基因工程總結(jié),再也不怕考試大題

1、基因工程簡答題與相應(yīng)知識點總結(jié)某學(xué)生在用EcoRI切割外源DNA片段時，出現(xiàn)了星號活性，請分析可能的原因并提出解決的方案？（ 6 分）答：（1）導(dǎo)致星號活性因素：a較高的甘油濃度b酶與底物DNA比例過高（不同酶情況不同，通常為 100v/micHo.g） c低鹽濃度（25mM） d高PH值（PH8.0） e存在有機溶劑（如DMSO、乙醇、乙 烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等）f用其他二價離子代替Mg2+（Mn2+.Cu2+.Co2+.Zn2+ 等）（2）抑制星號活性的方法：a盡量用較少酶進行完全消化反應(yīng)，這樣可避免過度消化及過度的甘油濃度.b盡量避免有機溶劑（如制備

2、DNA時二乙醇）污染c將離子濃度提高到100150mM （若酶活性不受離子濃度影響）d將反應(yīng)緩沖液PH值降到7.0 e二價離子用Mg2+。2、為了繪制長為3.0kb的DNA的BamH I限制性片段的限制性圖譜，分別用EcoR I、Hpa II、EcoR I+Hpa1.7kbII消化這一片段的三個樣品，然后通過凝膠電泳分離DNA片段，漠乙錠染色后觀察DNA帶型（見圖）。請根 據(jù)這些結(jié)果繪制一個限制性圖譜，要標(biāo)明EcoR愉Hpa II識別位點間的相對位置，以及它們之間的距離（kb） 5-0.9-E-0.5-H-1.2-E-0.4-3。1.6kb1.2kb0.5kb0.4kb1.4kb0.9kb0.

3、4kb答：見課件第一章。3、目的基因與啟動子拼接后，重組分子若不表達(dá)，應(yīng)如何分析？（ 10分）答：A.目的基因的表達(dá)方式分：細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或者分泌產(chǎn)物至細(xì)胞外，如果蛋白為分泌性，那么細(xì)胞內(nèi)檢測 不到表達(dá)，或者表達(dá)很少；分子量大小，分子量大小決定了蛋白半衰期，因而檢測需要延長；目的基因的抗體特異性不好則很難以檢測表達(dá)；許多表達(dá)宿主自身有自己的蛋白酶，會將所需產(chǎn)物降解，也可能因為修飾系統(tǒng)不同，使得產(chǎn)物的活 性不高或者沒有；如果宿主菌與蛋白來源菌不同也有可能由于密碼子使用偏好性不同導(dǎo)致不表達(dá)。4、藍(lán)白斑篩選法為什么也會有假陽性？答：藍(lán)白斑篩選法出現(xiàn)假陽性的原因：缶半乳糖苷酶的N末端是非必須的，可以進行修

4、飾，并不影響酶的活性或a肽的互補性。如果插入的外 源DNA引起a肽的可讀框的改變或者插入片段在正確的可讀框中含有終止密碼的話，就形成白色噬菌斑。如 果插入DNA的堿基數(shù)正好是3的倍數(shù)，或者插入的DNA中不含有終止子的話，仍會形成藍(lán)色菌落。這種插 入物的長度可達(dá)幾百個堿基對。（1）藍(lán)白斑篩選法原理：某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖甘酶基因片段，在半乳糖甘酶基因區(qū)外又另外 引入了一段含有多種單一限制性酶切位點的DNA序列，這些位點上如果沒有克隆外源性DNA片段，在質(zhì)粒 導(dǎo)入LacZ的大腸桿菌后質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１磉_(dá)，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補，產(chǎn)生有 活性的半乳糖苷酶，加入底物X-ga

