普通載玻片用玻璃蠟筆劃出方格代替），兩端上角分別用記號筆或膠布注明A和B及受試者姓名，然后分別用吸管吸取A和B型標(biāo)準(zhǔn)血清各一滴，滴入相應(yīng)凹格（或方格）內(nèi)。.用70%酒精棉球消毒受試者的耳垂或指端，待酒精干后， 用無菌的采血針刺破皮膚，用吸管取12滴血放入盛有 0.30.5ml生理鹽水的青霉素小瓶中，用吸管輕輕吹打成約5%的紅細(xì)胞生理鹽水懸液。.在玻片的每一凹格（或方格）內(nèi)分別滴一滴制好的紅細(xì)胞懸液（注意滴管不要觸及標(biāo)準(zhǔn)血清） 然后立即用牙簽或小玻棒分別攪拌

22、液體，使血球和標(biāo)準(zhǔn)血清充分混勻。.在室溫下每隔數(shù)分鐘輕輕晃動玻片幾次，以加速凝集，等1030min后觀察有無凝集現(xiàn)象。若混勻的血清由混濁變?yōu)橥该?，出現(xiàn)大小不等的紅色顆粒，表示紅細(xì)胞已凝集。若仍呈混濁狀，無顆粒出 現(xiàn)，則表明無凝集現(xiàn)象；若觀察不清可用顯微鏡在低倍鏡下觀察；若室溫過高，可將玻片放于加有濕棉 花的培養(yǎng)皿中，以防干涸；室溫過低可將玻片置于37 c恒溫箱中，以促其凝集。.根據(jù) ABO血型檢查結(jié)果，判斷自己及受檢者的血型。（三）注意事項標(biāo)準(zhǔn)血清必須有效；紅細(xì)胞懸液不宜過濃或過??；反應(yīng)時間及溫度要適中，應(yīng)注意辨別假陰性和假 陽性。三、卷舌性狀的調(diào)查在人群中有的人能夠卷舌（tongue rol

23、ling ）,即舌的兩側(cè)能在口腔中向上卷成梢形，甚至卷成筒狀，稱為卷舌者（tongue roller ）,受顯性基因（T）控制，有的人則不能卷舌，見圖 18 1。觀察受檢 者或?qū)︾R觀察自己是否具有卷舌能力，弁對自己的家族進(jìn)行調(diào)查，繪制系譜圖， 確定該性狀的遺傳方式。圖18 1卷舌（左）與非卷舌（右）四、眼瞼性狀的調(diào)查人群中的眼瞼（eyelid ）可分為單重瞼（俗稱單眼皮，又叫上瞼贅皮）和雙重瞼（俗稱雙眼皮）兩種 性狀。一些人認(rèn)為雙眼皮受顯性基因控制，為顯性性狀；單眼皮為隱性性狀。關(guān)于這類性狀的性質(zhì)和遺傳 方式，目前尚有爭論，還有待進(jìn)一步研究。調(diào)查一下自己家族中有關(guān)成員的眼瞼情況，弁繪制成系譜圖

24、， 分析其遺傳方式。五、耳垂性狀的調(diào)查人群中依個體不同，耳朵可明顯區(qū)分為有耳垂（ free ear lobe ）與無耳垂（attached ear lobe ）兩種情況, 見圖18- 2。該性狀是受一對等位基因所控制的，有耳垂為顯性性狀，無耳垂為隱性性狀。調(diào)查你的家庭各成員的耳垂性狀，是否符合孟德爾式遺傳，調(diào)查受檢人群中無耳垂出現(xiàn)頻率。圖18-2 有耳垂（左）與無耳垂（右）六、額前發(fā)際的調(diào)查在人群中，有些人前額發(fā)際（hair line of the forehead）基本上屬于平線，有些人在前額正中發(fā)際向下延伸呈峰形，即明顯地向前突出，形成V字形發(fā)尖稱寡婦尖（ widow s peak ），見

25、圖18- 3這種特征屬顯性遺傳。調(diào)查受檢人群中有哪些人前額發(fā)際呈峰形，記為“V”，平線者記為 o圖18-3前額V形發(fā)尖七、發(fā)式和發(fā)旋的調(diào)查人類的發(fā)式有卷發(fā)和直發(fā)之分。東方人多為直發(fā)，為隱性性狀，卷發(fā)則為顯性性狀；每個人頭頂稍后方的中線處都有一個螺紋（有的人不止一個），其螺紋方向受遺傳因素控制，順時針方向者為顯性性狀，逆時針方向者為隱性性狀。調(diào)查家族中有關(guān)成員的發(fā)式和發(fā)旋性狀，是否符合孟德爾式遺傳。調(diào)查 統(tǒng)計受檢人群中不同個體發(fā)式和發(fā)旋情況。八、拇指端關(guān)節(jié)外展的調(diào)節(jié)在人群中有的人拇指的最后一節(jié)能彎向梯側(cè)與拇指垂直軸線呈60度角（圖18-4）。該性狀呈隱性遺傳，即該性狀的純合隱性個體的拇指端可向后

