藥代動力學實驗

1、藥代動力學實驗神農嘗百草 傳說神農一生下來就是個“水晶肚”，幾乎是全透明的，五臟六腑全都能看得見，還能看得見吃進去的東西。那時候，人們經常因亂吃東西而生病，甚至喪命。神農為此決心嘗遍百草，能吃的放在身體左邊的袋子里，介紹給別人吃；不好吃的就放在身體右邊袋子里，作藥用。不能吃的就提醒人們注意。生物樣品藥物代謝動力學定量研究藥物（包括外來化學物質）在生物體內吸收、分布、排泄和代謝（簡稱體內過程）規(guī)律的一門學科。常用測定方法 HPLC-UV ?GC-MS ? LC-MS/MS ?數據處理分析3原理與標準操作規(guī)程(SOP)2.實驗設計與動物實驗3.樣品處理與方法開發(fā)4.定性定量與分析測定5.數據處理與

2、藥動學參數計算6.實驗報告實驗安排靜注加替沙星在家兔體內的藥代動力學研究HPLC原理與標準操作規(guī)程(SOP)的組成2.分配色譜的原理3.色譜柱4.流動相5.定性與定量方法6.樣品的預處理7.反相色譜分析方法的開發(fā) High Performance Liquid Chromatography HPLC 的組成 Pump 泵 Injector/Autosampler 進樣器/自動進樣器 Column 色譜柱 Detector 檢測器 Data System/Integrator 數據系統(tǒng)/積分儀表高效液相色譜系統(tǒng)高效液相色譜系統(tǒng)SHIMADZU LCMS-2010EVLC-MS/MS Thermo

3、 TSQ Quantum Access分配色譜的分離機理分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動相：有機溶劑如甲醇、乙腈，水應用添加劑，成為離子對、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團反相色譜固定相多為鍵合相對HPLC柱的了解色譜柱分類填料，含碳量，基質，粒徑色譜柱的應用正相柱，反相柱，預處理柱色譜柱的規(guī)格島津 Shimadzu VP-ODS; 150L2.0; 5m; 柱號 8082693.鍵合相色譜柱以硅膠為基質，通過化學鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團聯(lián)在基質上，作為固定相。優(yōu)點固定相穩(wěn)定，不易流失應用廣泛，可使用

4、多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點pH值不能小于3同樣填料，各種牌號色譜柱不盡相同反相C18色譜柱的活化步驟一：90%甲醇1mL/min流速沖洗30min步驟二：10%甲醇1mL/min流速沖洗30min步驟三：90%甲醇1mL/min流速沖洗60min色譜柱的存放存放前的處理除去雜質、鹽 合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機械震動防止細菌生長注意存放的溫度液相色譜對流動相的要求除色譜柱對流動相對的要求外，還有與檢測器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細菌的生長流動相的脫氣流動相脫氣的目的使色譜泵的輸液準確輸液均勻準確，并且脈動減小保留時間及色譜峰面積的重現性提高提高檢測的性能防止氣

5、泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護色譜柱減少死體積防止填料的氧化流動相脫氣的方法加熱簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時，也有脫氣的效果超聲波簡單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度色譜峰定性鑒別每個色譜峰通過比較保留值(通常是保留時間)的方法，找到各色譜峰所對應的組份大多數情況下用比較保留時間來定性即所謂：保留時間相同，可能是同樣的組份保留時間不同，肯定不是同樣的組份用保留時間定性用“標樣”的保留值定出被測組份的位置標準加入法舉例 廢水樣品

6、中五氯苯（PCP）的分析PCP4 ppm3 ppm2 ppm1 ppm常用的定量方法峰面積百分比法由于檢測技術的影響，在液相色譜中不常用外標法在液相色譜中用的最多內標法準確，但是麻煩在標準方法中用的最多外標法定量配制一系列已知濃度的標樣外標法定量（二）實際色譜圖標準曲線內標法定量（一）配制一系列濃度的標樣，其中加有內標樣內標法定量（二）實際色譜圖標準曲線內標法定量（三）對內標物的要求化學結構與待測組分相似(同系物、異構體)在樣品中不存在不與樣品中組份發(fā)生任何化學反應保留值與待測組分接近濃度（響應值）與待測組分相當其色譜峰與其他色譜峰分離好可接收的檢測范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內有

7、效，高或低于這些點都可能引起計算錯誤樣品的預處理樣品預處理的目的除去微粒減少干擾雜質濃縮微量的組份提高檢測的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護樣品的預處理重要性占樣品分析時間的比例樣品預處理所用時間遠大于色譜分離的時間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學品實驗的重復性及準確性最差的環(huán)節(jié)影響實驗結果好壞的最重要因素 是決定性的步驟樣品預處理常用的方法高速離心過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak樣品處理小柱其他選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白有機溶劑乙腈，甲醇強酸三氯乙酸，過氯酸鹽50% 硫酸銨10% TCA樣品分析時第一步干什么?想辦

8、法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法查文獻，如CA(化學文摘)儀器制造商的文獻，如Waters對色譜柱有足夠的了解掌握分離機理，自己開發(fā)方法充分了解您自己的樣品分析時要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高? 樣品的本底是否很復雜? 有多少組份要分析? 對分析的精確度、準確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗，而要求方法容易使用? 使用文獻方法色譜柱填料的種類、品牌是否相同?注意文獻方法的流動相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調整流動相注意色譜柱的規(guī)格：內徑、柱長需要調整流速、進樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）反相色譜的方法開發(fā)開發(fā)過程實例色譜條件色

9、譜柱：C18，4mm30mm流動相：乙腈/水，不同的溶劑強度，60/40、50/50、40/60，由強漸弱流速：2ml/min樣品： 對羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)改變流動相比例譜圖改變流動相組成通過改變流動相改變選擇性同樣強度的不同溶劑改變色譜柱離子型化合物的分離方式使用離子交換柱離子交換法主要用于“強”陰、陽離子使用反相柱離子抑制色譜法通過改變流動相的pH值，使樣品成中性離子對色譜法加入“對離子”，使樣品呈中性離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動相的pH值，抑

10、制樣品離子的電離適用于弱酸性化合物的分離降低流動相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質C18填料使用條件應在填料基質的范圍內硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內常用緩沖液及其pH值離子抑制色譜實例在乙腈/水及pH=7時，多數保留時間很短，無法完全分離。其他精密儀器操作標準操作規(guī)程(SOP)要點高速冷凍離心機：配平、十字交叉、樣品選擇普通離心機：配平、十字交叉、樣品選擇萬分之一電子天平：稱量量程范圍、記錄、保養(yǎng)紫外可見光分光光度計：預熱、樣品量、校準渦旋振蕩器：渦旋程度超聲機：超聲效果、時間藥代動力學實驗室的要求1.環(huán)境的要求：灰塵、濕度、陽光是分析儀器的大敵2.所寫即所做3.分析測定用試劑為色譜純及以上，水為超純水4.痕量分析對實驗人員有較高要求5.對儀器設備的操作嚴格按照SOP執(zhí)行，專人管理和 維護保養(yǎng)6.良好的實驗習慣HPLC-UV測定加替沙星的血藥濃度如何著手？查文獻：中國優(yōu)秀期刊論文數據