微生物實驗室培養(yǎng)

1、關(guān)于微生物的實驗室培養(yǎng)課件第一張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一.培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)1.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無機(jī)鹽碳源無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物氮源無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4、NO3-（為硝化細(xì)菌提供N源和能源）牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含CHON的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源第二張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一.培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)1.基本成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽2.特殊營養(yǎng)：維生素、堿基等（生長因子）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含

2、有）3.pH、氧氣的需求：4.種類：固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無 凝固劑瓊脂分離 鑒定工業(yè) 生產(chǎn)化學(xué)成分：物理性質(zhì)：天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基第三張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O 定容至1000mlNacl 5g蛋白胨 10g牛肉膏 5g瓊脂20.0g分析營養(yǎng)構(gòu)成？第四張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 配制原則目的明確：營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)適宜的pH值：有機(jī)碳源異養(yǎng)型：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料自養(yǎng)型：不加碳源加入緩沖劑細(xì)菌偏堿，真菌偏酸（CO2碳源）生產(chǎn)科研

3、第五張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月耐高溫需保持干燥的 物品，160170 12小時接種環(huán)、接種針等 金屬用具7075、30min 80、15min100、56min消毒滅菌定義方法較為溫和理化方法，殺死部分有害菌體（不包括芽孢、孢子）強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑紫外線灼燒滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，100KPa、121、1530min二.無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染1.消毒與滅菌：第六張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1） 培養(yǎng)細(xì)菌

4、用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管（3） 實驗操作者的雙手思考第七張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2.無菌范圍：實驗操作空間消毒操作者的手、衣著消毒實驗用具滅菌實驗操作過程二.無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染1.消毒與滅菌：酒精燈旁操作超凈工作臺第八張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌孢子細(xì)菌、原生動物、

5、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個體。 第九張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月單個或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：菌落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體第十張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O 定容至1000mlNacl 5g蛋白胨 10g牛肉膏 5g瓊脂20.0g三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計算：培養(yǎng)基用量依配方計算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙 、少量水加

6、熱溶解取紙蛋白胨、NaCl瓊脂補(bǔ)水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿分散成單個細(xì)胞,形成單個菌落第十一張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月倒平板約50防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基第十二張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論 答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第十三張，PP

7、T共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。第十四張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基純化大腸桿菌：平板劃線法：菌種劃3個平板1個不劃線1.純化大腸桿菌的方法：平

8、板劃線法和稀釋涂布平板法接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實驗）（空白對照）第十五張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月平板劃線法 平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體。第十六張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月問題討論1、為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過

9、劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第十七張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。第十八張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1

10、031ml1041ml1051ml106稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液微量 移液器第十九張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月浸稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍第二十張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月稀釋涂布法 稀釋涂布法是將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。第二十一張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月問題討論 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步

11、應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如：酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、 吸管頭不要接觸任何其他物體、 吸管要在酒精燈火焰周圍等等。第二十二張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較第二十三張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月平板劃線法：二.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基純化大腸桿菌：1.接種：稀釋涂布平板法：2.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37恒溫箱中培養(yǎng)12h24h后，觀察并記錄稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍第二十四張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）菌種的保藏：1.臨時保藏：試管固體

12、斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)長成菌落4冰箱保存2.長期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油（滅菌）1ml菌液20擱置斜面第二十五張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、課題成果評價 （一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。 （三）是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。第二十六張，PPT共二十八頁，創(chuàng)作于202