26、彎曲60。調(diào)查受檢人群中哪些人有此性狀，統(tǒng)計該性狀出現(xiàn)的頻率。圖18-4拇指端關(guān)節(jié)超伸展九、達(dá)爾文結(jié)節(jié)的調(diào)查耳輪邊緣上的一個小突起稱為達(dá)爾文結(jié)節(jié)( Darwinian point )或稱為達(dá)爾文耳點(Darwin s ear point )。人群中有的人兩個耳朵上都有此結(jié)節(jié)，有的個體僅一個耳朵有，也有的人無此性狀。一般認(rèn)為 該性狀為顯性遺傳性狀。有的人雖具有這個顯性基因，但是由于該性狀外顯率低，因此呈現(xiàn)出類似于隱 性性狀的遺傳。調(diào)查受檢人群中該結(jié)節(jié)出現(xiàn)的頻率。實驗三人類性染色質(zhì)標(biāo)本制備技術(shù)性染色質(zhì)有 X染色質(zhì)(X chromatin )和Y染色質(zhì)兩種類型。X染色質(zhì)又稱 X小體或Barr小體，是

27、女性細(xì)胞分裂間期核內(nèi)的一種特有染色質(zhì)。X染色質(zhì)位于核膜邊緣，一般呈三角形、 半圓形或扁平形等，為異固縮小體。正常女性間期核X染色質(zhì)出現(xiàn)率為10%59%,數(shù)目為 X染色體的數(shù)目減1。X染色質(zhì)可被多種染料顯示，是快速鑒定性別的一種簡單方法，同時，也是確定性發(fā)育異?；颊遆染色體數(shù)目的一種簡單方法。Y染色質(zhì)又稱 Y小體或F小體，是男性細(xì)胞間期核內(nèi)的一種特有染色質(zhì)，用嘍口丫因類染料染色，可在熒光顯微鏡下被發(fā)現(xiàn)。Y染色質(zhì)的數(shù)目和大小分別與Y染色體的數(shù)目和Y染色體長臂末端能被熒光染料著色的異染色質(zhì)的大小相一致，因此，Y染色質(zhì)檢查可進(jìn)行性別鑒定和性發(fā)育異常診斷?！緦嶒?zāi)康摹空莆砧b定人類 X染色質(zhì)的方法，熟悉鑒

28、定人類 Y染色質(zhì)的方法，在顯微鏡下正確識別X染色質(zhì)的特征及其所在位置。【實驗器材和試劑】.器材 顯微鏡、熒光顯微鏡、牙簽、鐐子、載玻片和蓋玻片。.試劑 甲醇、冰醋酸、乙醇、硫堇、碳酸氫鈉、醋酸鈉、鹽酸、甲苯胺蘭、地依紅、猩紅、磷 鴇酸、快綠、磷鋁酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、鹽酸阿的平和芥子嘍口丫因等。【實驗內(nèi)容與方法】一、X染色質(zhì)標(biāo)本制備與觀察(一)口腔粘膜細(xì)胞標(biāo)本制備用干凈牙簽輕輕刮取被檢者口腔粘膜細(xì)胞，均勻地涂布于干凈的載玻片上，將標(biāo)本浸入3 ： 1的甲醇-冰醋酸固定液中固定30min ,晾干備用，選用下面12種染色方法制備X染色質(zhì)標(biāo)本。(二)X染色質(zhì)標(biāo)本制備.硫堇染色法(1)試劑配制：硫堇原

29、液：1g硫堇溶于 100ml 50 %乙醇中； Michaelis 緩沖液：醋酸鈉 9.7g、碳酸氫鈉 14.7g、溶于 500ml蒸儲水中；硫堇工作液：取 28ml緩沖液和 32ml 0.1mol/L HCl- 硫堇原 液加至 100ml , pH應(yīng) 5.8 。為(2)將固定好的標(biāo)本浸入5mol/L HCl中水解 30min ,流水沖洗；硫堇染液染色 30min ,流水沖洗。(3) 50 %乙醇漂洗，70 %乙醇分色 1min; 95%乙醇漂洗。(4)風(fēng)干，鏡檢：低倍鏡下，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，染成紫藍(lán)色。油鏡觀察，X染色質(zhì)緊貼核膜邊緣，與核膜相連，呈圓形、卵圓形或三角形，大小約11.5 m

