醫(yī)學(xué)專題協(xié)和-新藥藥代動力學(xué)研究

1、新藥藥代動力學(xué)研究中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所李燕2021/7/20 星期二1內(nèi)容提綱一. 藥代動力學(xué)研究內(nèi)容及意義二. 藥代動力學(xué)基本參數(shù)及房室模型分析三. 藥物的吸收、分布和排泄四. 藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)五. 藥代動力學(xué)與臨床用藥六. 藥代動力學(xué)在新藥開發(fā)中的應(yīng)用七. 藥代動力學(xué)研究原則及方法八. 研究實例2021/7/20 星期二2一. 藥代動力學(xué)研究內(nèi)容及意義1. 定義：機體對藥物的處置 (Drug metabolism and disposition)用數(shù)學(xué)公式定量地描述藥物在體內(nèi)的吸收, 分布, 排泄, 生物轉(zhuǎn)化(ADME)的動態(tài)過程。2.意義：指導(dǎo)新藥設(shè)計, 預(yù)示

2、人體內(nèi)規(guī)律，改進藥物劑型, 優(yōu)選給藥方案。3. 研究歷史1924年Widmark 和Tandberg 提出藥代動力學(xué)的分室概念和開放式室 模型。1937年-Teorell 提出開放式二室模型2021/7/20 星期二3二藥代動力學(xué)基本參數(shù)及房室模型分析生物半衰期（Half life, t1/2）: 藥物(血漿)在體內(nèi)消除半量所需的時間 0.693t1/2 = kel（消除速率常數(shù)）意義： 反映藥物自體內(nèi)的消除（生物轉(zhuǎn)化和排泄）的速度 反映消除器官的功能（肝、腎） 臨床確定給藥次數(shù)和間隔的依據(jù)2021/7/20 星期二4二藥代動力學(xué)基本參數(shù)及房室模型分析表觀分布容積 (Apparent volu

3、me of distribution, Vd)體內(nèi)藥量與血漿藥物濃度間相互關(guān)系的比例常數(shù), 即藥物分布在相等于其在血漿中的濃度時所占體液的體積, 不具備直接的生理意義，但可反映藥物分布的廣泛程度和組織的結(jié)合程度。A (體內(nèi)藥量) = Vd.C (血漿濃度)2021/7/20 星期二5二藥代動力學(xué)基本參數(shù)及房室模型分析體內(nèi)總清除率(Total body clearance, TBCL)單位時間內(nèi)從體內(nèi)清除的表觀分布容積部分, 與模型無關(guān)。TBCL = 代謝清除率 + 腎清除率(對藥物清除率得出正確估算的唯一常數(shù)) A(體內(nèi)藥量）TBCL = AUC（藥時曲線面積）2021/7/20 星期二6二藥

4、代動力學(xué)基本參數(shù)及房室模型分析血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）血藥濃度數(shù)據(jù)對時間作圖，所得曲線下的面積，用于絕對（F）和相對（Fr）生物利用度以及其他動力學(xué)參數(shù)的計算。2021/7/20 星期二7二藥代動力學(xué)基本參數(shù)及房室模型分析生物利用度（bioavailability）藥物以活性形式進入血液循環(huán)的速度和相對量，反映藥物的吸收程度。比較靜脈和口服給藥后血藥和尿藥濃度。 AUC oral如靜脈和口服給藥劑量相同，F(xiàn) = X100% AUC iv Div x AUCoral如靜脈和口服給藥劑量不相同，F(xiàn) = X100% Doral x AUCiv 2021/7/20 星期二8二藥代動力學(xué)基本參

5、數(shù)及房室模型分析平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度(Steady State, SS)在恒定給藥間隔重復(fù)給藥時，體內(nèi)藥物濃度和血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)，即任一劑量間隔內(nèi)的藥時曲線都相同（4-6個半衰期）。如服藥時間間隔短于半衰期，藥物易產(chǎn)生蓄積。 AUCCss = (兩次給藥相隔時間)當(dāng)藥物全部吸收時，如hr，可按每日給藥一次。 2021/7/20 星期二28五. 藥代動力學(xué)與臨床用藥3. 給藥途徑和劑型與吸收速率、生物利用度密切相關(guān)(1)口服：肝首過效應(yīng)、腸破壞（胰島素、催產(chǎn)素）、不吸收、吸收緩慢不規(guī)則，胃腸道局部用藥（抗酸藥、瀉藥、驅(qū)蟲藥），Cytochrome P4503A 與 P糖蛋白（glucoprotein

