第1部分概述第2部分血脂脂蛋白及載脂蛋白測定

1、第1部分概述第2部分血脂脂蛋白及載脂蛋白測定一、血脂和血漿脂蛋白 自學(xué)二、脂蛋白代謝紊亂 （一）高脂蛋白血癥 血脂含量超過正常稱為高脂血癥，由于血脂均以血漿脂蛋白的形式存在，故也稱為高脂蛋白血癥。按發(fā)病原因分為兩大類。 1.按表型分類 以Fredrickson（1967）分類法為基礎(chǔ)，經(jīng)WHO（1970）修訂的分類系統(tǒng)，根據(jù)血清TC、TG、外觀和脂蛋白電泳圖譜，將其分為6型。第一節(jié) 概 述 （1）型高脂蛋白血癥 又稱高乳糜微粒血癥。是一種常染色體隱性遺傳病。由于LPL缺損或LPL活化因子（ApoC）缺損所致。嬰兒期即可發(fā)生，但罕見。其生化檢查特征： 4冷置試驗，血清上層為奶油狀，下層清亮。 血

2、清TG，達11mmol/L以上，血清TC正?；蜉p度。 血清LPL活性。 血清脂蛋白電泳，CM。 （2）a高脂蛋白血癥 又稱高-脂蛋白血癥或高膽固醇血癥。屬常染色體顯性遺傳，有明顯的家族史。病因LPL受體缺損，雜合子型發(fā)生頻率為1/500，純合子型發(fā)生頻率為1/100000。其生化檢查特征： 4冷置試驗，血清外觀清亮透明。 血清TC，15.6mmol/L尤其是LDL-C，TG正常。 血清脂蛋白電泳，-LP。 臨床表現(xiàn)，中青年常伴有冠狀動脈硬化，結(jié)局為心肌梗塞。 （3）b型高脂蛋白血癥 在a型基礎(chǔ)上伴有VLDL（高LDL+VLDL血癥），病因不明。其生化檢查特征： 4冷置試驗，血清外觀清亮或微混。

3、 血清TC，TG。 血清脂蛋白電泳，-LP，pre-LP。 （4）型高脂蛋白血癥 又稱寬-脂蛋白血癥。屬常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率1/10000，病因，ApoE異常，與相應(yīng)受體結(jié)合率。其生化檢查特征： 4冷置試驗，血清外觀混濁，后形成蠟樣黃色薄膜。 血清TC，TG。 血清脂蛋白電泳，-LP，pre-LP，IDL。融合形成寬區(qū)帶。 （5）型高脂蛋白血癥 又稱高前-脂蛋白血癥或家族性高甘油三脂血癥。屬常染色體顯性遺傳病，較常見，我國原發(fā)性高脂蛋白血癥中一半屬于此型。病因，ApoA2異常。其生化檢查特征： 4冷置試驗，血清外觀混濁。 血清TG，TC正?；蛏?。 血清脂蛋白電泳，pre-LP。 臨床表現(xiàn)

4、，多見于中年人易發(fā)生冠心病。 （6）型高脂蛋白血癥 屬常染色體顯性遺傳病，病因不詳，可能由幾種遺傳缺陷所致，較罕見。生化檢查特征： 4冷置試驗，血清上層為奶油狀，下層混濁。 血清TG，TC。 血清脂蛋白電泳，CM，pre-LP。 2.按是否繼發(fā)于全身性疾病分類 分為原發(fā)性和繼發(fā)性高脂血癥。常繼發(fā)于糖尿病、肝病、腎病、肥胖以及過量飲酒，成人發(fā)病率為3%5%。 3.高脂血癥的基因分型法 一部分高脂血癥患者存在單一或多個遺傳基因的缺陷，具有明顯的家族聚集性，有明顯的遺傳傾向。 （二）低脂蛋白血癥 主要有四種類型 1.低LDL血癥 是一種常染色體顯性遺傳病，病因ApoB100低下，血漿LDL減少，TC

