說(shuō)課RNA生物合成轉(zhuǎn)錄

1、說(shuō)課RNA生物合成轉(zhuǎn)錄【目的與要求】1、掌握轉(zhuǎn)錄的概念與特點(diǎn)2、掌握并能敘述原核生物與真核生物中RNA聚合酶的組成及功能3、掌握RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程4、掌握mRNA,tRNA與rRNA轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的比較 復(fù) 制 轉(zhuǎn) 錄相同點(diǎn)模 板 兩股鏈均復(fù)制 模板鏈轉(zhuǎn)錄合成方式 半保留復(fù)制 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄原 料 dNTP NTP聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶堿基配對(duì) A-T，G-C A-U，T-A，G-C產(chǎn) 物 半保留的雙鏈DNA 單鏈RNA不同點(diǎn)以DNA為模板遵循堿基配對(duì)原則都需依賴DNA的聚合酶聚合過(guò)程都是生成磷酸二酯鍵新鏈合成方向?yàn)?3概 述 一、RNA的生理功能 DNA將攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)

2、到RNA分子中，RNA分子以其信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成 二、RNA合成概況 在生物界，RNA合成有兩種方式：一是DNA指導(dǎo)的RNA合成，此為生物體內(nèi)的主要合成方式。另一種是RNA指導(dǎo)的RNA合成，此種方式常見(jiàn)于病毒。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本是RNA前體（RNA precursor），需經(jīng)加工過(guò)程（processing）方具有生物學(xué)活性第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄一、轉(zhuǎn)錄:由DNA指導(dǎo)的RNA合成,DNA以堿基互補(bǔ)原則，決定合成RNA的全部堿基成分及排列順序，將DNA模板上的遺傳信息傳遞到RNA分子的過(guò)程 1、反應(yīng)體系：DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+ ，合成方向53。連接方式- 3 , 5磷酸二酯鍵 2、特

3、點(diǎn)：不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄-DNA片段轉(zhuǎn)錄時(shí)，雙鏈DNA中只有一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板，這種轉(zhuǎn)錄方式稱作不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄 模板鏈及反意義鏈：指導(dǎo)RNA合成的DNA鏈為模板鏈，又稱反意義鏈 編碼鏈及有意義鏈：不作為轉(zhuǎn)錄的另一條DNA鏈為編碼鏈，又稱有意義鏈 由于基因分布于不同的DNA單鏈中，即某條DNA單鏈對(duì)某個(gè)基因是模板鏈，而對(duì)另一個(gè)基因則是編碼鏈 5G C A G T A C A T G T C33c g t c a t g t a c a g5DNA5G C A G U A C A U G U C3mRNAN Ala Val His Val C多肽鏈轉(zhuǎn)錄翻譯編碼鏈模板鏈不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄:模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上注意

4、：RNA的合成方向都是5 33、原料：四種磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中變?yōu)閁 4、合成過(guò)程: 連續(xù)，方向：535、合成部位：細(xì)胞核內(nèi)二、原核RNA聚合酶組成：RNA聚合酶由5個(gè)亞基構(gòu)成，2為全酶（分子量為480kD ）， 2為核心酶作用：識(shí)別DNA分子中轉(zhuǎn)錄的起始部位。 促進(jìn)與模板鏈結(jié)合，并使DNA雙鏈打開(kāi)17bp。 催化NTP的聚合，完成一條RNA鏈的聚合反應(yīng)。識(shí)別轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，停止聚合反應(yīng)，參與轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 核心酶：能與DNA鏈結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，但沒(méi)有特異性，轉(zhuǎn)錄出來(lái)的可能不是一個(gè)完整的基因序列決定基因轉(zhuǎn)錄的特異性亞基 分子量 每分子酶中所含數(shù)目 功能 36512 2 150