5、l和誘導(dǎo)劑IPTG后出來藍(lán)色菌落；如果在多克隆位點上插入外源基因，則 使LacZ基因失活，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色，由于這種顏色標(biāo)志，重組與非重組體的區(qū)分一 目了然。5、當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時，若要進行雙酶切，應(yīng)采取什么措施?為什么？答：1.同步雙酶切：選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步，因為在非最佳緩沖條件下 時的切割速率會減緩；2 .分步酶切：應(yīng)從反應(yīng)要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢后再調(diào)整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求， 然后加入第二種酶完成雙酶切；使用配有特殊緩沖液的酶進行雙酶切：在大多數(shù)情況下，采用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的酶也能在這些特殊緩沖 液中進行酶切

6、，這保證了對緩沖液有特殊要求的酶也能良好工作。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液中進行酶切反應(yīng) 時，反應(yīng)速度會減慢，因此需要增加酶量或延長反應(yīng)時間。6、用哪些方法可以檢測轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因，如何檢測？答：1、外源基因整合到植物基因組的檢測：SOUTHERN雜交、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、報告基因檢測等；2、外源基因在植物基因組中轉(zhuǎn)錄檢測：NORTHERN雜交是DNA-RNA雜交，它是檢測特定組織或 器官中外源基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA一種有用的方法；3、外源基因在植物基因組中翻譯的檢測：WESTERRN雜交是蛋白質(zhì)間的雜交，它是檢測特定組織 或器官中外源基因是否有翻譯出特定蛋白質(zhì)的方法；4、篩選標(biāo)記基因，如抗菌素

7、抗性基因，抗除草劑基因等來進行，當(dāng)受體細(xì)胞本身不含此類基因時， 導(dǎo)入含有或構(gòu)建有此類基因的供體后，只要起在受體中轉(zhuǎn)化成功，便可用抗菌素或除草劑等進行篩選；5、利用導(dǎo)入外源基因所表達(dá)的特殊性狀直接鑒定；7、請你自己設(shè)計一個抗除草劑X的轉(zhuǎn)基因植物，并寫出主要操作步驟。（10分）答：目的基因的獲得：找到抗除草劑x基因用限制性內(nèi)切酶進行酶切，然后PCR檢驗；轉(zhuǎn)化：可以采用介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，花粉管通道法；對雙子葉植物可以用土壤農(nóng)桿菌，單 子葉植物在用土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化時要注意轉(zhuǎn)化前對傷口的處理。篩選并檢測：利用含有重組基因的植株的抗性進行篩選。8、已知某蛋白基因cDNA長度為1.8kb,兩端

8、的核酸序列如下：5ATGAGTGCCAATAGCCCGACAGGAAACGATCCCCATGTATTTGGTATTCAAGAGCGCAAGTAGCACGCCCTCTTCTACTACAATGTCATAA31經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因內(nèi)部有如下限制性內(nèi)切酶位點：AflII CTTAAG， EcoRV GATATC, XmaI CCCGGG， EcoRI GAATTC，SmaI CCCGGG， SacI GAGCTC， SalI GTCGAC， HindII AAGCTT， NotI GCGGCCGCoMCS：（多克隆位點）BamHI： G|GATCC； SmaI： CCC|GGG； SacI： G|AGCT

9、C ；SalI： G|TCGAC；SphI: G|CATGC； XbaI : T|CTAGA ；PstI： C|TGCAG；Hindlll: A|AGCTT； Kpnl: G|GTACC?，F(xiàn)要把該基因克隆至表達(dá)載體pQE-30中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)并規(guī)?；a(chǎn)。1）寫出可用的酶切位點；2）設(shè)計出PCR引物；3）設(shè)計PCR擴增的程序；4）詳述克隆、篩選、表達(dá)純化及其規(guī)模化的過程。（1）答：BamHI PstI XbaI Kpnl SphI Hindlll （該基因內(nèi)部有的限制酶位點和MCS上的限制 酶位點相同的話要排除，否則基因也被切斷了）（2）答：設(shè)計PCR引物為上游引物：5一3GGG /