30、,著色深(圖2- 1)。由于細(xì)胞核呈立體狀態(tài)，觀察的方位不對時即看不見，故實際上正常女性X染色質(zhì)檢出率為10%20%,男性則低于1%。圖3-1 X-染色質(zhì).甲苯胺蘭染色將固定好的標(biāo)本放入5mol/L HCl 中10min ,流水沖洗。0.2 %甲苯胺蘭染液染色12min。自來水沖洗，風(fēng)干，鏡檢。.地依紅染色法1g地依紅溶于 45ml醋酸中，加熱至剛到沸點20min。然后冷卻，過濾。用時以蒸儲水稀釋一倍，過濾。 滴一滴地依紅染液于固定好的標(biāo)本上，覆以蓋片，用吸水紙吸去多余水分，直接在顯微鏡下觀察。.猩紅-快綠染色法（1）試劑的配制：猩紅染液：猩紅1g、磷鴇酸0.3g、冰醋酸5ml ,加50 %乙

31、醇至100ml；快綠染液：快綠0.5g、磷鋁酸0.3g、冰醋酸5ml,加50 %乙醇至100ml。（2）將固定好的標(biāo)本在95%乙醇、70%乙醇中各2min；在猩紅染液中染色2min ,用50%乙醇漂洗1次。（3）在快綠染液中染色2min,50%乙醇漂洗 5min ; 70%、80%、95 %和100%乙醇脫水各2min。（4）風(fēng)干，鏡檢。（三）注意事項細(xì)胞涂片要均勻（不要來回涂），細(xì)胞不能太少。計數(shù)核膜完整的細(xì)胞，核膜邊緣不清的細(xì)胞不計數(shù)，否則會降低 X染色質(zhì)出現(xiàn)率。每種檢查方法，每次染色均須有正常女性X染色質(zhì)做對照。方法 12中,鹽酸處理一步較為重要，應(yīng)掌握好時間和溫度。在不同類型的細(xì)胞中其

32、正常值略有差異。二、Y染色質(zhì)制備與觀察（一）標(biāo)本制備1. McIlvaine 緩沖液配制原液 A（0.1mol/L檸檬酸溶液）：取檸檬酸（C6H8。7 . H2O） 21.0g溶于1000 ml蒸儲水中；原液 B（0.2mol/L磷酸氫二鈉）：取磷酸氫二鈉（Na 2HPO4 . 2H2O） 36. 5g溶于1 000ml蒸儲水中；工作液：取A液73.3ml , B液126.7ml 混合即得 pH6.0工作液。.熒光染料配制5%鹽酸阿的平熒光染液（鹽酸阿的平 0.5g , McIlvaine 緩沖液10ml,配制之后存入棕色瓶中，置于4c冰箱中保存?zhèn)溆茫?0仙g/ml芥子唾口丫因熒光染液（芥子

33、唾口丫因5mg ,McIlvaine 緩沖液100ml ,保存方法同上）.用牙簽刮取被檢者口腔粘膜細(xì)胞，均勻地涂布于干凈的載玻片上。其它培養(yǎng)和未培養(yǎng)的細(xì)胞, 均可制成懸液涂布或滴在載玻片上。.將玻片標(biāo)本浸入3 ： 1的甲醇-冰醋酸固定液中，固定 2030min ,空氣干燥或吹干。.用pH6.0的Mcllvaine 緩沖液配制的5%鹽酸阿的平 （或用50 H g/ml芥子嘍口丫因）染液染色1530min ,流水沖洗 1min。.用pH6.0的Mcllvaine緩沖液浸泡標(biāo)本2min ,在標(biāo)本上滴加同一緩沖液少許，覆蓋潔凈蓋片。.用濾紙吸取多余染液，用指甲油或石蠟油（或市售膠水）封蓋玻片周圍，以防

34、緩沖液蒸發(fā)。.片子制好后靜置半小時左右，然后在熒光顯微鏡下觀察。低倍鏡觀察，可見細(xì)胞核被染成黃色。用油鏡觀察，Y染色質(zhì)小而亮，呈黃色，直徑約在0.250.30 pm?？稍诩?xì)胞核邊緣，也可在核中間，有的呈單點結(jié)構(gòu)，有的呈雙點結(jié)構(gòu)（圖2-2）o圖3-2 Y- 染色質(zhì)（彩圖）每份標(biāo)本計數(shù) 300個細(xì)胞，正常男性Y染色質(zhì)出現(xiàn)率在10%以上，絕大多數(shù)在25%50%之間,有些可高達(dá) 75%;正常女性 Y染色質(zhì)出現(xiàn)率在 5%以下，甚至為零。（二）注意事項染液需用 pH6.0的McIlvaine緩沖液配制，使其pH值恒定，Y染色質(zhì)出現(xiàn)率高。需有一臺高質(zhì)量的熒光顯微鏡，光源最好是落射式的，且應(yīng)在光線較暗的環(huán)境下