5、。 2.無LDL血癥 罕見的常染色體隱性遺傳病，病因ApoB100、B48缺損，血漿中無LDL，TC。 3.低HDL血癥 病因不詳，血清TG，動脈粥樣硬化、冠心病的發(fā)病率高。 4.無HDL血癥（Tangier?。┖币姷某Ｈ旧w隱性遺傳病，ApoA、A缺損，血漿TC，HDL-C。 血脂測定方法很多，目前臨床實驗室基本檢驗項目有：血清外觀分析，TC，TG，HDL-C，LDL-C測定。進一步可做HDL亞組分，IDL，Apo（如ApoA、ApoB100），Lp（a）及脂蛋白電泳，LPL，LCAT測定，為保證分析結(jié)果的可靠性，標(biāo)本的采集應(yīng)在餐后12h以上。第二節(jié)血脂、脂蛋白及載脂蛋白測定一、血清外觀分析

6、（血清冷置試驗） 混濁（TG增高）下層濁（VLDL增高）型下層清（VLDL正常）型均勻混濁（VLDL）TC正常 型上層奶油樣（CM）TC增高 a型TC正常 正常人清亮（TG正常）TC b，型空腹血清 測TC 4過夜 測TC二、血清總膽固醇測定 膽固醇是人體重要的脂類成分，具有重要的生理功能，如合成類固醇激素，維生素D3膽汁酸，并構(gòu)成細胞膜成分，TC包括FC（1/3）和CE（2/3），膽固醇與動脈粥樣硬化有密切關(guān)系，故膽固醇測定是最常用的實驗室檢測項目之一。 TC測定方法很多，約200多種，分為化學(xué)測定法、酶法、氣相色譜法、高效液相色譜法、核素稀釋質(zhì)譜法（決定性方法）。 （一）化學(xué)測定法 主要有

7、兩類 1.Liberman-Burchard反應(yīng) 簡稱L-B反應(yīng)，膽固醇經(jīng)冰醋酸，濃硫酸脫水生成3.5-膽烷二烯陽離子，然后被醋酐，濃硫酸氧化生成綠色的膽烷六烯磺酸。呈色穩(wěn)定性差。 2.Zak反應(yīng) 膽固醇經(jīng)冰醋酸，濃硫酸脫水生成3.5-膽烷二烯陽離子，然后在Fe3+存在下氧化生成紫紅色膽烷四烯陽離子，靈敏度較L-B反應(yīng)高7倍，且呈色穩(wěn)定性好，但試劑腐蝕性極大，不能用于自動化分析。 （二）酶法膽固醇酯 膽固醇 脂肪酸膽固醇 O2 膽烷-4-烯-3酮 H2O2H2O2 4AAP 酚 紅色亞胺醌 H2OCEHChODPOD 試劑中除上述三種酶外，還有膽酸鈉和表面活性劑及穩(wěn)定劑，膽酸鈉用于激活CEH，

8、表面活性劑促進膽固醇從脂蛋白中釋放。 酶法操作簡便，快速，試劑無腐蝕性，適合于自動化分析，但也存在有一些不足，CEH對膽固醇水解不完全，表面活性劑影響CEH活性，黃疸血清中過高的膽紅素可還原H2O2使結(jié)果偏低。 【參考范圍】3.105.70mmol/L 【臨床意義】血清TC含量受年齡、性別、飲食和運動等因素的影響。20歲以上隨年齡而，70歲以后則有下降趨勢。2040歲階段男性高于女性，但女性絕經(jīng)后則高于男性。城市人群高于農(nóng)村人群，與飲食和運動有關(guān)。腦力勞動者高于體力勞動者。 病理性高膽固醇血癥 原發(fā)性高膽固醇血癥，糖尿病、膽道阻塞、腎病綜合癥、甲狀腺功能減退。 病理性低膽固醇血癥 嚴重貧血、甲

9、亢、營養(yǎng)不良。 三、血清甘油三脂測定 TG是有一分子甘油與三分子脂肪酸組成的化合物，主要存在于VLDL和CM中，臨床化學(xué)中往往以測定甘油代表TG的含量。TG的測定方法很多，如氣相色譜法、高效液相色譜法、紅外分光光度法。但上述方法需特殊的儀器設(shè)備和技術(shù)，故一般只用于研究工作中。臨床實驗室主要用化學(xué)法和酶法。 （一）化學(xué)法 基本步驟可歸納為四步 1.提?。焊视腿奶崛?采用合適的溶劑，使脂蛋白變性提取TG，同時去除干擾物質(zhì)(磷脂、游離甘油、葡萄糖等),常用方法有： （1）異丙醇抽提，沸石合劑（沸石、高嶺土）吸附。 （2）異丙醇抽提，氧化鋁吸附磷脂。 （3）正壬烷、異丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附

