化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)及儀器和分析

1、 化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)及儀器和分析1第一節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫分析第三節(jié)時(shí)間分辨熒光免疫分析法第四節(jié)熒光偏振免疫分析法第五節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析的臨床應(yīng)用內(nèi)容概述:2教學(xué)目標(biāo)和要求 掌握化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的基本原理、反應(yīng)的底物和標(biāo)記方法以及反應(yīng)類型。 熟悉電化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理和標(biāo)記物，時(shí)間分辨熒光免疫分析法的基本原理及其標(biāo)記物和螯合物。 了解熒光偏振免疫分析法的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)，化學(xué)發(fā)光免疫分析的臨床應(yīng)用 3第一節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)基本原理反應(yīng)的底物標(biāo)記方法反應(yīng)類型相關(guān)儀器4一、基本原理 化學(xué)發(fā)光，是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的發(fā)光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)在進(jìn)行化

2、學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)物分子形成電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)返回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，多余的能量就以光子的形式發(fā)射出來。這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。A + B C* + D, C* C + h5(一)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件和過程化學(xué)發(fā)光與熒光的區(qū)別: 化學(xué)能 光能化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件 :反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能焓變(H)介于170300 kjmol-1 之間，才能在可見光范圍觀察到化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象 吸收了化學(xué)能后處于激發(fā)態(tài)的分子或原子，必須以光子形式將能量釋放出來，或者將能量轉(zhuǎn)移到另一種物質(zhì)的分子上并使該分子激發(fā)，當(dāng)被激發(fā)的分子回到基態(tài)時(shí)，也以光子的形式釋放能量 6(二)化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)

3、發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光效率(Cl)又稱為化學(xué)發(fā)光總能量的產(chǎn)生率 Cl取決于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率(CE) 和激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的發(fā)射效率(EM)。 一般化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，Cl值約為10-6 7(三)強(qiáng)度與反應(yīng)物質(zhì)濃度之間的關(guān)系反應(yīng)物的濃度反應(yīng)速度化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所發(fā)出的光的強(qiáng)度8(四)化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)類型直接化學(xué)發(fā)光 間接化學(xué)發(fā)光 1直接化學(xué)發(fā)光 化學(xué)反應(yīng)釋放的化學(xué)能激發(fā)的是反應(yīng)產(chǎn)物分子 A + B C* + D, C* C + h92間接化學(xué)發(fā)光(敏化的化學(xué)發(fā)光 ) 在化學(xué)反應(yīng)中，激發(fā)能傳遞到另一個(gè)未參加化學(xué)反應(yīng)的分子上，使該分子達(dá)到電子激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)分子返回到基態(tài)時(shí)發(fā)光；或反應(yīng)首先生成一種高能量的

4、中間體，此中間體再將能量轉(zhuǎn)移給另一個(gè)未參加化學(xué)反應(yīng)的分子，使該分子達(dá)到電子激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)分子躍遷回到基態(tài)時(shí)發(fā)光的過程。 A + B C* + D , C* + F F* + E, F* F + h10二、反應(yīng)的底物(發(fā)光劑或發(fā)光底物) 在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物 發(fā)光免疫技術(shù)中常用的化學(xué)發(fā)光底物: 氨基苯二酰肼類 主要有魯米諾(3-氨基苯二甲酰肼，luminol)和異魯米諾(5-氨基苯二甲酰肼，iso lumino1)及其衍生物。2瞇唑類化合物較常用的是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉堿(lophine)。3吖啶酯類典型代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸

5、酯，即光澤精(1ucigenin)。4苯酚類化合物其中主要有鄰苯三酚，即焦性沒食子酸。5芳香草酸酯類主要有雙-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和雙-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。 6(金剛烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物 1112三、標(biāo)記方法化學(xué)標(biāo)記 生物標(biāo)記 化學(xué)標(biāo)記: 用于化學(xué)發(fā)光(酶)免疫測(cè)定直接用發(fā)光物質(zhì)(如魯米諾、吖啶酯類等)標(biāo)記抗體或抗原以催化劑(如HRP、GOD等)和或協(xié)同因子(如ATP、NAD等)標(biāo)記抗體或抗原 按照標(biāo)記物的應(yīng)用:13按照被標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)或性質(zhì) :對(duì)小分子物質(zhì)(如甾體激素、藥物等)的標(biāo)記對(duì)大分子抗原、抗體的標(biāo)記(如蛋白質(zhì)、核酸等)以及對(duì)