35、觀察標(biāo)本。標(biāo)本要透明，不能太厚，特 別是口腔粘膜涂片。應(yīng)盡可能減少雜質(zhì)，因此，每個受檢者需仔細(xì)漱口后再接受檢查。觀察時，需反復(fù) 轉(zhuǎn)動顯微鏡的微調(diào)螺旋，因為Y染色質(zhì)和細(xì)胞核在同一平面，而細(xì)菌和雜質(zhì)與細(xì)胞核不在同一平面。每次檢測需有正常男性Y染色質(zhì)做對照?！咀鳂I(yè)與思考】.繪制所看到的X染色質(zhì)圖象。.在油鏡下分析50個女性口腔上皮細(xì)胞，計數(shù) X染色質(zhì)的出現(xiàn)率。.將男女生的制片混合，隨機取一張，辨別是男生還是女生的。實驗四人類染色體顯帶與染色體高分辨顯帶技術(shù)7 種，即 1、2、3、16、17、在人類的24種染色體中，用非顯帶的分組方法能明確予以辨認(rèn)的只有18號和Y染色體，而對所有染色體在長短臂中發(fā)生的

36、各種微小結(jié)構(gòu)改變則不能識別，因此限制了對許多染色體異常的觀察和研究。20世紀(jì)70年代以來出現(xiàn)了染色體顯帶技術(shù)，即染色體經(jīng)過一定程序處理弁用特定染料染色后，在普通光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下，在染色體長軸上可顯出不同深淺的條紋或不同強度的熒光節(jié)段，這樣的節(jié)段叫染色體帶（band）;不同對的染色體具有不同的帶的形態(tài)，稱為帶型這種顯示染色體帶的過程稱為染色體顯帶（chromosome banding ）。染色體顯帶技術(shù)不僅使我們能準(zhǔn)確地識別非顯帶染色體技術(shù)所不易認(rèn)清的一些染色體，而且對某些染色體畸變或染色體的微小結(jié)構(gòu)改變的確認(rèn)也有重要作用，為染色體病的診斷提供了更有效的方法。利用常規(guī)的顯帶技術(shù)，在人類一

37、個中期細(xì)胞的染色體組上可看到大約320條帶。1971年在巴黎召開的國際會議上規(guī)定了正常人體細(xì)胞的帶型模式圖。高分辨顯帶技術(shù)使對染色體的分析達(dá)到了亞帶（subband ）的水平，ISCN （ 1978 ）中已命名的帶如再分，則用原編號碼加上一個小數(shù)點后的第一位數(shù)字表示，例如3q25再分為三個亞帶，則分別表示3q25.1、3q25.2、3q25.3 。如果某一亞帶再分，則用小數(shù)點后的第二位數(shù)字表示。例如3q25.3 再分為三個亞帶時，則分別表示為3q25.31、 3q25.32 、 3q25.33 ?！緦嶒?zāi)康摹砍醪秸莆杖祟惾旧wG帶標(biāo)本和高分G帶標(biāo)本的制備技術(shù)，熟悉人類染色體的G帶和高分G帶辨辨

38、的帶型特征，了解人類染色體Q、R、C、T、NOR帶標(biāo)本的制備技術(shù)和帶型特征?！緦嶒炂鞑暮驮噭?1 .器材帶有照相裝置的光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、水浴箱、電熱干燥箱、恒溫水浴箱、普通冰箱、20W紫外線燈、鋁飯盒、培養(yǎng)瓶、滴管、橡皮帽、離心管、注射器、染色缸、鏡子、溫度計、立式染缸、載片架、搪瓷缸、酒精燈、擦鏡紙、香柏油、二甲苯、載玻片、蓋玻 片、pH試紙等。2.材料常規(guī)方法制備的中期人類染色體標(biāo)本（標(biāo)本片齡不超過30天為宜）。3.試劑胰蛋白酶溶液、0.02 % EDTA溶液、胰蛋白酶 -EDTA混合液、0.85 %生理鹽水、蒸儲水、磷酸緩沖液， RPMI-1640 培養(yǎng)液

39、、小牛血清、PHA、TDR、3% NaHCO 3溶液、BrdU、秋水仙素、 0.075mol/L KCl低滲液、甲醇、冰醋酸、MTX、放射菌素D、肝素抗凝劑、ICN溶液、GKN溶液、3% Tris溶液、McIlvaine緩沖液、0.005 %氮芥唾口丫因 （QM）或0.5 %二鹽酸唾口丫因（QH）熒光染液、 Giemsa原液、Hoechst 33258 原液、口丫咤橙（acridine orange ）、胸腺口密咤核甘、BrdU、Hank s液、歐氏液、 AgNO 3、甲酸等?！緦嶒瀮?nèi)容與方法】一、人類染色體G顯帶標(biāo)本制備20世紀(jì)70年代以來，顯帶技術(shù)得到了很大的發(fā)展，且在眾多的顯帶（Q帶、G