6、）相互作用*藥物被動擴散進入吸收細(xì)胞后的細(xì)胞-腸腔循環(huán)a. 被P糖蛋白泵回腸道 b. 被吸收細(xì)胞中CYP3A代謝 c. 吸收進入門靜脈結(jié)果：代謝增加，原型藥排出機率增加2021/7/20 星期二29五. 藥代動力學(xué)與臨床用藥P-gp屬于ABC（ATP-binding cassette transporter）轉(zhuǎn)運蛋白超家族。主要功能為依賴ATP提供能量，將細(xì)胞內(nèi)的有毒物質(zhì)（包括藥物）轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，底物范圍較廣。體內(nèi)分布廣泛，腸道細(xì)胞高表達(dá)。P4503A為含量最高的同工酶，參與80臨床藥物代謝，易被誘導(dǎo)。P-gp和 P450 3A對腸道吸收的聯(lián)合作用2021/7/20 星期二30五. 藥代動力學(xué)

7、與臨床用藥2021/7/20 星期二31五. 藥代動力學(xué)與臨床用藥(2) 舌下給藥：黏膜吸收快，避免消化酶和酸鹼的破壞以及肝代謝的影響（硝酸甘油）。(3) 直腸給藥：避免胃腸破壞和消化道反應(yīng)（抗菌素、復(fù)方咳喘寧）(4) 注射給藥（皮下、肌內(nèi)、靜脈）：吸收迅速，避免胃腸破壞。(5) 吸入給藥：氣體、氣霧、揮發(fā)性藥物肺部吸收快（肺泡總面積90 m2）,吸收速率僅次于靜脈注射。(6) 局部用藥：皮膚黏膜、離子透入、椎管內(nèi)等。(7) 劑型： 藥物的制劑可因配方和制造工藝不同而影響其生物利用度(片劑的崩解度、溶解度等)，同一藥物的不同劑型在給藥途徑、吸收速度、穩(wěn)定性也不同。2021/7/20 星期二32

8、五. 藥代動力學(xué)與臨床用藥4. 臨床用藥個體化由于個體差異或病理狀態(tài)需根據(jù)血藥濃度指導(dǎo)用藥，結(jié)合臨床觀察制訂合理的給藥方案。(1)治療指數(shù)低（安全范圍窄）的藥物：如強心甙、抗心率失常藥(2)胃腸道或心、肝、腎功能損害(3)長期用藥或合并用藥者(4)藥物的中毒癥狀容易與疾病本身癥狀相混淆者(5)臨床效果不宜很快被察覺者(6)藥物屬于零級動力學(xué)(7)診斷和處理過量中毒者(8)新藥的合理給藥方案2021/7/20 星期二33六. 在新藥開發(fā)中的作用(Discovery and Development) 新藥研究藥物設(shè)計新藥開發(fā)設(shè)計先導(dǎo)物和結(jié)構(gòu)改造侯選物藥效和毒性評價2021/7/20 星期二34（一

9、）先導(dǎo)物藥代特性評價的意義1.滿足臨床醫(yī)療的特殊需要2. 具備藥理活性和/ 或安全性的優(yōu)勢（明顯提高作用強度和選擇性或作用機制新穎）3. 理想的藥代動力學(xué)和/或代謝特性理想新藥的特點2021/7/20 星期二35（一）先導(dǎo)物藥代特性評價的意義新藥開發(fā)現(xiàn)狀2021/7/20 星期二36（一）先導(dǎo)物藥代特性評價的意義失敗原因發(fā)生率（）藥代動力學(xué) 40 (18)療效弱/無 30 (14)動物毒性 11 (36)臨床不良反應(yīng) 10 (7)商業(yè)原因 5 (12)其他 4 (13) PMA/FDA Preclinical Meeting 1991/MRL1992-2001新藥開發(fā)失敗原因2021/7/20