10、 GGATCC（BamHI）/ATGAGTGCCAATAGCCGACAG （取 21）Tm =4（G+C）+2（A+T）=68下游引物：5一3GGG/CTGCAG（PstI）/TTATGACATTGTAGTAGAAGAG （取 22）Tm=4（G+C）+2（A+T）=58（3）答：PCR擴增程序：1預(yù)變性：雙鏈DNA在94度 左右預(yù)變性5min2變性：94度下雙鏈DNA變性30s3退火：55度退火30s4延伸：72度延伸90s5最后72度 延伸10min循環(huán)三十次（4）答:克?。簩⑤d體用BamHI酶和Xbal酶進行雙酶切，然后將目的基因在體外用DNA連接酶與載體連 接，導(dǎo)入事先做好的感受態(tài)細(xì)胞

11、中，培養(yǎng)在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上；篩選：以為載體上帶有抗氨芐青霉素標(biāo)記基因，所以能在培養(yǎng)基上存活的即為轉(zhuǎn)化子；表達(dá)純化：將篩選出來的菌株進行培養(yǎng)，得到的產(chǎn)物進行分離純化，因為載體上含有6個組氨酸基 因，所以可以用親合層析的方法進行提純；規(guī)模化：將得到的單一菌株大規(guī)模培養(yǎng)，可以采用連續(xù)培養(yǎng)的方法進行，可以得到大量產(chǎn)物。9、 限制性內(nèi)切酶分為幾類？基因工程中常用的為哪一類？有何特點？（6分）答：1.分三類：為限制性內(nèi)切酶I型.II型.III型.基因工程中常用的為II型。特點：識別雙鏈DNA分子中48對堿基德特定序列，大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)，識別 切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)

12、。10、什么是cDNA文庫（complementDNAlibrary）?同基因組文庫有何差別？答：（1）cDNA文庫是通過對一系列mRNA反轉(zhuǎn)錄并對特殊的克隆予以篩選得到的，cDNA文庫是以某一生 物的總mRNA為模板，在無細(xì)胞系統(tǒng)中，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下首先合成一條互補的DNA即第一鏈，破壞RNA 模板后，在以第一鏈為模板合成第二鏈，得到雙鏈的DNA即cDNA，選用適合的載體，將合成的cDNA重組 導(dǎo)入寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到的cDNA克隆群為cDNA文庫；（2）差別：基因組文庫含有全部基因，cDNA文庫含有全部蛋白編碼的結(jié)構(gòu)基因，cDNA文庫小于基因 組文庫。11、PCR的基本原理是什么？用PCR

13、擴增某一基因，必須預(yù)先得到什么樣的信息？答：（1）原理：DNA半保留復(fù)制的原理，在體外進行DNA的變性，復(fù)性和延伸。首先是在dsDNA在高 溫下變性為ssDNA,然后DNA聚合酶以ssDNA為模板，利用聚合酶和dNTPs合成新生的DNA互補鏈，新 合成的dsDNA經(jīng)過變性，復(fù)性，延伸，如此反復(fù)循環(huán)，使目標(biāo)DNA以指數(shù)形式擴增；(2)要已知待擴增目的基因或者DNA片段兩側(cè)的序列，據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必須的雙引物。 或者至少預(yù)先知道，足夠合成一對引物的靶DNA序列。12、如果知道某一基因的功能及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成，可以通過何種方法克隆該基因？答：先從表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞中提取總的mR

