新藥發(fā)現(xiàn)的技術(shù)方法課件

1、第一節(jié) 藥物發(fā)現(xiàn)的基本模式第二節(jié) 基于整體動物的藥物篩選技術(shù)第三節(jié) 虛擬篩選技術(shù)第四節(jié) 高通量篩選和高內(nèi)涵篩選第五節(jié) 其他現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)常用技術(shù)主要內(nèi)容第一節(jié) 藥物發(fā)現(xiàn)的基本模式 發(fā)現(xiàn)主要有兩種模式，一是偶然發(fā)現(xiàn)，二是主動尋找獲得。隨著社會的發(fā)展，人們對藥物的需求還在不斷變化，要求將會不斷提高。因此，藥物發(fā)現(xiàn)將是一個永遠需要進行的研究課題，如何調(diào)整和改進研究模式和研發(fā)策略也成為研究人員普遍面臨的一個嚴峻挑戰(zhàn)。一、藥物的偶然發(fā)現(xiàn) 偶然發(fā)現(xiàn)是指人們在生活過程中，捕捉到的非主觀安排的卻具有藥物特性的現(xiàn)象，由此形成了治療疾病的藥物。例如青霉素、奎寧等藥物的發(fā)現(xiàn)過程都具有極大地偶然性。偶然發(fā)現(xiàn)并非完全是偶

2、然事件，也必須具備獲得藥物發(fā)現(xiàn)的知識和思想準備。但由于偶然發(fā)現(xiàn)的隨機性，這種藥物的發(fā)現(xiàn)途徑不可能成為要學(xué)發(fā)展所依賴的途徑。二、藥物的主動獲得（一）藥物篩選 1.隨機篩選 隨機篩選依賴的是具有適當?shù)暮Y選方法和來源廣泛的被篩選樣品，兩方面的多樣性是獲得藥物的基本條件。 2.定向篩選 定向篩選通常是采用特定的篩選方法，對特定的樣品群進行篩選。（二）基于靶點的藥物發(fā)現(xiàn)策略 1.基于GPCR受體的藥物發(fā)現(xiàn)策略 2.基于激酶的藥物發(fā)現(xiàn)策略 3.基于離子通道的藥物發(fā)現(xiàn)策略（三）基于組合的藥物發(fā)現(xiàn)策略 1.基因組學(xué)的藥物發(fā)現(xiàn) 2.蛋白質(zhì)組學(xué)與藥物發(fā)現(xiàn) 3.代謝組學(xué)與藥物發(fā)現(xiàn)（四）系統(tǒng)生物學(xué)與藥物發(fā)現(xiàn)（五）網(wǎng)絡(luò)

3、藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)三、藥物發(fā)現(xiàn)模式的轉(zhuǎn)變 19世紀末以前，藥物的發(fā)現(xiàn)主要靠親身體驗和臨床經(jīng)驗積累，這種模式發(fā)現(xiàn)的藥物優(yōu)點是偏重于臨床，偏重于應(yīng)用。 19世紀工業(yè)革命后，新藥發(fā)現(xiàn)模式也發(fā)生了根本性變化，藥物發(fā)現(xiàn)速度迅速提高。 20世紀后期，藥物發(fā)現(xiàn)正在向基因組學(xué)為基礎(chǔ)的現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)模式轉(zhuǎn)變。第二節(jié) 基于整體動物的藥物篩選技術(shù) 在整體動物水平進行藥物活性篩選是新藥研發(fā)過程中的重要技術(shù)。20世紀80年代以前，整體動物實驗一直是藥物篩選的基本方法。隨著分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)的快速發(fā)展，逐漸形成以分子的細胞水平為主的高通量和高內(nèi)涵體外篩選技術(shù)，它們?yōu)榧涌煨滤幇l(fā)現(xiàn)發(fā)揮了巨大作用。但相對于分子和細胞水平的體外