6、某些配基和載體的標(biāo)記 14按照標(biāo)記反應(yīng)的過程和形成結(jié)合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn): 直接偶聯(lián)間接偶聯(lián) 通過偶聯(lián)反應(yīng)，使標(biāo)記物分子中的反應(yīng)基團(tuán)直接連接在被標(biāo)記分子的反應(yīng)基團(tuán)上。 在標(biāo)記物與被標(biāo)記物之間插入一條鏈或一個(gè)基團(tuán)，使兩種物質(zhì)通過這種引入的“橋”連結(jié)成結(jié)合物碳二亞胺縮合法、過碘酸鹽氧化法、重氮鹽偶聯(lián)法和混合酸酐法 琥珀酰亞胺活化法、O-(羧甲基)羥胺法、異硫氰酸酯衍生物和戊二醛法 1516常用的標(biāo)記方法 1碳二亞胺（EDC）縮合法 此法可用于蛋白質(zhì)分子中的游離羧基或游離氨基的標(biāo)記。常用的縮合劑有l(wèi)-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC )直接偶聯(lián) 17 2重氮鹽偶

7、聯(lián)法(又稱重氮化法) 此法簡(jiǎn)易、成本低、重復(fù)性好，但不適用于脂肪伯胺基發(fā)光劑，因其生成的重氮鹽不穩(wěn)定，即使在也會(huì)生成氮?dú)狻４送?，ABEI等伯胺基位于側(cè)鏈者也不適用此法。 芳香伯胺 直接偶聯(lián) 183過碘酸鹽氧化法 標(biāo)記物可用發(fā)光劑或催化劑，適用于芳香伯胺或脂肪伯胺發(fā)光劑，標(biāo)記方法穩(wěn)定標(biāo)記物不易脫落，但此法不適用于無糖基的蛋白質(zhì)和含有糖基但氧化后會(huì)影響免疫學(xué)活性的蛋白質(zhì)。直接偶聯(lián) 194戊二醛法 間接偶聯(lián)芳香伯胺基 氨基 由于戊二醛在溶液中以單體和聚合體形式存在，后者占多數(shù)，所以在標(biāo)記反應(yīng)中雙方分子間構(gòu)成較大的距離，減少了在抗原抗體反應(yīng)時(shí)的空間位阻；但因偶聯(lián)不易定量控制且缺乏特異性等而未得到廣泛應(yīng)

8、用 雙功能偶聯(lián)劑 205琥珀酸酐法(環(huán)內(nèi)酸酐法) 間接偶聯(lián) 此法沒有雙功能交聯(lián)劑的不良反應(yīng)，能實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物和蛋白質(zhì)分子間的單向定量縮合，標(biāo)記效率高，已有商品化試劑供應(yīng)。 216異硫氰酸酯衍生物法 此法標(biāo)記溫和、穩(wěn)定，獲得的標(biāo)記物不易脫落，且不損失蛋白質(zhì)等的生物活性 發(fā)光標(biāo)記物 標(biāo)記物 間接偶聯(lián)227 O-(羧甲基)羥胺法 O-羧甲基衍生物 8混合酸酐法 23四、反應(yīng)類型 化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析根據(jù)發(fā)光免疫分析中發(fā)光反應(yīng)的不同體系和標(biāo)記方法不同 241.化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA) 用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗

9、原或抗體, 免疫反應(yīng)后生成標(biāo)記的免疫復(fù)合物,通過啟動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH-H2O2)作用于AE而發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度依賴于免疫反應(yīng)物中化學(xué)發(fā)光劑的濃度。原理:常用化學(xué)發(fā)光劑:吖啶酯(acridinium ester，AE)類化合物 反應(yīng)特點(diǎn):CLIA檢測(cè)小分子抗原采用競(jìng)爭(zhēng)法；大分子抗原則采用夾心法。與大分子的結(jié)合不會(huì)減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。 強(qiáng)烈的直接發(fā)光在1 s內(nèi)完成，為快速的閃爍發(fā)光。應(yīng)用:25 1)直接化學(xué)發(fā)光使用吖啶酯(AE)作為標(biāo)記物，無需附加催化劑。AE氧化直接發(fā)光，氧化反應(yīng)在430 nm處快速發(fā)光并在1s內(nèi)達(dá)到峰值。發(fā)光強(qiáng)度是I125在1min內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度的十萬倍，因此系統(tǒng)該具有