10、 星期二37（一）先導(dǎo)物藥代特性評價的意義藥物藥物相互作用個體差異P450基因多態(tài)性對代謝的影響依賴P450生成的活性代謝產(chǎn)物安全性和審批要求市場競爭避免治療藥物的監(jiān)測和基因分型和特殊警告2021/7/20 星期二38（一）先導(dǎo)物藥代特性評價的意義AbsorptionDistributionMetabolismExcretion Human dosing regimen Efficacy/saftey Drug-drug interaction2021/7/20 星期二39（一）先導(dǎo)物藥代特性評價的意義水溶性好（注射液劑型/口服吸收）符合預(yù)計給藥途徑和次數(shù)的線性藥代動力學(xué)（PK）均衡清除（原型

11、藥的腎臟和膽汁分泌，數(shù)目有限的代謝產(chǎn)物無活性/最小種屬差異）經(jīng)多個藥物代謝酶催化的氧化代謝氧化代謝不主要依賴P450表達(dá)的多態(tài)性無化學(xué)活性代謝產(chǎn)物（毒性?)最小CYP/P-gP的抑制作用（可逆、作用機制要求）最小藥物代謝酶的誘導(dǎo)作用一定的首過效應(yīng)（最佳口服生物利用度）適當(dāng)?shù)难獫{蛋白結(jié)合（90）較寬的治療指數(shù)（劑量小，作用強）理想的藥代特性2021/7/20 星期二40（一）先導(dǎo)物藥代特性評價的意義藥物設(shè)計針對特定靶點設(shè)計先導(dǎo)物對先導(dǎo)物進行結(jié)構(gòu)改造* 針對先導(dǎo)物的代謝特性進行 結(jié)構(gòu)改造(過快，或生成毒性代謝物)* 合成有效代謝物或模擬有效代謝物合成新侯選物新藥開發(fā)侯選物藥效和毒性評價* 體外侯選

12、物代謝特性快速評價* 體內(nèi)代謝以推斷人體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化模式2021/7/20 星期二41（一）先導(dǎo)物藥代特性評價的意義1. 對先導(dǎo)藥物進行化學(xué)改造， 改善藥理作用，降低毒性 (1)在體內(nèi)不代謝或僅經(jīng)水解酶代謝的藥物設(shè)計 P-C-P 代替 P-O-P 骨吸收抑制劑 焦磷酸 雙磷酸鹽 (bisphosphonates) (到達(dá)病變部位前水解失活) （活性相似， 但不代謝，經(jīng)腎排泄）特點:*不經(jīng)P450進行生物轉(zhuǎn)化， 避免活性代謝物生成以降低毒性。* 安全， 無顯著的系統(tǒng)毒性。* 藥酶種類繁多， 底物廣泛， 化合物難找。2021/7/20 星期二42 (2) 對藥物分子進行結(jié)構(gòu)修飾，防止其失活 巰基保

13、護 6- 巰基嘌呤(6-mercaptopurine) 巰唑嘌呤(azathioprin) （氧化脫硫而失效） （保持療效） 2. 合成有效代謝物或模擬有效代謝物， 以獲得新的侯選物 O-deethylation Phenacetin Paracetamol（高鐵血紅蛋白血癥） （作用更強，規(guī)定劑量內(nèi)安全） glucoronidation Morphine Morphine-6-glucuronnide特點：*代謝物有活性*與II相酶結(jié)合排出體外，安全性比原型藥高。（一）先導(dǎo)物藥代特性評價的意義2021/7/20 星期二43（一）先導(dǎo)物藥代特性評價的意義 組合化學(xué) +計算機輔助設(shè)計 + 天然產(chǎn)