4、篩選，整體動物水平篩選具有直觀、全面的優(yōu)點。在整體動物水平篩選獲得的活性結(jié)果對預(yù)測被篩選選樣品的臨床效果和應(yīng)用前景具有十分重要的價值因此，整體動物水平篩選在新藥研發(fā)過程中具有不可替代的作用和地位。一、傳統(tǒng)整體動物水平篩選技術(shù)（一）傳統(tǒng)整體動物水平篩選模型 1.自發(fā)性動物水平篩選模型 自發(fā)性動物模型是在自然情況下試驗動物所發(fā)生的疾病模型，包括突變系的遺產(chǎn)疾病和近交系的腫瘤模型。突變系的遺傳疾病很多，可分為代謝性疾病，分子疾病和特種蛋白質(zhì)合成異常性疾病等。如無胸腺裸鼠、自發(fā)性乳腺癌小鼠、肌肉萎縮癥小鼠、肥胖癥小鼠、癲癇大鼠自發(fā)性高血壓大鼠和青光眼兔等。2.誘發(fā)性動物模型誘發(fā)性動物模型是通過使用物理

5、的、化學(xué)的和生物的致病因素作用與動物，造成動物組織、器官和全身一定的損害，出現(xiàn)某些類似于人類疾病的功能、代謝或形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的病變。例如用化學(xué)致癌劑、放射線、病毒誘發(fā)的腫瘤等，采用手術(shù)方法制備的腦卒中、心急缺血模型等。實驗或誘發(fā)性動物模型在短時間內(nèi)可大量復(fù)制，并能嚴格控制各種條件使用復(fù)制出的疾病模型是和研究目的的需要，是最常用的動物水平藥物篩選模型。3.轉(zhuǎn)基因動物模型轉(zhuǎn)基因動物模型是用實驗方法將已發(fā)現(xiàn)發(fā)的疾病相關(guān)基因?qū)雱游锏娜旧w基因組內(nèi)進行整合，建立與人類相同疾病的并能遺傳給后代的一類動物模型。轉(zhuǎn)基因動物模型避免了誘發(fā)性動物模型與人類某種癥狀相似的疾病在致病原因、機制方面不盡相同的缺點，其結(jié)

6、果準確、經(jīng)濟、試驗次數(shù)少，大大縮短了實驗時間。目前已研究出大量的轉(zhuǎn)基因動物模型用于藥物篩選研究，特別是在抗腫瘤、抗病毒、抗老年癡呆、抗帕金森病的藥物篩選中取得突破性進展。（二） 傳統(tǒng)整體動物水平篩選技術(shù)特點 傳統(tǒng)整體動物水平藥物篩選通常是將受試樣品對模型動物處理一定時間后，對比受試藥物與正?；蚰Ｐ蛯φ战M檢測指標變化的差異進而判斷樣品的作用。在傳統(tǒng)整體動物水平進行藥物篩選檢測指標范圍較廣，生理、生化、血液、免疫、組織病理學(xué)、行為學(xué)或生長發(fā)育等均可作為檢測指標反應(yīng)藥物活性。二、小型模式動物整體水平篩選技術(shù)（一）小型模式動物分類 1.線蟲 桿狀線蟲與人類基因高同源性，體積較小，組織透明，容易培養(yǎng)，生

7、命周期較短。 目前，線蟲主要由于篩選衰老、感染、神經(jīng)退行性疾病等的防治藥物。 2.果蠅 果蠅與線蟲類似，與人類基因有高度同源性，同時具有體積小、易于操作、飼養(yǎng)簡單、成本低廉、生命周期短、繁殖力強、子代數(shù)量多以及便于進行表型分析等多種特點 。 在利用果蠅建立的疾病模型涉及較多的是神經(jīng)退行性疾病包括帕金森病、阿爾茨海默病、多聚谷氨酰胺病及脆性X綜合征等，以及腫瘤、心血管疾病、線粒體病等。3.斑馬魚 斑馬魚是脊椎動物，其心血管系統(tǒng)、視覺系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等與人類相應(yīng)系統(tǒng)有許多共同點，斑馬魚的基因與人類的基因保守度達到85%。 相對果蠅、線蟲堅硬的表皮，藥物吸收困難，斑馬魚胚胎則可通過擴散來吸收藥物，因此