40、帶、C帶、R帶 T和帶）中， G帶是目前被廣泛應(yīng)用的一種帶型。G帶染色技術(shù)也稱改良的姬姆薩（ Giemsa ）染色法，因用姬姆薩染色，所以稱 G帶。G帶法產(chǎn)生的帶紋與Q帶法一致，但比Q帶法分辨力更好、更精細(xì)，而且分辨力和穩(wěn)定性都優(yōu)于Q帶。研究發(fā)現(xiàn)，人類染色體標(biāo)本在用姬姆薩染色之前，對標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，如用熱堿、胰蛋白酶、尿素、5-澳脫氧尿嚅咤等處理，從染色體抽取蛋白質(zhì)的特定成分，可獲得良好而一致的分帶類型。帶的形成與姬姆薩染料的組成及染色性質(zhì)有關(guān)，姬姆薩染料由不同的嚷嗪染料混合物和曙紅組成，染色首先取決于兩個嚷嗪分子同DNA的結(jié)合，在此基礎(chǔ)上它們結(jié)合一個曙紅分子形成2 ： 1嚷嗪-曙紅沉淀物，其

41、次，取決于一個有助于染色沉淀物積累的疏水環(huán)境。具有高濃度疏水性蛋白質(zhì)的染色體區(qū)是含高比例二硫鍵的區(qū)域，有利于曝嗪-曙紅沉淀物的形成。通過一系列顯帶處理可使陰性G帶區(qū)的疏水性蛋白質(zhì)除去，從而造成了染色體蛋白的差異，這種差異就是明暗相間的染色體G帶4- 1）。 （圖圖4 1人類染色體G帶核型G顯帶技術(shù)具有設(shè)備要求低（不需要熒光顯微鏡）、試劑便宜、標(biāo)本容易保存及觀察方便等優(yōu)點。目前G顯帶方法已發(fā)展為多種，其中較常用的是烤片-胰酶法。 隨著染色體研究工作的不斷深入，染色體 G顯帶技術(shù)為遺傳病的診斷、染色體結(jié)構(gòu)研究和基因定位等工作的深入提供了極大的方便。（一）胰蛋白酶法I.將常規(guī)制備的未染色的人類染色體

42、標(biāo)本置70c烤箱處理 2小時，然后轉(zhuǎn)入37c培養(yǎng)箱中備用，一般在37天進(jìn)行顯帶。.稱取1g胰蛋白酶溶于 40ml無菌生理鹽水中，制成 2. 5 %的胰蛋白酶原液并保存于冰箱的冷凍 室。使用時取原液2.5ml加生理鹽水至 50ml,配成0.125 %的工作液，并用 5% NaHCO 3調(diào)pH值至7.0左右。.將配好的胰蛋白酶工作液放入37 C水浴箱中預(yù)熱。.將染色體玻片標(biāo)本浸入預(yù)熱的0. 125 %胰蛋白酶液中，不斷擺動使蛋白酶的作用均勻，處理12min （精確的時間自行摸索）。立即取出玻片，放入生理鹽水漂洗兩次。.將標(biāo)本浸入37 c預(yù)溫的 Giemsa染液（1 ： 10的Giemsa原液和pH

43、為6.8磷酸緩沖液）中染色 10min 左右。自來水沖洗（用細(xì)水流小心沖洗）、涼干。.在低倍鏡下選擇分散良好的長度適中的分裂相，轉(zhuǎn)換油鏡觀察。（二）胰蛋白酶法n.染色體標(biāo)本于室溫下放置12周；將上述標(biāo)本置66 c烤箱中烤片2小時后降至室溫。.將2.5 %胰蛋白酶用 pH7.0的生理鹽水（預(yù)溫 37 C）配成0.025 %胰蛋白酶液，將染色體標(biāo)本在 此液中消化約 12min。pH6.8磷酸緩沖液沖洗。.常規(guī) Giemsa染色10min得G顯帶染色體標(biāo)本，鏡檢。（三）胰蛋白酶法出.染色體標(biāo)本預(yù)處理同上法，也可不經(jīng)66c70 c烤片。.將染色體標(biāo)本置入4c下的0.125 %胰蛋白酶溶液中處理12mi

44、n。處理結(jié)束后， 立即用冷的 PBS沖洗，終止酶的作用。. Giemsa原液與磷酸緩沖液（pH7.4 ）按1 ： 19配成染色液，染色 510min ,細(xì)水流沖洗涼干，鏡檢。（四）EDTA-胰蛋白酶法1.染色體標(biāo)本預(yù)處理同上法。取25ml生理鹽水和 25ml 0.02 %的EDTA溶液倒入立式染色缸中混勻.取2.5 %的胰蛋白酶原液1ml加入到上液中混勻，并用 5% NaHCO3 pH值至7.0左右，置水浴調(diào)箱預(yù)溫至 37 C o.將染色體標(biāo)本片浸入胰蛋白酶-EDTA混合液中處理520s,同時輕輕擺動載玻片。取出標(biāo)本立即浸入生理鹽水中沖洗兩次。.浸入37 c的Giemsa染液中染色510min