14、NA，根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測其DNA序列(做成類似 于簡并探針的小片段序列)，該序列制成探針，然后與提取出的mRNA雜交，能夠雜交的即可選出，利用反轉(zhuǎn) 錄的方法合成cDNA，再用PCR技術(shù)克隆該基因。13、欲將一真核生物的結(jié)構(gòu)基因克隆后轉(zhuǎn)移到原核生物(如E. coli)中進行表達(dá)，克隆時應(yīng)注意哪些問題?答：真核生物的結(jié)構(gòu)基因含有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)移的的目的基因要去除內(nèi)含子，原核生物與真核生物有密碼子偏 愛性。14、某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一 Bgl I的切點?，F(xiàn)用Bgl I切割該載 體進行基因克隆，問：(1)轉(zhuǎn)化后涂皿時應(yīng)加什么樣的抗生素？(2)培養(yǎng)后長出的菌

15、落具有什么樣的抗性基抗型？(3)如何利用抗性變化篩選到含有插入片段的重組體? (6分)答：含Tet抗性的抗生素Tet(r)+Kan(r)+Tet(r) Tet(r)Kan(s)和 Tet(r)Kan(r)(既然長出來了那一定是有 Tet抗性)3先將轉(zhuǎn)化液涂皿在Tet平板，再將Tet平板上轉(zhuǎn)化子影印在含Tet、Kan的平板上；在Tet平板上生長， 但在Tet、Kan平板上不生長的轉(zhuǎn)化子即為含有插入片段的重組體。15、簡述差異雜交的原理及基本思路？答：、原理：差異雜交是將基因組文庫的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素摸上，用兩種混合的不同 cDNA探針分別于濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對應(yīng)位置

16、雜交信息以分離差異表達(dá)的基因。適用于基 因組不太復(fù)雜的真核生物表達(dá)基因的比較，假陽性率較低，但對基因組非常復(fù)雜的真核生物，則因工作量太大， 表達(dá)的序列所占百分比較低，價值不大；、基本思路：將一種細(xì)胞的mRNA反轉(zhuǎn)錄生成cRNA第一鏈，然后將該cRNA與另一種細(xì)胞過量的 mRNA進行雜交，第一種細(xì)胞中如果存在不同于第二種細(xì)胞的特殊基因表達(dá)，則會產(chǎn)生該特殊基因的mRNA 和反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA，該cDNA不能與第二種細(xì)胞的mRNA形成雜交體，該雜交體反應(yīng)產(chǎn)物再經(jīng)羥基磷灰 石柱層析，便于分離純化出未形成雜交體的cDNA，它代表前一種細(xì)胞中特殊基因，以該鏈作為探針后，第 一種細(xì)胞的cDNA文庫的兩套重

17、復(fù)拷貝雜交，跟探針能夠雜交克隆是在組織細(xì)胞中特異表達(dá)的mRNA再對 這樣的克隆進行測序比較，鑒定，就分離到這種組織，特異表達(dá)的基因，所有包含重組體的菌落，陽性反應(yīng)在 X射線上呈現(xiàn)黑色的點。16、PCR引物設(shè)計引入酶切位點時，為什么需在酶切位點后加上一些堿基？答：PCR引物設(shè)計引入酶切位點時需在酶切位點后加上2-3個GC堿基作為保護堿基，其可以保護PCR 引物不被酶降解，還為限制性內(nèi)切酶的切割充當(dāng)一個支點，作用點使得切割更容易。17、目前常用的轉(zhuǎn)基因方法有哪些，各有何特點？答：Ca離子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(DNA麟酸鈣共沉淀法)：Ca離子與細(xì)胞外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后 者經(jīng)過熱脈沖發(fā)生收縮作用，使

18、得細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時的狀態(tài)叫感受態(tài)。電穿孔轉(zhuǎn)化：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)換儀的樣品池中，兩級施加高壓電 場，在強大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子進入，特點是細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：革蘭氏陰性菌如枯草桿菌接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì) 菌通常用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或重組DNA分子，酵母菌，霉菌，植物細(xì)胞也可用此法。18、請你自己設(shè)計一轉(zhuǎn)抗菌肽魚，并寫出主要操作步驟。答：抗菌肽基因的獲得：尋得含有抗菌肽基因的生物體并提取出抗菌肽基因，再將這段基因連接到載體上， 獲得含有目的基因的載體；選擇基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞，這種受體細(xì)胞