8、斑馬魚整體動物模型是非常合適的小分子藥物篩選模型。（二）小型模式動物篩選技術(shù)特點 由于線蟲、果蠅及斑馬魚等小型模式動物具有容易飼養(yǎng)、個體小、繁殖快等優(yōu)點，已有研究人員將其用于高通量或高內(nèi)涵藥物篩選，操作流程可在96孔或384孔微板中進行。 小型模式動物模型是藥物整體動物水平篩選新技術(shù)的發(fā)展趨勢，對于提高新藥研發(fā)速度和效率將起到重要作用，將來有可能取代一些體外模型的等，但其目前仍然主要是作為傳統(tǒng)動物模型補充。 第三節(jié) 虛擬篩選技術(shù)一、非藥物類化合物排除法二、假陽性化合物排除法三、藥效團搜索法四、分子對接法五、分子相似法六、反向分子對接法一、非藥物類化合物排除法非藥物類化合物制藥主要包括以下幾種類

9、型：存在非藥物類元素如過度金屬元素的化合物；分子量小于100或大于1000的化合物；碳原子總數(shù)小于3的化合物；無氮原子、氧原子和硫原子的化合物；違反“Lipinskis rule of five”中兩條或兩條以上規(guī)則的化合物；對于非中暑神經(jīng)系統(tǒng)的藥物篩選，則應(yīng)排除血腦屏障系數(shù)logBB大于0.3的化合物，其中l(wèi)ogBB是藥物分子在大腦中和血液中穩(wěn)態(tài)濃度比值的對數(shù)，即log(Cbrain/Cblood)；對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物篩選，則應(yīng)排除血腦屏障系數(shù)logBB小于0的化合物。大多數(shù)非藥物類化合物具備以上特征，因此利用這種排除法，可以排除非特異性的無活性化合物，適用于大多數(shù)高通量藥物篩選前的化合

10、物樣品準備。但也有例外，如抗腫瘤藥物的篩選不排除金屬有機化合物，麻醉用藥的篩選不排除小分子量的化合物等。二、假陽性化合物排除法 理論上講，具有化學(xué)反應(yīng)活性的化合物本不應(yīng)該收集到用于藥物篩選的化合物樣品庫中，但實際上化學(xué)合成工作者已經(jīng)為高通量篩選 大量的化學(xué)反應(yīng)中間產(chǎn)物，如醛、環(huán)氧化物、鹵代烷等。這些化合物無易于與生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在基于受體、酶或細胞檢測試驗中總是表現(xiàn)為假陽性，從而干擾藥物研發(fā)的進程。而在藥物篩選的前期，排除這些假陽性化合物的方法稱為假陽性化合物排除法 化合物是否為假陽性取決于化合物與生物大分子之間產(chǎn)生的相互作用是源于生物學(xué)反應(yīng)還是化學(xué)反應(yīng)。如果產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)的化合物是我

11、們尋找的目標，那么產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)的化合物則被認為是假陽性化合物，可以通過這種辦法予以排除。 但特殊情況下，如果與生物大分子發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)的化合物才是我們篩選與發(fā)現(xiàn)的目標，這種排除方法則并不適用。三、藥效團搜索法藥效團模型的構(gòu)建是先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的重要方法。藥效團可以通過配體和受體兩方面來構(gòu)建。 藥物靶點的結(jié)構(gòu)未知時，可以基于配體的結(jié)構(gòu)進行藥效團的構(gòu)建。 當化合物的活性已知時，還可以建立藥效團的3D-QSAR模型。由于藥效團模型是基于活性配體的結(jié)構(gòu)構(gòu)建的，因此參與模型構(gòu)建的配體結(jié)構(gòu)類型和配體數(shù)目均會影響藥效團模型的構(gòu)成。四、分子對接法 分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展使得大量的生物大分子的三維結(jié)構(gòu)被解

