流式細(xì)胞術(shù)基本原理課件

1、流式細(xì)胞術(shù)基本原理陳曉東 產(chǎn)品技術(shù)專(zhuān)員廣州市珈源醫(yī)學(xué)試劑有限公司流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡(jiǎn)稱(chēng)FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)單個(gè)細(xì)胞/生物顆粒分析同時(shí)多參數(shù)、多熒光分析高通量檢測(cè)/高速度 10000個(gè)細(xì)胞/秒以上定性/定量分析分選特定性狀或功能的細(xì)胞可檢測(cè)的樣本種類(lèi)多樣(1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞

2、裂解液目前流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)的類(lèi)別細(xì)菌浮游生物DM：0.2m 15m 單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞流式細(xì)胞儀的基本構(gòu)造 激光發(fā)射器發(fā)出所需要的波長(zhǎng)的激光前向散射光檢測(cè)器側(cè)向散射光檢測(cè)器光學(xué)濾鏡流動(dòng)室與液流系統(tǒng)：將細(xì)胞單個(gè)壓入流動(dòng)室信號(hào)收集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)光源與光學(xué)系統(tǒng)Injector Tip熒光信號(hào)聚焦的激光光束鞘液流動(dòng)室當(dāng)光子遇到濾片時(shí)，光子或通過(guò)濾片，或被濾片吸收，或被濾片反射。光學(xué)濾片光學(xué)濾片的種類(lèi)長(zhǎng)通濾片（LP）：630LP短通濾片（SP）：550SP帶通濾片（BP）: 488/10共有兩類(lèi)：散射信號(hào)與熒光信號(hào)前向角散射信號(hào)（FSC）反映細(xì)胞大小側(cè)向角散射信號(hào)（SSC）反映細(xì)胞顆粒度

3、熒光信號(hào)（FL Signals）（FL1、2、3）胞內(nèi)、胞外染色情況流式細(xì)胞儀可獲取的信號(hào)種類(lèi)FSC和SSC直方圖流式細(xì)胞儀顯示圖的種類(lèi)把前向散射光圖和側(cè)向散射光圖的一維圖像在二維圖像上投影，便是我們平常所看到的流式圖。所以橫坐標(biāo)表示的是細(xì)胞的直徑大??；縱坐標(biāo)表示的是細(xì)胞的復(fù)雜程度。兩者相結(jié)合就能說(shuō)明細(xì)胞種類(lèi)散點(diǎn)圖二維等高圖和密度圖假三維圖與三維圖Pseudo 3D Plot3D Plot流式細(xì)胞儀如何獲取細(xì)胞信號(hào)？FSCSSCFL前向角信號(hào)（Forward Scatter，F(xiàn)SC）前向角信號(hào)：細(xì)胞的大小FSCCountFSCCount101000側(cè)向角信號(hào)（Side Scatter， SSC

4、）SSCCountSSCCount101000FLcountFLFSC、SSC、FL如何分離90角內(nèi)的各種熒光信號(hào)？熒光染料吸收某一波長(zhǎng)的光波后能發(fā)射出大于吸收光波長(zhǎng)的光波的物質(zhì)激發(fā)光PI488n600nm熒光染料種類(lèi)熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng) (nm) 發(fā)射波長(zhǎng)(nm) 用途 顏色FITC 488 525 免疫熒光 綠色PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 PerCP 488 670 免疫熒光 紅色PI 488 620 DNA染色 橙紅ECD 488 620 免疫熒光 橙紅PeCy5 488 675 免疫熒光 紅色APC 633 670 免疫熒光 紅色DAPI 359 462 DNA染色

5、藍(lán)色熒光染料光譜特征熒光分離原則在流式細(xì)胞儀中，一般經(jīng)過(guò)LP或SP濾片將熒光大致分開(kāi)后，再經(jīng)過(guò)一BP濾片分離出特征熒光開(kāi)放式光路Calibur、Influx流式細(xì)胞儀的光路封閉式光路（Canto、LSR系列、Aria系列）分選將目標(biāo)細(xì)胞分離并富集，進(jìn)行后續(xù)研究。分選純度99%震蕩激光偏轉(zhuǎn)板Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector幾個(gè)概念信號(hào)放大模式信號(hào)類(lèi)型CV值樣本流速激光延遲液

6、滴延遲熒光補(bǔ)償閾值門(mén)對(duì)照信號(hào)放大PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，調(diào)整PMT的電壓，信號(hào)強(qiáng)度將隨之改變光信號(hào)光電倍增管（PMT）放大器電信號(hào)放大器兩種放大方式：線性放大（lin）對(duì)數(shù)放大（log）線性放大（lin）按光強(qiáng)度的線性關(guān)系輸出信號(hào).適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物過(guò)程的信號(hào)，如DNA含量、總蛋白含量等。對(duì)數(shù)放大（log）按光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)關(guān)系輸出信號(hào).在免疫學(xué)測(cè)量中通常使用對(duì)數(shù)放大。電脈沖信號(hào)類(lèi)型將與電脈沖信號(hào) 強(qiáng)弱相關(guān)的電壓 數(shù)字化有三類(lèi)電脈沖信號(hào)高度信號(hào)H面積信號(hào)A寬度信號(hào)WCV值CV值（變異系數(shù)）：樣品均一度及儀器分辨率的標(biāo)志CV值一般2%樣本流速高流速：一般用于定性分析，如免疫

7、分型。采集速度快,但分辨率低.低流速：一般用于對(duì)分辨率要求較高的分析，如DNA分析。樣本流速選擇激光延遲（laser delay）Laser 1Laser 2液滴延遲（drop delay）顏色補(bǔ)償采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差。在完成雙色以上熒光標(biāo)記的樣本時(shí)，都需要作顏色補(bǔ)償。FITC主要由FITC的檢測(cè)器檢測(cè)，但部分光也會(huì)進(jìn)入PE檢測(cè)器。如果單染FITC，同時(shí)打開(kāi)PE檢測(cè)器，則如圖：理想狀態(tài)實(shí)際情況補(bǔ)償效果陰性對(duì)照閾值 信號(hào)放大過(guò)程會(huì)產(chǎn)生不需要的脈沖信號(hào)，通常來(lái)自于碎片。通過(guò)設(shè)定某一信號(hào)的最低強(qiáng)度值，可將不需要的脈沖信號(hào)去除，這一設(shè)定值稱(chēng)為閾值。屏蔽噪音信號(hào)和碎片信號(hào)門(mén)（Gate）分析/分選感興趣的細(xì)胞群對(duì)照同型對(duì)照：為沒(méi)有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白，通常是未進(jìn)行免疫小鼠血清的純化IgG1或IgG2，用于檢測(cè)和消除（一抗）非特異性結(jié)合到組織細(xì)胞而產(chǎn)生的背景染色?？瞻讓?duì)照：即不進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)胞。主要用于確定待測(cè)標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光閾值或檢測(cè)染色方法時(shí)候成功。陽(yáng)性對(duì)照：即已知表達(dá)某種抗