10、高速度、產(chǎn)光強(qiáng)等特點(diǎn)。 2)AE有甲基，增加了試劑的穩(wěn)定性，使試劑的穩(wěn)定性好，有效期更長(zhǎng)。 3)AE作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，對(duì)溫度及pH等外界環(huán)境的變化不敏感，故其具有很高的精密度。 4)AE相對(duì)分子質(zhì)量水常小(MW：481)，使其對(duì)結(jié)合反應(yīng)的空間位阻作用減少，增加擴(kuò)散率，提高了靈敏度，可達(dá)l0-15molL-1。 5)AE是以共價(jià)鍵結(jié)合抗體而不影響抗體結(jié)合抗原的反應(yīng)，故不影響發(fā)光。 6)AE加堿后，發(fā)光是在一暗盒中進(jìn)行，其光量值與濃度有著良好的線性關(guān)系，且本底較低。吖啶酯的特點(diǎn)262化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immnunoassay，CLEIA) 采用參

11、與發(fā)光效應(yīng)的酶作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原，免疫反應(yīng)后形成酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，利用魯米諾作為發(fā)光底物在酶和啟動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH-H2O2)的催化下，產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)，發(fā)光強(qiáng)度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度。原理: 底物 產(chǎn)物 發(fā)光Ag + Ab* Ag-Ab*27常用標(biāo)記物:辣根過氧化物酶(HRP)或ALP 反應(yīng)特點(diǎn):標(biāo)記物常標(biāo)記抗體；標(biāo)記物作為發(fā)光反應(yīng)的催化劑，本身不發(fā)光 。 283微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析 (microparticle chemiluminescence immunoassay，MLIA) 以順磁性微粒作為載體包被抗體，利用磁性微粒能被磁場(chǎng)吸引，在磁力的作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)的特性，迅

12、速捕捉到被測(cè)抗原。 加入堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，形成磁性微粒包被抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物 經(jīng)洗滌去掉未結(jié)合的抗體后，加入ALP的發(fā)光底物AMPDD，AMPDD被復(fù)合物上ALP催化發(fā)光,發(fā)射光所釋放的光子能量被光量子閱讀系統(tǒng)記錄，通過計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)將光能量強(qiáng)度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上轉(zhuǎn)換為待測(cè)抗原的濃度。原理:29 AMPDD一側(cè)的芳香基團(tuán)上的磷酸酯被水解，失去一個(gè)磷酸基而生成一個(gè)中等穩(wěn)定的中間體AMPPD(半衰期230min)，此中間體通過內(nèi)部電子轉(zhuǎn)移而裂解為一分子的金剛烷酮和一分子激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子，當(dāng)回到基態(tài)時(shí)發(fā)出波長(zhǎng)為470 nm的光)30常用標(biāo)記物:A L P 反應(yīng)特點(diǎn):可采用競(jìng)爭(zhēng)

13、法和夾心法,多采用雙抗體夾心法采用磁性微粒作為固相載體，以堿性磷酸酶作為標(biāo)記物，固相載體的應(yīng)用擴(kuò)大了測(cè)定的范圍,檢測(cè)水平可茯PgmL-1，重復(fù)性好。 31五、相關(guān)儀器介紹ADVIA CENTAUR全自動(dòng)免疫分析儀 32(一)ADVIA CENTAUR檢測(cè)原理 利用化學(xué)發(fā)光和磁性微粒子分離技術(shù)相結(jié)合的測(cè)定方法，用高敏感性的吖啶酯作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，以極細(xì)的磁性顆粒(PMP)作為固相載體，提供最大的包被面積 。1液相吖啶酯(AE)。 2固相 氧化鐵(Fe2O3)。 包被面積大,減少了擴(kuò)散時(shí)間,增加了捕獲效率33 (二)ADVIA CENTAUR的反應(yīng)類型 1雙抗體夾心法 342競(jìng)爭(zhēng)法 包括AE標(biāo)記

14、抗原法和AE標(biāo)記抗體法。353捕獲法 常用來檢測(cè)樣本中的特異性抗體，又稱為抗體捕獲法。 試劑中使用了一種抗人免疫球蛋白的抗體?？贵w捕獲法通常使用兩次溫育和洗滌，第一次溫育和洗滌是為了除去樣品中過多的干擾物質(zhì)；第二次溫育和洗滌是為了檢測(cè)樣品中的抗體。 36第二節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL) 是對(duì)電極施加一定電壓進(jìn)行的電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)物之間或體系中某種組分發(fā)生化學(xué)發(fā)光，用普通化學(xué)手段測(cè)量發(fā)光光譜及強(qiáng)度從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行痕量分析的一種方法。電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay，ECLI