14、物的快速分離 樣品庫體外藥物篩選靶點HTS自動化微量分析技術(shù)（ GC/LC-MS/NMR 、熒光、同位素標(biāo)記等)2021/7/20 星期二44（二）體外藥代特性評價藥物吸收和轉(zhuǎn)運溶解度和滲透性A. Caco -2 單層細(xì)胞培養(yǎng)（攝取和轉(zhuǎn)運）HBSS containing drug and P-gp inhibitor APMonolayer Caco-2 cellsBL2021/7/20 星期二45（二）體外藥代特性評價Bicyclol uptaken in Caco-2 cells in the presence and absence of verapamil and CsA Unit:

15、ng/mg protein (* P0.05,* P0.001 compared with control)2021/7/20 星期二46（二）體外藥代特性評價B. 人工磷脂雙層膜（96孔板）2. 藥物分布血腦屏障原代牛腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)（BMEC，P-gP高表達(dá)) / MDCK 評價中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥的作用特點評價非中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥的潛在不良反應(yīng)2021/7/20 星期二47（二）體外藥代特性評價 CellSpecies/tissue originCell typeCaco-2HT-29T-84MDCKIILLC-PK1Human/colonHuman/colonHuman/colonCanin

16、e/kidneyPorcine/kidneyepithelialepithelialepithelialepithelialepithelial常用評價腸道轉(zhuǎn)運細(xì)胞模型 (Ho et al., 2000)2021/7/20 星期二48（二）體外藥代特性評價3. 參與代謝的藥酶類型細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450)藥物代謝轉(zhuǎn)移酶N-乙?；D(zhuǎn)移酶 (N-acetyltransferase)甲基轉(zhuǎn)移酶 (methyltransferase) 尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶 (UDPGT)磺基轉(zhuǎn)移酶 (sulfotransferase)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶 (GST)酯酶乙酰膽堿酯酶 (

17、cholinesterase)對氧磷酸/芳香酯酶 (A-esterases)脫氫酶乙醇脫氫酶 (ALD)乙醛脫氫酶 (ALDH)氧化還原酶單胺還原酶 (monoamine oxidase)超氧化物歧化酶 (superoxidase)過氧化氫酶 (catalase)2021/7/20 星期二49（二）體外藥代特性評價Cytochrome P450s的分類和命名FamilySubfamilySpecies trivial name ( ref)P450 12 1A1, 1A2 (Man, mouse, rabbit, fish) P450 28 2A1-3, 2B1-10, 2C1-15, 2D1

18、-9, 2E1-2 2F1, 2G1, 2H1 (Rat, human, mouse, chicken) P450 31 3A1-6 (Rat, human, rabbit) P450 42 4A1-7, 4B1 (Rat, rabbit, human)2021/7/20 星期二50（二）體外藥代特性評價 目的：確定藥物代謝途徑及相關(guān)酶 CYP 3A4 特非那定(terfenadine) C- 脫烷基化 N- 羥基化 4-羥基化 美芬妥英(mephenytoin) R-美芬妥英 CYP2C11 S-美芬妥英 CYP3A1/2 CYP1A2 米帕明(mipramine) 甲基化反應(yīng) CYP3A4

19、 *在代謝過程中, 一種酶催化多種反應(yīng), 多種酶催化一種反應(yīng) 2021/7/20 星期二51（二）體外藥代特性評價體外模型肝細(xì)胞原代培養(yǎng)（動物和人）HepG2 細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞）肝切片 (接近整體器官）亞細(xì)胞組分(微粒體、胞漿）P450s高表達(dá)系統(tǒng)（人源）P450s體外重組系統(tǒng)2021/7/20 星期二52（二）體外藥代特性評價Correlation of Bicyclol metabolic rates with cytochrome P450 3A activities in untreated and induced rat liver microsomes2021/7/20 星期二53

20、（二）體外藥代特性評價Kinetic parameters of Bicyclol metabolism in rats (untreated, DEX induced)and humans liver microsomes2021/7/20 星期二54（二）體外藥代特性評價4. 藥酶的誘導(dǎo)和抑制(1) 藥酶抑制作用 (CYP1A, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 3A)藥物相互作用的主要原因，是評價新藥進入開發(fā)的重要指標(biāo)。對單個酶的影響（熒光法，LC-MS-MS等)判斷直接抑制/代謝后產(chǎn)生、可逆/不可逆共價結(jié)合。 （CYP450s酶促動力學(xué)參數(shù)分析，增加反應(yīng)時間、稀釋底物等）強抑制