5、618 1 與轉(zhuǎn)錄全過(guò)程有關(guān) 155613 1 結(jié)合DNA模板 70263 1 辨認(rèn)起始位點(diǎn)原核RNA聚合酶各個(gè)亞基的作用特 點(diǎn)1. 聚合速率慢，30-85NTP/秒2.缺乏外切酶活性,無(wú)校對(duì)功能，錯(cuò)誤率10-63.不同的因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子 4.可被藥物抑制（利福平） 人的RNA聚合酶對(duì)利福平不敏感。利用此特點(diǎn)可研制殺菌藥物 三、真核RNA聚合酶 真核較原核的酶復(fù)雜，已清楚的有RNA Pol,及Mt四型組成和功能：均由多亞基構(gòu)成，聚合酶主要負(fù)責(zé)mRNA的合成； Pol主要負(fù)責(zé)rRNA的合成； Pol主要負(fù)責(zé)tRNA和5srRNA的合成 三種RNA聚合酶對(duì)轉(zhuǎn)錄抑制劑鵝膏覃堿的敏感性反應(yīng)不同種類

6、 對(duì)鵝膏覃堿的反應(yīng) 耐受極敏感中度敏感 四、啟動(dòng)子與終止子（一）啟動(dòng)子 1、原核啟動(dòng)子：約55bp,分為起始點(diǎn)（start site）、結(jié)合部位、識(shí)別部位 起始點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄起始部位以+1表示，轉(zhuǎn)錄的第1個(gè)核苷酸常為嘌呤-G,A 結(jié)合部位：約6bp組成,是高度保守區(qū),共有序列為5-TATAAT-3,位于起始點(diǎn)上游-10。因Tm低,DNA易解開(kāi)雙鏈，為RNA聚合酶提供場(chǎng)所 識(shí)別部位：約6bp組成,在-35處,為高度保守區(qū),序列5-TTGACA-3, s因子識(shí)別此部位* -35和-10都是大致位點(diǎn) 啟動(dòng)子：RNA聚合酶結(jié)合DNA的部位，包括一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件TTGACA盒子TATA盒子啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)基因-1

7、0bp+1轉(zhuǎn)錄初級(jí)轉(zhuǎn)錄物RNA-35bp2、真核啟動(dòng)子結(jié)構(gòu) -25處含AT富集區(qū), 共有序列TATAA （TATA box） -70處含共有序列CAAT ,還含許多其它box ,例如:GC-box,E-box等含增強(qiáng)子(enhancer)和靜息子(silencer)RNA pol和 RNA pol與聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子差異較大（二）終止信號(hào) 特點(diǎn)：終止部位含GC富集區(qū)與AT富集區(qū),它們分別形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)和連續(xù)的U區(qū)，以終止轉(zhuǎn)錄 蛋白因子輔助識(shí)別終止信號(hào)，參與終止五、轉(zhuǎn)錄過(guò)程-轉(zhuǎn)錄起始1.RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合（亞基辨認(rèn)-35區(qū)）2.DNA雙鏈的打開(kāi)RNA pol （全酶移向-10區(qū)）3. R

8、NA鏈上合成第一個(gè)磷酸二酯鍵5-pppGpN-OH-3亞基脫落轉(zhuǎn)錄過(guò)程 (二）延長(zhǎng) 轉(zhuǎn)錄泡：是由DNA雙鏈,RNA聚合酶與新合成的轉(zhuǎn)錄本RNA局部形成的結(jié)構(gòu),它貫穿于延長(zhǎng)過(guò)程的始終 過(guò)程：在起始階段形成第一個(gè)磷酸二酯鍵后，RNA聚合酶核心酶沿模板向下游移動(dòng)，核苷酸之間以3,5磷酸二酯鍵相連，合成方向53，合成的RNA自3末端逐步延長(zhǎng)。合成出的RNA與DNA形成雜交分子,約12bp，因結(jié)合不緊很易脫離 RNA pol轉(zhuǎn)錄復(fù)合物：酶-DNA-RNA：轉(zhuǎn)錄空泡RNA（三）終止 合成移到終止信號(hào)時(shí),酶不滑動(dòng),聚合停止,轉(zhuǎn)錄完成 特點(diǎn)：因子參與的終止：r因子與RNA產(chǎn)物中富含C的部位結(jié)合,并誘使RNA聚