15、A) 是將ECL和免疫反應(yīng)(抗原抗體反應(yīng))融為一體的標(biāo)記免疫分析技術(shù),是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng).37一、基本原理38技術(shù)特點(diǎn) 1ECLIA為非核素方法，可避免核素的放射性污染2為均相免疫測(cè)定技術(shù)，檢測(cè)中不需要分離結(jié)合相和游離相，操作簡(jiǎn)便3磁性微珠包被技術(shù)的應(yīng)用使檢測(cè)的靈敏度更高、線性范圍更寬、反應(yīng)時(shí)間更短。 4標(biāo)記物Ru 穩(wěn)定性好，室溫下半衰期大于1年，所標(biāo)記的蛋白活性在24也可保持1年：以上。5標(biāo)記物可進(jìn)行化學(xué)修飾，以形成易于和蛋自、半抗原及核酸等分子結(jié)合的活性NHS酯或磷酰胺基團(tuán)，可用于各種分析物的檢測(cè)。6標(biāo)記物相對(duì)分子質(zhì)量小，在一個(gè)抗體分子上可同時(shí)標(biāo)記許多標(biāo)記物分

16、子而不影響抗體的免疫學(xué)活性，也可用于核酸的標(biāo)記而不影響探針的雜交活性。7標(biāo)記物的再循環(huán)利用使發(fā)光反應(yīng)的時(shí)間更長(zhǎng)、發(fā)光強(qiáng)度更高，更易于測(cè)定。8儀器的沒計(jì)使操作較為簡(jiǎn)便，更易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。39二、標(biāo)記物 釕的衍生物，分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、相對(duì)分子質(zhì)量小、水溶性強(qiáng)、空間位阻小等特點(diǎn)，可與待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行全量反應(yīng)使得ECLIA的測(cè)定具有高效性與穩(wěn)定性且沒有噪聲干擾。三聯(lián)吡啶釕40第三節(jié)時(shí)間分辨熒光免疫分析法一、基本原理抗原抗體反應(yīng) 熒光物質(zhì)標(biāo)記 時(shí)間分辨技術(shù)+原理：41 用三價(jià)稀土離子及其螯合劑作為示蹤物(代替熒光物質(zhì)、放射核素或酶)，通過雙功能基團(tuán)的螯合劑與蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞

17、以共軛雙鍵結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記，待反應(yīng)體系(如抗原抗體免疫反應(yīng)、生物素親和素反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等)發(fā)生后，三價(jià)稀土離子螫合物可以在紫外光激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)度高(波長(zhǎng)為613nm左右)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(10l 000s)的熒光，利用延緩測(cè)量時(shí)間，待樣品中蛋白質(zhì)等背景熒光完全淬滅后，再測(cè)量三價(jià)稀土離子螯合物的特異熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的 42時(shí)間分辨技術(shù)消除背景熒光: 在檢測(cè)樣品中，含有各種蛋白質(zhì)和其他化合物，這些物質(zhì)在較大波長(zhǎng)范圍內(nèi)都可產(chǎn)生自發(fā)熒光,壽命短. 鑭系離子熒光壽命很長(zhǎng)（10us），比背景熒光長(zhǎng)34個(gè)數(shù)量級(jí)。

18、所以應(yīng)用熒光的時(shí)間分辨技術(shù)在背景熒光已經(jīng)降到很低時(shí)再開始檢測(cè)稀土鰲合物的熒光，從而消除了非特異性熒光的干擾。解離-增強(qiáng)原理: 較大的Stocks位移（即激發(fā)光波長(zhǎng)與發(fā)射光波長(zhǎng)之差）和較窄的發(fā)射峰等都增大了檢測(cè)的信噪比; 特點(diǎn)：43二、標(biāo)記物和螯合劑1TRFIA標(biāo)記物三價(jià)鑭系稀土元素 常用的為銪(Eu3+)，釤(Sm3+)、鋱Tb3+)等 (1)激發(fā)光譜帶較寬(2)發(fā)射光譜帶很窄(3)熒光壽命長(zhǎng)(4)Stokes位移較大(250350 nm)(5)稀土元素標(biāo)記物比較穩(wěn)定2螯合劑 具有雙功能基團(tuán)的螯合劑，其一側(cè)基團(tuán)與Eu3+連接，另一側(cè)與抗體或抗原上的自由氨基連接。 香羧酸類螯合劑多氨基多羧基類螯合劑-二酮體類螫