19、需要是全能細(xì)胞，如生殖細(xì)胞受精卵，胚胎干細(xì)胞；將獲得的含有目的基因的載體用轉(zhuǎn)基因的方法導(dǎo)入受體細(xì)胞，如魚受精卵中；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的受精卵，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚；檢驗試驗魚是否產(chǎn)生抗菌肽表型。19、載體的功能與應(yīng)具備的條件是什么？答：功能：運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；為外源基因的 擴增或表達(dá)提供必要的條件；具備的條件：具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性；具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點； 具有較高的外源DNA的載裝能力；具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點；具有合適的篩選標(biāo)記。20、質(zhì)粒的基本特征是什么？自主復(fù)制性不相容性可轉(zhuǎn)移性攜帶特殊的遺傳標(biāo)記質(zhì)粒的分離純化：

20、Cscl密度梯度離心法：質(zhì)粒DNA純度高、周期長，設(shè)備要求高，漠乙啶污染;沸水浴法：質(zhì)粒DNA純度低，快速，操作簡便；堿溶法。受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件是什么？21、限制性缺陷型：外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷；重組整合缺陷型：用于基因擴增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞； 具有較高的轉(zhuǎn)化效率：具有與載體選擇標(biāo)記互補的表型；感染寄生缺陷型：防止重組細(xì)菌擴散污染，生物 武器除外。22、影響雜交的因素有哪些？答：核酸分子的濃度和長度：核酸濃度越大，復(fù)制性速度越快。探針長度應(yīng)控制在50-300個堿基對為好；溫度：溫度過高不利于復(fù)性，而溫度過低，少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈不易解離，適宜的溫度是較 Tm值低25度；離子強度：在低

21、離子強度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強度的增加，雜交反應(yīng)率增加。高濃度的鹽 使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，所以進行序列不完全同源的核酸分子雜交時必須維持雜交反應(yīng)液中的鹽濃度合 洗膜液中的鹽濃度。雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值。它有以下優(yōu)點：在低溫下探針更穩(wěn)定，能更好的 保留非共價結(jié)合的核酸。核酸分子的復(fù)雜性：是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長度。兩個不同基因組DNA變性后的相對 雜交速率取決于樣品濃度絕對一致時的相對復(fù)雜性。23、克隆DNA序列檢測方法：限制性酶切圖譜法；菌落噬菌斑雜交法；DNA序列分析法，可以用到PCR。24、外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質(zhì)生物功能測定法：a、淀粉酶目

22、的基因的鑒定b、抗菌性抗性基因的鑒定c、DNA結(jié)合蛋白編碼 基因的鑒定d、雜交釋放轉(zhuǎn)譯鑒定；蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法：a、放射免疫原位雜交鑒定b、免疫沉淀法；聚丙烯酰胺凝膠電泳法：如果待篩選鑒定的目標(biāo)蛋白既不能測定生物活性，又無現(xiàn)成的抗體使用，則可 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行粗略的篩選。25、菌落噬菌斑原位雜交法答。工作原理：根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計并合成探針以此搜尋篩選含有目的基因 的目的重組子?；静僮鳎河孟跛崂w維素薄膜影印克隆平板；用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜；用SSC溶液浸 泡清洗影印薄膜；80C烘干固定影印薄膜；薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫；刨SSC-S

23、DS液洗滌 雜交薄膜；用X光膠片覆蓋薄膜感光。一些補充概念：復(fù)習(xí)可看1、基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技 術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞 的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。2、基因工程的支撐技術(shù)：遇到考題時往這些套。核酸凝膠電泳技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)、DNA序列分析技術(shù)、寡核苷酸合成技術(shù)、 基因定點突變技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)。3、用于核酸操作的工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修飾酶；*星號活性：核酸內(nèi)切酶的