9、合酶構(gòu)象改變停止滑動(dòng); 因子的解螺旋酶活性,利于RNA產(chǎn)物的釋放（一）原核生物的轉(zhuǎn)錄終止1. 依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止2. 不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止因子1. 識(shí)別結(jié)合富含C的RNA鏈功能2. ATPase活性3. 解螺旋酶活性RNA 聚合酶因子附在RNA鏈上因子RNA 鏈形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止，因子利用ATP能滑行因子發(fā)揮解螺旋酶活性，解開(kāi)發(fā)夾和RNA-DNA依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止TOHAAAUUUOHUUUOH不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止四 真核生物轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)啟動(dòng)子復(fù)雜,某些基因不含TATA box，由起動(dòng)序列參與基本轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始 順式作用元件:真核生物中轉(zhuǎn)錄起始中起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的DNA序列 -35區(qū) 5

10、-TATA (TATA盒) -70-110區(qū) CAAT盒 GC盒（真核TATA序列的位置不像原核-35和-10那樣典型，某些真核生物基因也可以沒(méi)有TATA序列）轉(zhuǎn)錄因子與反式作用因子轉(zhuǎn)錄因子與反式作用因子: 調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白為轉(zhuǎn)錄因子；它們與特異的順式作用元件相互作用,并激活另一基因的轉(zhuǎn)錄TATATF II DTF II ATF II BRNA-pol II/TF II FTF II EPIC12345轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物結(jié)合順序真核轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止序列，在3端之后有共同序列AATAAA及多個(gè)GT序列，mRNA在轉(zhuǎn)錄終止序列處被切斷AATAAAGTGTGTG-AAUAAAGUGUGUGAAUAAAG

11、UGUGUG酶切加尾信號(hào)GC豐富序列AATAAAGTGTGTG- AAUAAAGUGUGUG酶切(繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，但5端沒(méi)有“帽子”，產(chǎn)物被降解）加尾轉(zhuǎn)錄后的加工原核RNA不需加工，邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯真核RNA需要加工rRNAtRNAmRNA5加帽3加尾 剪接在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行第三節(jié) 真核生物轉(zhuǎn)錄后的加工意義：轉(zhuǎn)錄生成的前體RNA,無(wú)生物學(xué)活性,需加工變?yōu)槌墒?、有活性的RNA 加工種類：剪切與剪接、末端添加核苷酸、修飾、RNA編輯一、mRNA前體的加工 （一）生成特點(diǎn)： 原核 ：mRNA是多順?lè)醋?polycistronic),每分子RNA中含幾種蛋白質(zhì)信息，RNA壽命短，轉(zhuǎn)錄沒(méi)完時(shí)翻譯即開(kāi)始 例:乳

12、糖操縱子，含Z,Y,A三個(gè)基因,分別編碼半乳糖苷酶、透過(guò)酶及乙酰基轉(zhuǎn)移酶 真核：?jiǎn)雾樂(lè)醋?一個(gè)mRNA僅編碼一種蛋白質(zhì) 外顯子: 在真核生物基因中編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子:非編碼蛋白的序列,因其插于外顯子之間又稱插入序列,居間序列 hnRNA: 為mRNA的前體,轉(zhuǎn)錄物中外顯子與內(nèi)含子間隔排列，需經(jīng)剪接加工后生成mRNA （二） mRNA前體加工過(guò)程 真核： 5末端帽子 部位：核內(nèi) 3端多聚A尾 部位：核內(nèi),胞質(zhì)有酶也可進(jìn)行 剪接作用 部位：胞核 甲基化(甲基化發(fā)生在剪接之前,在非編碼區(qū)分子中含1-2個(gè)m6A ) RNA編輯(某些mRNA的核苷酸序列,在生成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后還需插入、刪除或取代一些核