45、。細(xì)水沖洗后晾干，鏡檢。（五）G帶標(biāo)本制備注意事項.制作G顯帶標(biāo)本時，要求染色體有足夠的長度，染色體分散良好，弁且染色單體互不分離，所 以在培養(yǎng)、制片過程中，常應(yīng)采取一些相應(yīng)的措施，如縮短或增加胰蛋白酶作用時間、降低秋水仙素濃 度或縮短秋水仙素作用的時間，使染色體標(biāo)本能達(dá)到制帶的要求。.標(biāo)本烤片及消化時間與溫度應(yīng)嚴(yán)格控制，溫度過高、時間過長可致染色體變性，溫度過低、時 間過短則很難得到滿意的分帶效果。.若染色體未出現(xiàn)帶紋，則為顯帶不足，若染色體邊緣發(fā)毛為顯帶過頭，此時應(yīng)根據(jù)具體情況增 減胰蛋白酶處理時間，重新處理一張標(biāo)本。. Giemsa染液需現(xiàn)用現(xiàn)配，以防沉淀影響染色效果。染色時間不能過長，

46、否則帶紋之間不清晰。 二、人類染色體高分辨顯帶技術(shù)Yunis、Bigger、Seabright 等人采用細(xì)胞同步化等特殊技術(shù)，獲得了大量優(yōu)質(zhì)的有絲分裂早期顯 帶核型，使人類的單套染色體的帶紋數(shù)量增至400、550、850、1 000甚至3 000條以上，從而使人類的各條染色體在光鏡下能展現(xiàn)出更明顯的特征，這種技術(shù)稱為高分辨顯帶（high resolution bandingHRB） o其原理在于氨甲喋吟阻止DNA合成，阻滯細(xì)胞于 Gi/S。此時若以少量胸腺喀咤核甘加入培養(yǎng)基中可解除對細(xì)胞的阻滯，細(xì)胞同時開始DNA合成。在有絲分裂達(dá)高峰時，用低濃度秋水仙素作短時處理，即可見到細(xì)長的、收縮極少的晚

47、前期、前中期和早中期的染色體。高分辨染色體分帶（圖4- 2）的優(yōu)點是染色體長，帶型多，大大提高了識別染色體的細(xì)微結(jié)構(gòu)改變的能力，這就有可能察知一些染色體的細(xì) 微缺陷，如染色體易位、缺失和重排的精確位置等，提高對各種遺傳性疾病如某些腫瘤的檢出頻率。圖4- 2 人類染色體高分辨顯帶（一）過量 TDR同步化法.試劑配制 TDR液：稱取 TDR 150mg溶于10ml 0.85 % NaCl中，濃度即成 15mg/ml ;稀釋10 倍即成1.5mg/ ml,避光保存； BrdU液：稱取BrdU 0.5mg 溶于10ml 0.85 % NaCl中，即成 50 g/ml 的BrdU溶液，避光保存； 放線菌

48、素 D液：稱取放線菌素 D粉末10mg溶于50ml 0.85 % NaCl中，即成200 p g/ml 的溶液， 避光保存； ICN 溶液：NaCl 10.80g、KCl 10.20g、Na 2HPO 4 - 12H2Q 0.03mg、KH2PO4 0.02g ,力口水至 100ml; GKN 溶液：葡萄糖 0.10g、KCl 0.04g、NaCl 10.80g、NaHCO 30.035g ,力口水至100ml ;培養(yǎng)液的準(zhǔn)備：按無菌操作取RPMI-1640培養(yǎng)液4ml、小牛血清1ml、青霉素與鏈霉素（均為 5000U/ml ）各 0.1ml、PHA 0.2ml 混合，用 3.5 %NaHCO

49、.3 調(diào) pH 至 7.0 7.4。.采血培養(yǎng)碘酒和酒精消毒皮膚，用肝素濕潤的無菌注射器，抽取靜脈血1ml ,立即接種于上述培養(yǎng)瓶內(nèi)（每瓶約加0.30.5ml ）輕輕搖勻后置37 c培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 56小時，每天取出輕輕搖勻兩次。.加入過量TDR 培養(yǎng)56小時后，加入TDR （使終濃度為0.3mg/ml ）,再置37c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15,17小時。.洗滌弁加BrdU 按無菌操作將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管，用37 c預(yù)溫的無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞二次，在第二次洗滌離心后，向細(xì)胞沉淀中加含20 %小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（pH7.27.4 ） 5ml ,再加入BrdU （終濃度為10 H g/ml ）

50、,置37 c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)57小時，然后加適量秋水仙素（終濃度為0.1mg/ml ）,作用15min。以上步驟均應(yīng)無菌操作。.收獲制片常規(guī)方法制備染色體標(biāo)本一張，待干后置顯微鏡下觀察染色體鋪展情況。若分散不理想，可采用以下措施：一是加入固定液混勻置4 c冰箱過夜或增加放置時間；二是增加滴片高度；三是增加固定次數(shù)或提高固定液中冰醋酸的比例。當(dāng)染色體分散程度符合要求后常規(guī)制片。.染色 取 0.1mol/L Na 2HPO4 5ml、0.1mol/L NaH2PO4 5ml 混合加 Giemsa 原液 5ml、蒸儲水 90ml, 混勻配成5% Giemsa染液倒入立式染色缸內(nèi)；將標(biāo)本放入染色缸內(nèi)染色1