24、緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使 一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Star activity現(xiàn)象。4、基因工程的操作過程：DNA的體外重組（切、接）、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)、增）、轉(zhuǎn)化子 的篩選和鑒定（檢）。5、各種轉(zhuǎn)化方法總結(jié)。1）、Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌 等），其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空 隙，細(xì)菌細(xì)胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)；2）、電穿孔轉(zhuǎn)化：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣

25、品池中，兩極施加高壓電場。 在強大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細(xì)胞內(nèi)。電穿孔轉(zhuǎn)化法 操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大；同樣的原理，電穿孔法也 可用于質(zhì)粒消除實驗。6、大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢：1）、全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架；2）、基因克隆表 達(dá)系統(tǒng)成熟完善；3）、繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；4）、被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程 受體生物。大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢：1）、缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能；2）、缺乏對真核生物蛋白質(zhì) 的修飾加工系統(tǒng)；3）、內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正

26、確的異源蛋白；4）、細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒 素。7、核糖體結(jié)合位點（RBS）：外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且 在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯 效率，它們之間的差別有時可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核 糖體結(jié)合位點（RBS）。*大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核昔酸序列5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通 過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3端區(qū)域3

27、AUUCCUCC 5并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位 于核糖體上，從而啟動翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，但 有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子。8、密碼子偏愛性對外源基因表達(dá)的影響：由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大 程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正 確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá):1）、外源基因全合成：按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡并密碼 子，重組人胰島素、干擾素以及生長激

28、素在大腸桿菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法。2）、同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因：對于那些含有不和諧密碼子種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。9、包涵體及其性質(zhì)：在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形 成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，舊）。富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長 在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性 和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌

29、工程菌大量合成非天然性的同源或異源 蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、 RNA和脂多糖等非蛋白分子。1）、包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點：a、能簡化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作，其水難溶性及密度遠(yuǎn)大于其它細(xì) 胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來； b、能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對異源 重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅。2）、包涵體表達(dá)形式的缺點：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變 性復(fù)性操作，才能回收得

30、到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效 率對目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時， 體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^30%。10、在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體） 狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過運輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N 端信號肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件。1）、分泌表達(dá)形式的優(yōu)點：入、目的蛋白穩(wěn)定性高。重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍；B、目 的蛋白易于分離；。、

31、目的蛋白末端完整。相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基，當(dāng)這些真 核基因在大腸桿菌中表達(dá)時，蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸桿菌的信 號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去。2）、分泌表達(dá)形式的缺點：相對其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分 泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因即使能分泌表達(dá)，其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源 蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。11、融合型異源蛋白的表達(dá)：除了直接表達(dá)異源蛋白外，還可將外源基因與受

32、體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個開 放型閱讀框架進行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體 細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設(shè)計引入的蛋白酶切割位點或化學(xué) 試劑特異性斷裂位點，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白。*以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點：1）、目的蛋白穩(wěn)定性高，尤其對分子量較小的多肽效果更佳；2）、 目的蛋白易于分離，利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋 白；3）、目的蛋白表達(dá)率高，與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件；4）、目的蛋白溶解性好：由于受體

33、蛋白 的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性；5）、目的蛋白需要回收：融合蛋 白需要裂解和進一步分離，才能獲目的蛋白。12、工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制：1）、受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解；2）、外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì) 胞正常的生長代謝；3）、能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合 成途徑，啟動降解程序；4）、重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時的不均勻分配：這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因；5）、 受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排。13、控制目的基因的過量表達(dá)：1）、使用可控型啟動子控制目的基因的定時表

34、達(dá)及表達(dá)程度；2）、使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)；3）、優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝；4）、培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有 利于穩(wěn)定；5）、培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定。14、southern印跡雜交：Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊 脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼 龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進行雜交，用放射自顯影 或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個主要過程：一是將待測定 核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）； 二是固定于膜上的核酸與同位素標(biāo)