12、析，未被解析的受體大分子結(jié)構(gòu)常?？梢酝ㄟ^同源建模的方法得到。在此基礎(chǔ)上，可以基于藥物靶點或同源蛋白的結(jié)構(gòu)，以復(fù)合物的配體作為參照化合物，應(yīng)用分子對接軟件，從化合物樣品數(shù)據(jù)庫中搜索在空間和化學(xué)性質(zhì)上均與藥物靶點活性位點相契合的化合物。當藥物靶點具有多個亞型時，應(yīng)根據(jù)治療疾病的特點，選擇對藥物靶點特定亞型契合度高，對其他亞型契合度低的化合物，以提高化合物的選擇性，減少化合物的毒副作用。五、分子相似法基于分子相似性的虛擬篩選，將一個或多個與蛋白結(jié)合的配體結(jié)構(gòu)作為數(shù)據(jù)庫搜尋的條件，從化合物數(shù)據(jù)庫中搜索符合相似標準的化合物，用于高通量藥物篩選。六、反向分子對接法將同一個活性分子分別對接到多個蛋白的活性位

13、點，以確定該分子潛在的藥物靶點的技術(shù)，能夠高效、大規(guī)模的進行靶點的確定和驗證，并預(yù)測與毒性相關(guān)的靶點。第四節(jié) 高通量篩選和高內(nèi)涵篩選（一）高通量篩選技術(shù)高通量篩選技術(shù)（high throughput screening，HTS）和高內(nèi)涵篩選技術(shù)（high content screening，HCS）均是以藥物發(fā)現(xiàn)的基本規(guī)律為基礎(chǔ)、應(yīng)用多學(xué)科的理論知識、集多種先進技術(shù)于一體形成的快速、高效、大規(guī)模的藥物篩選體系。高通量特點：1.符合藥物發(fā)現(xiàn)的基本規(guī)律，較大限度的利用了藥用物質(zhì)資源，提高了藥物發(fā)現(xiàn)的概率。2.充分利用藥用資源，檢測體系一般在2250ul，樣品用量一般在微克級別，節(jié)省了樣品資源3.高

14、度自動化操作：自動連續(xù)完成加樣、稀釋、轉(zhuǎn)移、混合洗版、溫孵、檢測等操作4.多學(xué)科理論相結(jié)合（二）高通量篩選的基本過程1.初篩和復(fù)篩：在分子、細胞水平篩選樣品，檢測某一樣品對某一靶點是否具有藥理活性。2.深入篩選：在初篩和復(fù)篩的基礎(chǔ)上，采用與初篩不同但密切相關(guān)的分子和細胞模型，對活性化合物進行深入的藥理作用評價。3.確證篩選：對先導(dǎo)化合物進行更為深入的研究，包括藥理作用、代謝過程、一般毒性等多方面的內(nèi)容，以確定其開發(fā)前景。（三）、高通量篩選模型的常用技術(shù)方法1.高通量藥物篩選模型的一般要求（1）特異性：藥物作用特異性和疾病相關(guān)特異性（2）靈敏性：一是能靈敏的反映樣品在模型上的作用，二是陽性對照與

15、空白對照之間的范圍或信噪比能足以反映樣品作用的層次。（3）穩(wěn)定性：根據(jù)模型研究過程建立的標準操作程序能夠在重復(fù)實驗中獲得一致的結(jié)果。（4）可操作性：建立的篩選模型在微量、體外可控條件下穩(wěn)定的反映篩選結(jié)果，可進行大規(guī)模實驗。2.常用高通量藥物篩選模型（1）分子水平藥物篩選模型，分為： 1）以酶作為藥物靶點 2）以受體作為藥物靶點（2）細胞水平藥物篩選模型：觀察被篩選樣品對細胞的作用，能反映出藥物對細胞生長過程、作用途徑的綜合作用。（3）其他類型篩選模型：應(yīng)用生物芯片進行藥物篩選，能在微小的芯片上獲得大量生物活性數(shù)據(jù)。3.高通量藥物篩選常用檢測方法（1）比色檢測法：最經(jīng)典的酶檢測方法，通過檢測反應(yīng)

