基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本處理保存以及核酸提取方法

1、關(guān)于基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本的處理保存及核酸提取方法第一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)測定臨床標(biāo)本中的病原體核酸成分，是一種高度敏感，且最為直接的檢測手段。由于臨床標(biāo)本中含有蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，可干擾PCR反應(yīng)，故在做PCR反應(yīng)前必須進(jìn)行核酸提取。第二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月經(jīng)典的核酸提取方法通常是加去污劑（SDS等）裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。第三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月由于樣本的處理及保存對(duì)DNA和RNA（尤其是RNA）的影響較大，因此在核酸測定時(shí)標(biāo)本的處理及適當(dāng)保存對(duì)測定結(jié)果的準(zhǔn)確有效非常重要。第

2、四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月臨床常見的標(biāo)本有血清（漿）、全血、分泌物、棉拭子、膿液、體液、新鮮組織、石蠟切片等，這些臨床標(biāo)本的處理和保存方法各有不同。第五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月臨床標(biāo)本的處理第六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月血清（漿）標(biāo)本 一些病原體，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR檢測常采用血清或血漿標(biāo)本。第七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月HBV：標(biāo)本通常由醫(yī)護(hù)人員采集，應(yīng)注意避免溶血，如為血漿標(biāo)本注意抗凝劑的選 擇，一般用EDTA-Na2或枸櫞酸納，不可使用肝素。標(biāo)本為全血時(shí)，及時(shí)分離出血漿，

3、提取病毒DNA進(jìn)行檢測。第八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月HCV：檢測RNA病毒。由于RNA極易降解，標(biāo)本的制備和保存方式往往可以影響測定結(jié)果。若用血漿標(biāo)本，應(yīng)使用EDTA抗凝。嚴(yán)禁使用肝素，因其對(duì)PCR擴(kuò)增有抑制作用, 且無法在核酸提取過程中去除?？鼓?小時(shí)內(nèi)分離血漿。如用血清標(biāo)本，則應(yīng)盡快（2小時(shí)內(nèi)）分離血清 進(jìn)行檢測，或-20oC保存。第九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月全血標(biāo)本通常用來提取外周血單個(gè)核細(xì)胞核酸：如基因組DNA、線粒體DNA、總RNA等?？鼓齽阂话闶褂肊DTA-Na2、枸櫞酸納，不使用肝素。第十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月前處理：1）加適

4、量的紅細(xì)胞裂解液（破膜液），裂解全血中的紅細(xì)胞。2）再加適量的細(xì)胞核裂液（破核液），裂解白細(xì)胞中的細(xì)胞核，使核內(nèi)DNA 釋放出來。 3）然后再加SDS（十二烷基硫酸鈉）等去污劑，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。 第十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月SDS可與蛋白 質(zhì)結(jié)成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性沉淀，但SDS在以后的核酸提取過 程中必須除去。第十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月痰標(biāo)本痰屬于分泌物，臨床上常用作結(jié)核桿菌DNA測定樣本，由于痰標(biāo)本中含大量粘蛋白和雜質(zhì)，故在核酸提取時(shí)，一定要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等經(jīng)典法提取DNA。第十

5、三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月具體方法：用無菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml，加入4倍體積4%NaOH，搖勻，室溫下放置30分鐘左右液化取1.5ml EP管，加0.5ml 液化痰液，再加0.5ml 4%NaOH室溫放10分鐘第十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月12000 rpm，離心15分鐘棄上清，加無菌生理鹽水1 ml ，混勻，12000rpm離心5分鐘棄上清，沉淀物用于 DNA提取第十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月棉拭子 用PCR方法檢測性病病原體時(shí)（衣原體、支原體、淋球菌、梅毒螺旋體、人乳頭狀瘤病毒等），臨床標(biāo)本一般為棉拭子。標(biāo)本取材是關(guān)鍵，衣原體

6、等病原體感染上皮細(xì)胞，因此取材一定要取到細(xì)胞。第十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月具體方法：加1ml無菌生理鹽水，充分震蕩混勻，12000rpm ，離心5分鐘用棉拭子取尿道分泌物或?qū)m頸分泌物（由醫(yī)護(hù)人員采集），置無菌試管或EP管內(nèi)棄上清，沉淀加無菌生理鹽水1ml，打勻，12000rpm，離心5分鐘第十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月同上，重復(fù)洗滌一次棄上清，沉淀即可用于DNA提取第十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月5體液體液標(biāo)本，包括胸水、腹水、腦脊液、尿液等，可直接離心，取沉淀物提取核酸。血性胸腹水，可使用紅細(xì)胞裂解液處理：第十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于202