51、0min左右。取出標(biāo)本，自來水沖洗，晾干后備用。.高分辨G顯帶選片：上述的染色體標(biāo)本在室溫下保存67天（老化）。在光鏡下選出分裂相多、染色體鋪展良好、很少或沒有重疊而且形態(tài)特征清晰的玻片標(biāo)本；褪色：顯帶前一天，將選出 標(biāo)本用Carnoy固定液脫色510min ,勿經(jīng)水洗，晾干平置在托板上；烤片：置60。恒溫烤箱中烤片1624小時，通常過夜即可；消化：將烘烤過的標(biāo)本置37c的0.02 %胰蛋白酶ICN溶液中消化 13min ；精確的消化時間每例均應(yīng)測試后決定，消化時間確定后，即可成批進(jìn)行G顯帶處理；漂洗：消化后，立即取出標(biāo)本，在 37 c的GKN溶液中漂洗 15s,甩去玻片上多余液體；染色：用4

52、%的Giemsa（磷酸鹽緩沖液配制）染液染色1520min ；沖洗：經(jīng)自來水、蒸儲水依次沖洗，晾干。鏡檢。（二）氨甲喋吟同步化法.向上述已培養(yǎng) 56小時的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入氨甲喋吟（MTX）使終濃度為107mol/L0.0455g/ml。置37 c恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)1517小時。.移培養(yǎng)物于離心管，1 500r/min 離心5min ,棄上清液，加入預(yù)溫的RPMI-1640液5ml,洗滌兩次。離心去上清液后，移入裝有5ml 37 C預(yù)溫的含20%小牛血清 RPMI-1640培養(yǎng)液的瓶中。5.加入TDR,使其終濃度為10 mol/L （ 2.42 g/ml ）,混勻置 37c培養(yǎng)箱培養(yǎng) 5 小時

53、，加入秋水仙素，使其終濃度為0.1 it g/ml ,處理15min ,以上步驟均需無菌操作。.細(xì)胞的收獲、染色體標(biāo)本的制備和染色等步驟同前法。三、人類染色體 C顯帶標(biāo)本制備用強堿溶液加熱處理染色體標(biāo)本使其DNA變性后，再以溫?zé)岬柠}溶液處理使其復(fù)性時，由高度重復(fù)DNA順序組成的著絲粒（ centromere ）、部分次縊痕 （secondary constriction）和異染色質(zhì)區(qū)域的DNA復(fù)性速度要明顯快于其它區(qū)段，因而易被Giemsa深染，在染色體上呈現(xiàn)出特有的著絲粒和副縊痕濃染區(qū)，這就是所謂的 C帶（C-bands ）,也稱為著絲粒異染色質(zhì)帶（ centromere heterochr

54、omatin bands ）, 見圖4- 3。其它常染色質(zhì)部分僅可顯示出較淡的輪廓。本方法可用于人類不同種族和個體之間染色體多態(tài)性研究，鑒別染色體上不同的染色質(zhì)類型，也可應(yīng)用于基因定位、產(chǎn)前診斷，以及各種異常細(xì)胞雙著 絲粒染色體乃至多著絲粒染色體之來源等。圖4-3人類染色體C顯帶(一)染色體 C帶標(biāo)本的制備方法I1 . 0.2mol/L HCl溶液配制：吸取 1.7ml 12mol/L HCl. 2X SSC溶液配制：稱取氯化鈉17.54g、檸檬酸鈉.將常規(guī)法制備的人染色體白片標(biāo)本放入2mol/L HCl徐徐加入到98.3ml.82g 溶于 1 000ml溶液中，室溫下處理的蒸儲水中。蒸儲水中

55、。1530min ,以除去組蛋白和非酸性蛋白。自來水徹底沖洗后，再用蒸儲水沖洗。56。恒溫水浴箱內(nèi))處理 10min4 .將標(biāo)本浸入預(yù)溫至56 c的5% Ba(OH) 2溶液中(置于56 c的自來水沖洗，則.立即用自來水徹底沖洗，再用蒸儲水沖洗，以去除粉垢。如果用預(yù)熱到 可避免Ba(OH) 2遇冷沉淀到玻片上。.將標(biāo)本投入預(yù)溫至65 c的2X SSC溶液中溫育11.5小時。自來水沖洗后再用蒸儲水沖洗。.用預(yù)溫至 37c的Giemsa染液染色 1020min ,自來水沖洗，空氣干燥，鏡檢。(二)染色體 C帶標(biāo)本的制備方法n.將玻片標(biāo)本放入0.2mol/L HCI溶液中處理 1小時，自來水沖洗。浸