13、苷酸殘基,方能生成具有正確翻譯功能的模板,遺傳信息在mRNA水平上的改變過(guò)程，稱為RNA編輯) 原核：多順?lè)醋觤RNA在RNase作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閱为?dú)的順?lè)醋?加帽pi5pppG磷酸酶ppi5pGpppG5GpppG甲基化酶CH3mGpppGOHOH帽1帽0帽2NNNNOH2NCH3+OHHCH2HOPOPOPOPPPN1N2N3OOHOOHOOHOCH3OCH32OH79H甲基鳥(niǎo)苷5，5-三磷酸3加尾AAUAAAAAAAAAAAA.加尾AATAAAGTGTGTG-AAUAAAGUGUGUGAAUAAAGUGUGUG酶切轉(zhuǎn)錄的終止加尾信號(hào)GC豐富序列polyA尾（約20200個(gè)A）AAAAAA斷裂

14、基因：真核生物的基因由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相隔開(kāi)但又連續(xù)鑲嵌而成外顯子（exon): 基因中出現(xiàn)在mRNA的序列內(nèi)含子（intron）： 基因中不出現(xiàn)于mRNA而被剪接掉的序列核內(nèi)不均一RNA （hnRNA）：真核生物中編碼蛋白質(zhì)基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，包括5帽子、3poly(A)尾、外顯子、內(nèi)含子，經(jīng)剪接加工成為mRNA剪接剪接:在細(xì)胞核內(nèi), hnRNA剪切掉內(nèi)含子,將多個(gè)外顯子連接為成熟mRNA的過(guò)程為剪接 例:同一轉(zhuǎn)錄本, 在不同的組織, 因剪接差異產(chǎn)生各自不同的mRNA剪接的本質(zhì)：磷酸酯鍵的轉(zhuǎn)移剪接特點(diǎn) ：剪接部位的結(jié)構(gòu)為內(nèi)含子末端的特定序列，分布在內(nèi)含子的三個(gè)部位，5端剪切點(diǎn)為GU;3

15、端剪切點(diǎn)為AG；靠近3端含A序列的分支點(diǎn) mRNA的剪接： hnRNA被剪接體作用，剪除內(nèi)含子、連接外顯子，產(chǎn)生成熟的mRNA的過(guò)程外顯子內(nèi)含子DNAmRNA轉(zhuǎn)錄形成套索RNA，外顯子靠近剪接體去除套索RNA，外顯子連接成熟mRNAmRNA的剪接套索結(jié)構(gòu)外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子5端斷開(kāi)前一個(gè)外顯子的3末端攻擊下后個(gè)外顯子的5末端前后外顯子的連接二、tRNA前體的加工 1、切除多余的核苷酸：RNase p切除5 端多余的核苷酸；Rnase D切除3端多余的核苷酸2、剪切內(nèi)含子：核酸內(nèi)切酶切除內(nèi)含子,連接酶進(jìn)行連接3、修飾與3末端加-CCA: 修飾包括甲基化,脫氨基,還原反應(yīng)等，在核苷酸基轉(zhuǎn)移酶催化下完成3末端添加CCA tRNA的加工內(nèi)含子編碼區(qū)內(nèi)切核酸酶外切核酸酶PPP53-OH 3DNA內(nèi)含子初級(jí)轉(zhuǎn)錄物3端加CCA-OH3P 除去內(nèi)含子（內(nèi)切酶與連接酶）CCA-OH 3成熟 tRNA5CCA-OH內(nèi)含子5和3端的酶切3加上CCA去掉內(nèi)含子特異部位堿基的加工三、rRNA前體的加工 （一）特點(diǎn)： 1、rRNA拷貝多,原核5-10個(gè)拷貝;真核:果蠅260個(gè)拷貝;Hela細(xì)胞1