21、劑 IC50 1 um中等抑制劑 1 um IC50 10 um 弱抑制劑 IC50 500，結(jié)構(gòu)中羥基和 / 或氨基的總數(shù)5,氧和氮原子數(shù)10Lop P5特點：不需生物學(xué)實驗，但需要龐大的結(jié)構(gòu)分析 的信息庫工作軟件。2.底物作用部位CYP450 2B, 2C9, 2C19, 2D6, 3A的分子模型，主要用于藥物設(shè)計。2021/7/20 星期二60先導(dǎo)物藥代特性評價進展 Drug Metabolism Core TechnologiesAutomationBiological ToolsIn silico methods Labeled compoundsAssay (LC-MS, UV,

22、FluorescenceEnzymes/receptors(native/mutated)AntibodiesCell and subcellular modelsAnimal models(transgenic)Models(homology/pharmacophoreProtein crystal structure(2C5)Radio labels (C-14, H-3, S-35)Deuterium (N15, C-13)Metabolites and parent drug2021/7/20 星期二61七.藥代動力學(xué)研究原則及方法（化學(xué)藥品） 1.生物藥品檢測方法學(xué)的建立特異性好，

23、靈敏度高(1)化學(xué)分析：HPLC, GC, GC-MS, LC-MS(2)同位素分析：同位素標(biāo)記物（放射性和穩(wěn)定性）(3)生物學(xué)分析：微生物法，盡可能用色譜法平行檢查2021/7/20 星期二62七.藥代動力學(xué)研究原則及方法（化學(xué)藥品）基本要求：靈敏度（sensitivity）用最低檢測限或定量限表示(Limit of quantitation), 標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度，3-5個消除半衰期后或Cmax的1/10-1/20的血藥濃度。特異性（specificity）證明所測物質(zhì)是原型藥或代謝產(chǎn)物，可消除內(nèi)源性物質(zhì)、其他代謝物和雜質(zhì)的干擾。（如標(biāo)準(zhǔn)、空白、外加樣品和用藥后樣品的色譜圖）精密度(pr

24、ecision) 用日間和日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deivation, RSD%）表示。標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)的高（上限）、中、低（接近LOQ）三個濃度（5個/每個濃度），求出各自的RSD%（ng/ml 15%, ug/ml 15%）準(zhǔn)確度（accuracy）用相對回收率（recovery）表示。標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)高、中、低三個濃度， n = 5標(biāo)準(zhǔn)曲線（standard curve）在不同生物樣品中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每條曲線五個濃度，覆蓋整個生物樣品的測定范圍，提供線形方程和相關(guān)系數(shù)（色譜法0.99, 生物學(xué)0.99）2021/7/20 星期二63七.藥代動力學(xué)研究原則及方法（化學(xué)藥品）研

25、究內(nèi)容1. 血藥濃度-時間曲線取樣點：9-13個，兼顧吸收相（2-3）、達(dá)峰濃度（2-3）、分布相（2-3）、消除相（3-4）采樣時間：持續(xù)3-5個半衰期或Cmax的1/10 1/20動物：連續(xù)采樣至少 3只，非連續(xù)至少5 只，口服給藥應(yīng)禁食12小時以上。給藥途徑： 盡可能與臨床用藥一致實驗劑量： 三個劑量組，其中一個劑量相當(dāng)于藥效學(xué)有效劑量，高劑量 接近于最大耐受劑量藥代參數(shù)：（3P97） 靜脈給藥 - t1/2,Vd, AUC, CL等血管外給藥 - Cmax, Tmax, t1/2, AUC等水溶性藥物 -應(yīng)提供血管外給藥的絕對生物利用度2021/7/20 星期二64七.藥代動力學(xué)研究原