7、2年6月加等體積紅細(xì)胞裂解液，震蕩混勻，置5-10分鐘10000rpm，離心5分鐘，棄上清可根據(jù)情況重復(fù)2-3次，沉淀物用于DNA提取第二十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月6膿液粘稠膿液：同痰標(biāo)本處理，先用4%NaOH液化，再離心取沉淀提取DNA。 水樣膿液：直接離心，沉淀用生理鹽水洗2-3次后用于DNA提取。第二十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月7組織組織有新鮮組織和石蠟切片。新鮮組織的處理步驟：先用生理鹽水洗二次，然后將其搗碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K消化后提取核酸第二十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月石蠟切片用于核酸提取，需先用二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K消化

8、后進(jìn)行DNA提取。第二十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)本的保存第二十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月血清（漿）HBV：分離出的血清（漿）如不立即提取核酸，保存于-20oC待檢。HCV：盡快分離血清(漿), 如不立即提取RNA， 保存于-20oC待檢。第二十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月長期保存：吸取200l血清，加20u RNasin（RNA酶抑制劑），保存于-70C。已發(fā)出結(jié)果報(bào)告的標(biāo)本應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移至冰箱保存，并由專人負(fù)責(zé)管理，保存1-2周（時(shí)間長短根據(jù)報(bào)告單上的承諾而定）。第二十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月全血標(biāo)本全血標(biāo)本如用于DNA提取，可

9、4oC下短期保存（數(shù)天），時(shí)間長易降解，如用于RNA檢測，應(yīng)在取血后盡快提取RNA。最好將DNA或RNA提取后，置-70oC保存。第二十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月痰 液化的痰標(biāo)本如不立即用于核酸提取，可保存于-20oC。處理后的棉拭子、體液、膿液如不立即用于核酸提取，可保存于-20oC。第二十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月組織新鮮組織最好保存于50%乙醇中，具體方法：先用生理鹽水將組織洗一次，切成小塊，加入適量生理鹽水，然后邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為50%，這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日，4oC可保存6年。第二十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 總而

10、言之，標(biāo)本的保存及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理對(duì)核酸模板的成功提取具有決定性作用。要強(qiáng)調(diào)的是，所有用于上述處理的容器如試管或離心管，均應(yīng)在使用前壓滅菌。第三十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月核酸的提取第三十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，核酸提取的主要步驟為：裂解細(xì)胞去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA，反之亦然。第三十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月沉淀核酸純化核酸，去除鹽類，有機(jī)劑等雜質(zhì)第三十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月(一

11、)DNA提取的經(jīng)典方法 DNA提取的經(jīng)典方法，即所謂的酚-氯仿提取法。因?yàn)槭褂脙煞N不同的有機(jī)溶劑交替抽提更容易將蛋白除去，提取次序?yàn)榉?、?氯仿（1：1）、氯仿，這種方法提取的DNA純度高、片段大、效果好，缺點(diǎn)是較為繁瑣。第三十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月經(jīng)前處理的標(biāo)本加入蛋白酶K,搖勻56oC溫育1小時(shí),或37 oC消化6小時(shí)以上/過夜加入等體積飽和酚,充分混勻第三十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月12000rpm,離心5分鐘將上層水相移至一干凈離心管內(nèi)，加等體積酚/氯仿(1:1)混合液，混勻第三十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月12 000rpm，離心5分

12、鐘取水相，移至一干凈離心管內(nèi)，加等體積氯仿，混勻后12000rpm，離心5分鐘取水相，移至一干凈離心管內(nèi)，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，沉淀DNA搖勻，可見白色絮狀DNA，置-20oC，30分鐘或過夜第三十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月12000rpm，離心5分鐘棄上清，用預(yù)冷70%乙醇洗兩次，室溫干燥5分鐘加適量TE緩沖液或無菌去離子H2O溶解DNA，混勻紫外分光光度儀測OD值，4oC備用第三十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月說明：回收上層水相時(shí)，一定不要接觸兩相的界面，以免將蛋白質(zhì)等物質(zhì)吸入新離心管。沉淀DNA，無水乙醇是首選的有機(jī)溶劑。另：異丙醇、醋酸鈉等。第三十九張，