56、入 50 C 1 % Ba (OH) 2溶液中1520s ,取出后立即水洗。.浸入60c的2X SSC溶液中溫育 90min。自來水反復(fù)沖洗。.用Giemsa染液染色 15min ,水洗，晾干，鏡檢。(三)染色體 C帶標(biāo)本的制備方法加(1)將常規(guī)制備的新鮮染色體玻片標(biāo)本放入預(yù)溫至60 C的5 % Ba(OH) 2溶液中處理 5min。(2)蒸儲水沖洗后浸入60 c的2X SSC溶液中處理90min ,取出后用蒸儲水沖洗干凈。(3)用Giemsa染液染色10min ,水洗后自然干燥，鏡檢。(四)染色體 C帶標(biāo)本觀察將干燥的C帶染色體標(biāo)本(圖 15- 3)先置低倍鏡下觀察，找到染色體分散良好、染色

57、適中的典型 分裂相后轉(zhuǎn)換高倍鏡或油鏡下仔細(xì)觀察標(biāo)本。(五)染色體 C帶標(biāo)本的制備注意事項人染色體白片標(biāo)本片齡 15天為最適標(biāo)本。 5% Ba(OH) 2配制后放至 4c保存，用時吸取上清。配制 2X SSC時，先取NaCl 1.75g 溶于100ml雙蒸水中，待完全溶解后加入0.88g枸檬酸鈉。染色體標(biāo)本從Ba(OH)2溶液取出時，要求動作迅速，切忌BaCO 3薄膜形成敷貼在染色體標(biāo)本上，否則影響顯帶效果。四、人類染色體Q顯帶標(biāo)本制備Q顯帶是人類最先創(chuàng)立的染色體顯帶技術(shù)，它和以后出現(xiàn)的一系列顯帶技術(shù)大大地推動了細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展。 Q帶形成的機理是熒光染料嘍口丫因能特異性地結(jié)合到染色體上富含A-

58、T堿基對的節(jié)段中，在熒光顯微鏡中一定波長紫外光的激發(fā)下，富含A-T堿基對的染色體節(jié)段便會發(fā)出較強的熒光；而富含 G-C堿基對的染色體節(jié)段則無熒光產(chǎn)生(暗帶)，這樣，在染色體上便會呈現(xiàn)出明暗交替的橫紋，即Q帶。利用Q帶技術(shù)可使人類的23對染色體顯示出各自特異的帶紋，其帶紋數(shù)的多少、帶的寬窄和帶的亮度均不相同，可更準(zhǔn)確地識別人類的23對染色體。（一）人染色體Q帶標(biāo)本制備. Mcllvaine緩沖液配制原液 （A 0.1mol/L 檸檬酸溶液）：取檸檬酸（C 6H8O7 - H2O） 21.0g溶于1 000ml蒸儲水中；原液 B （ 0.2mol/L 磷酸氫二鈉）：取磷酸氫二鈉（Na2HPO4 -

59、 2H2O） 36.5g溶于1 000ml蒸儲水；工作液：取 A液330ml , B液70ml混合即得pH7.0工作液。.熒光染料配制0.005 %氮芥嘍口丫因（QM）熒光染液配制：氮芥嘍口丫因（ QM） 5mg加入pH7.0McIlvaine 緩沖液100ml ,配制之后存入棕色瓶中，置于4c冰箱中保存?zhèn)溆茫?0.5 %二鹽酸唾口丫因（QH ）熒光染液配制：二鹽酸嘍口丫因（ QH） 0.5g ,蒸儲水100ml ;用0.1mol/L 鹽酸調(diào) pH至4.5置棕色瓶中放 置一周后使用；或用檸檬酸緩沖液直接配制而不必再用鹽酸調(diào)pH值。.常規(guī)制備的染色體標(biāo)本片浸入McIlvaine緩沖液中 5min

60、。.用0.005 %氮芥嘍口丫因或二鹽酸嘍口丫因染色1520min。用McIlvaine 緩沖液洗去多余染料。.將經(jīng)熒光染料染色過的片子放置于McIlvaine緩沖液或蒸儲水中分色3次，每次 5min。最后一次分色后滴上 12滴McIlvaine 或蒸儲水。用干凈蓋玻片蓋上（注意不要有氣泡），然后用指甲油或石蠟油封蓋玻片周圍，以防水分蒸發(fā)。.將制好玻片放置于熒光顯微鏡下觀察，弁用顯微照相裝置拍下所需的中期染色體圖像以便作核 型分析。（二）人類染色體Q帶標(biāo)本的觀察在熒光顯微鏡下分析觀察Q帶標(biāo)本，可見 Q與G帶非常相似，區(qū)別僅在于著絲粒區(qū)和第1、16號染色體的次縊痕，這些區(qū)段在Q帶時一般沒有熒光，