26、則及方法（化學(xué)藥品）2. 組織分布了解藥物在體內(nèi)的主要分布組織，尤其是靶器官和毒性靶器官的分布。動物：小鼠或大鼠，每個時間點5只動物。劑量：選擇一個有效劑量時間點：吸收相、分布相、消除相各選一個時間點取樣器官：心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、子宮或睪丸、肌肉、脂肪等2021/7/20 星期二65七.藥代動力學(xué)研究原則及方法（化學(xué)藥品）3. 血漿蛋白結(jié)合方法：平衡透析、超濾、分配平衡等濃度：3個（包括有效濃度），每個濃度重復(fù)三次。4. 排泄 確定藥物的排泄途徑、排泄速率和各途徑的排泄量動物：小鼠或大鼠，至少5只動物數(shù)據(jù)劑量：選擇一個有效劑量樣品收集：分段收集尿液，糞便、膽汁，記錄體積或重量，測定

27、 排泄量。5. 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化 創(chuàng)新藥要了解體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化，闡明主要代謝物的結(jié)構(gòu)和代謝途徑、轉(zhuǎn)化量，活性代謝產(chǎn)物（藥理或毒理）要作動力學(xué)分析。2021/7/20 星期二66實例1TPA 藥代動力學(xué)研究（iv)2021/7/20 星期二67實例1- TPA藥代動力學(xué)參數(shù)2021/7/20 星期二68實例1TPA組織分布2021/7/20 星期二69實例1TPA排泄2021/7/20 星期二70實例2 XLF-343 藥代動力學(xué)研究（po)2021/7/20 星期二71實例2 XLF-343 藥代動力學(xué)研究（po)2021/7/20 星期二72Pharmacokinetic parameters of n

28、icousamide in male and female rats after a single intravenous dose of 10mg/kg Compartment modelNon-compartment modelParameterUnitFemaleMaleParameterUnitFemaleMaleAUC(0-t) mg/L*h31.53183.96AUC(0-t) mg/L*h34.02181.50AUC(0-) mg/L*h37.58191.47AUC(0-) mg/L*h34.41183.45CLL/h/kg 0.270.05CLzL/h/kg0.290.06VL

29、/kg0.090.06VzL/kg1.040.15T1/2h2.752.07MRT(0-t) h 1.282.392021/7/20 星期二73Plasma concentration-time profiles of nicousamide in male and female dogs after a single oral dosing (300mg/kg).2021/7/20 星期二74Pharmacokinetic parameters of nicousamide in male and female dogs after single oral dosingParameterUn

30、itFemaleMale30mg/kg100mg/kg300mg/kg30mg/kg100mg/kg300mg/kgAUC(0-t) ug/L*h46.7 355.11176.4107.6 430.71130.5 MRT(0-t) h 1.63.212.81.44.312.1Tmax h 0.60.7 0.6 0.31.8 1.6 Cmax ug/L 33.5158.3110.2123.5151.6136.72021/7/20 星期二75Comparison on pharmacokinetic parameters of nicousamide in male and female dogs

31、 after a single and multiple dose of 100mg/kg ParameterUnitFemaleMaleSingleMultipleSingleMultipleAUC(0-t) ug/L*h355.11916.8430.71874.3MRT(0-t) h 3.210.24.310.2Tmax h 0.7 0.51.8 0.7Cmax ug/L 158.3205.4151.6184.0Cmultiple/single-1.36-1.27AUCmultiple/single-5.45-4.262021/7/20 星期二76Tissue distribution p

32、rofiles of nicousamide in male rats after a single oral dosing (30mg/kg, n=5). 實例2 XLF-343 藥代動力學(xué)研究（po)2021/7/20 星期二77實例2 XLF-343 藥代動力學(xué)研究（po)Excretion of nicousamide in rats after a single oral dosing ( 30mg/kg)2021/7/20 星期二78Study of the metabolic pathwayV(nmol/min/mgP)ControlEffect of CYP450 inhibi

33、tors on nicousamide metabolism in rat microsomes. 2021/7/20 星期二79NADPH-cytochrome c reductaseCYP450Xanthine oxidase DTDCytochrome b5 reductaseLiver microsomesStudy of the metabolic pathway2-AMPPTUDicoumarol Allopurinol NADPHNADH-2-AMP +2-AMP-PTU +PTU% of reduced nicousamide% of reduced nicousamideno