16、的底物或產(chǎn)物在紫外或可見光下最大吸收值的變化，間接測定反應(yīng)體系中酶的活性（2）熒光檢測法 1）熒光強度法 2）熒光偏振檢測法 3）均相時間分辨熒光 4）熒光共振能量傳遞（3）發(fā)光檢測法（4）放射性核素檢測法（5）形態(tài)學(xué)方法（6）核磁共振檢測法4.篩選模型的評價（1）信號本底比（S/B）信號本底比反映的是篩選模型獲得的數(shù)據(jù)與本底數(shù)據(jù)之間的差距S/B=Msignal/Mbackgroung其中S/B為信號本底比，Msignal為測得信號的數(shù)據(jù)平均值，Mbackground為測得的本底數(shù)據(jù)平均值（2）信噪比（S/N）：信噪比是儀器分析中常用的方法評價參數(shù)（3）信號本底變異系數(shù)（CV）：相對變異值可以

17、反映信號的變異情況CV（%）=100SD/M（4）Z因子：在評價藥物高通量篩選模型的方法中，Z因子是廣泛接受的評價指標。它將評價模型質(zhì)量的主要參數(shù)信號窗和信號變異相結(jié)合，達到了良好的評價效果二、高內(nèi)涵篩選技術(shù)（一）高內(nèi)涵篩選技術(shù)的概念所謂高內(nèi)涵篩選（HCS）是指在保持細胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時檢測被篩選樣品對細胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)各個環(huán)節(jié)的影響，在單一實驗中獲取大量相關(guān)信息，確定其生物活性和潛在毒性。（二）高內(nèi)涵篩選的優(yōu)勢1.以細胞為單位2.多靶點檢測，實現(xiàn)“一藥多篩”3.準確可靠（三）高內(nèi)涵藥物篩選的技術(shù)和應(yīng)用1.細胞形態(tài)觀測（1）全細胞形態(tài)檢測（2）亞

18、細胞形態(tài)檢測（3）多細胞或細胞間形態(tài)2.細胞毒性研究3.受體功能檢測4.信號通路分析5.動態(tài)分析檢測第五節(jié)：其他現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)常用技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)的出現(xiàn)深刻影響著藥 物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的進程。1：生物信息技術(shù) 生物信息技術(shù)學(xué)是綜合運用數(shù)學(xué)、計算機與網(wǎng)絡(luò)技術(shù)以及生物學(xué)等手段對各種生物信息進行收集、加工、存儲、分析、整理和歸納，并對生物信息做出解析的學(xué)科。生物信息學(xué)的研究內(nèi)容主要包括：1 建立、貯存并管理大量的生物學(xué)信息庫。2 開發(fā)計算機用途和統(tǒng)計學(xué)方法，分析確定數(shù)據(jù)庫中大量數(shù)據(jù)的相關(guān)性。3 應(yīng)用已知的生物學(xué)信息預(yù)測或分析生物大分子或小分子化合物的結(jié)構(gòu)和功能。生物信息學(xué)能為藥物分子設(shè)計提供豐富的數(shù)據(jù)庫，

19、包括藥靶的基因序列及表達調(diào)控特點、三維結(jié)構(gòu)、受體與配體結(jié)合作用、構(gòu)效關(guān)系、化合物生物活性庫等，從而為藥物分子設(shè)計提供導(dǎo)向并促進化物的虛擬篩選。 2生物芯片技術(shù) 生物芯片技術(shù)是指通過微小基片表面固定大量的分子識別探針，或構(gòu)建微分析單元或檢測系統(tǒng)，對標記化合物、核酸、蛋白質(zhì)、細胞或其它生物組份進行準確、規(guī)模化的快速篩選或檢測。 生物芯片也是高質(zhì)量篩選的主要技術(shù)之一，通過在芯片上固定特定的寡核苷酸、cDMA、靶酶、受體蛋白，甚至還包括電信等，實現(xiàn)對候選化合物的大規(guī)模篩選。3 表面等離子共振技術(shù) 表面等離子共振技術(shù)是分子結(jié)合與分離時可產(chǎn)生光強度變化，分子結(jié)合到一個固相化的生物生物靶分子上，當分析物溶液通過傳感器芯片時，結(jié)合