13、PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月70%乙醇漂洗DNA，是為了去除殘余的鹽類，去除過量SDS和酚等雜物，因?yàn)镾DS在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài)，不與DNA共沉淀，從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對(duì)以后PCR反應(yīng)的影響。TE緩沖液：10mmol/L Tris-Hcl 1mmol/L EDTA pH 8.5或 8第四十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA的提取 RNA提取條件較DNA要求嚴(yán)格，主要是因?yàn)榕R床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，存在大量對(duì)RNA有強(qiáng)烈降解作用RNase。RNase是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類。這種酶耐酸、耐堿、耐高溫，如煮沸也不能使之完全失活。第四十一張，PPT共六十

14、頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)變性劑可使之暫時(shí)失活，但變性劑去除后，又可恢復(fù)活性。除細(xì)胞內(nèi)RNase以外，環(huán)境中灰塵、各種實(shí)驗(yàn)器皿和試劑、人體的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA時(shí)，關(guān)鍵要避免RNase對(duì)標(biāo)本的污染及防止RNase對(duì)提取的RNA的降解。第四十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月1提取RNA所用器皿的處理及溶液的準(zhǔn)備塑料制品：如試管、EP管、Tip頭，使用滅菌的一次性用品。第四十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月玻璃用品：如燒杯、試管和其他用品，常被RNase污染，使用前必須于180oC干燥8小時(shí)以上，或用0.1%DEPC水(焦碳酸二乙酯)浸泡處理。第四

15、十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月DEPC是RNase的強(qiáng)抑制劑，作用機(jī)制是通過與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。37oC浸泡2小時(shí)，然后用滅菌水漂洗數(shù)次，于100oC干烤15分鐘，去除器皿上殘余DEPC。第四十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 所需溶液的配制：必須用高壓滅菌的水和RNA提取專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，把溶液裝入無RNase的玻璃器皿。第四十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月嚴(yán)格來說，所有溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37oC處理12小時(shí)以上，然后于100oC加熱15分鐘或高壓滅菌15分鐘，去除殘余DEPC。第四十七張，PPT共

16、六十頁，創(chuàng)作于2022年6月2RNA提取中RNase污染的控制最主要的潛在污染源是操作人員的手，手直接觸摸之處毫無疑問會(huì)留下RNase，另外，說話帶出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作過程中，都應(yīng)戴一次性手套和口罩。第四十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)中，如接觸了“臟的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套。第四十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月RN A提取方法下面以異硫氰酸胍結(jié)合氯仿-酚提取法介紹RNA的提取。異硫氰酸胍是一種強(qiáng)用力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)的破

17、壞消失而迅速與核酸分離。第五十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月RNase雖可耐受多種處理，（如煮沸）而不失活，但卻會(huì)被4mol/L異硫氰酸胍和-巰基乙醇（破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵）等還原劑所滅活，因而可從組織中分離出完整RNA分子。因此上述試劑是制備RNA的常規(guī)試劑。第五十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月200l血清（漿）加入200l 20%PEG60004oC，3小時(shí)，12000rpm，4oC離心15分鐘棄上清，加500l裂解液（含異硫氰酸胍、-巰基乙醇等），混勻第五十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月加50l NaAc，500l飽和酚：氯仿：異戊醇（50：4

18、9：1），充分混勻，冰浴10分鐘4oC12000rpm，離心5分鐘小心吸取上層水相移至一新離心管中，避免吸取兩相之間的蛋白質(zhì)，用氯仿-異戊醇再抽提一次第五十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月加2.5倍體積無水乙醇，冰浴30-60分鐘4oC12000rpm，離心10分鐘棄上清，沉淀用70%乙醇洗二次，65oC烘干用10l DEPC水溶解RNA，并加2u RNasin-20oC保存?zhèn)溆玫谖迨膹?，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）核酸提取的其他方法(簡單介紹):胍鹽提取結(jié)合二氧化硅吸附法二氧化硅具有特異吸附核酸的特性，異硫氰酸胍可使細(xì)胞裂解,因此在高濃度異硫氰酸胍存在下，從細(xì)胞(包括細(xì)菌)或病毒顆粒中釋放出來的核