10、磷脂的操作，后用價廉的正庚烷代替正壬烷。應(yīng)用較廣。 2.皂化：甘油三脂的水解 一般都采用KOH乙醇或KOH異丙醇溶液，60，515min可使TG完全水解。 3.氧化：甘油的氧化 最常用的氧化劑是HIO4，甘油在酸性條件下被氧化成甲醛、甲酸。反應(yīng)受-磷酸甘油、葡萄糖、絲氨酸的干擾，故抽提時應(yīng)盡量除去此類物質(zhì)的干擾。 4.顯色：顯色測定甲醛。常用方法有： （1）甲醛與變色酸（4.5-二羥-2.7-萘二磺酸）在硫酸溶液中加熱生成紫紅色化合物。（570nm） （2）甲醛與乙酰丙酮在氨的存在下縮合成黃色的3.5-二乙酰-1.4-二氫-2.6-二甲基吡啶。（420nm） （二）酶法 常用的有：1.磷酸甘油

11、氧化酶法（GK-GPOD-POD法） TG H2O 甘油 FA 甘油 ATP 3-磷酸甘油 ADP 3-磷酸甘油 O2 磷酸二羥丙酮 H2O2 H2O2 4-AAP 酚 紅色亞胺醌 H2O 試劑較穩(wěn)定，靈敏度高，線性范圍寬，膽紅素、維生素C可消耗H2O2使結(jié)果偏低。LPLGK GPOD POD 2.乳酸脫氫酶法（GK-PK-LDH 法）TG H2O 甘油 FA甘油 ATP 3-磷酸甘油 ADPADP 磷酸烯醇式丙酮酸 ATP 丙酮酸 丙酮酸 NADHH+ 乳酸 NAD+ 3.甘油氧化酶法第一步消除血清中原有的甘油： LPLGPODPKLDH 游離甘油 O2 甘油醛 H2O2GlyODH2O2

12、EMAE 無色物質(zhì) EMAE稱N-乙基-N-（3-甲基）-N-乙酰乙二胺。是一種還原劑，靈敏度比酚高。第二步測定甘油三脂水解釋放的甘油：TG H2O 甘油 FA甘油 O2 甘油醛 H2O2 H2O2 4-AAP EMAE 有色化合物 POD GlyODLPL POD 【參考范圍】0.561.70mmol/L 【臨床意義】血清TG一般隨年齡增長而升高，體重超標(biāo)者往往偏高。 1.病理性增高 原發(fā)性高脂蛋白血癥、肥胖癥、糖尿病、腎病綜合癥、脂肪肝、妊娠后期。 2.病理性降低 甲亢、腎上腺皮質(zhì)功能減退、嚴重肝功能損傷。 四、血清（漿）脂蛋白測定 （一）血清脂蛋白電泳 臨床實驗室常用的支持介質(zhì)有醋酸纖維

13、薄膜和瓊脂糖凝膠。 1. 血清脂蛋白醋酸纖維薄膜電泳 以醋酸纖維薄膜為支持介質(zhì)，血清脂蛋白經(jīng)電泳分離，然后用臭氧氧化，使脂蛋白中的不飽和脂肪酸的雙鍵斷裂生成醛，再用亞硫酸品紅染色，即生成紫紅色區(qū)帶。 2. 血清脂蛋白預(yù)染瓊脂糖電泳 血清脂蛋白經(jīng)飽和蘇丹黑B預(yù)染后，以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)，進行電泳分離，即可得到清晰的蘭色區(qū)帶。 凝膠濃度一般為0.5%，超過1%，-Lp與pre-Lp不易分開，0.5%，凝膠機械強度太低。 血清：染料為9：1，染料過多稀釋標(biāo)本，而且染料中乙醇會引起蛋白質(zhì)變性，影響分離效果。 結(jié)果判斷，直觀區(qū)帶的著色深淺，寬窄，用淺染，稍淺染，深染及消失加以描述；或用光密度掃描儀測定

14、。 【參考范圍】 -Lp 30%40% pre-Lp 13%25% -Lp 50%60% CM （） （二）血清高密度脂蛋白測定 常以測定HDL-C含量代表HDL水平。測定步驟包括HDL的分離；測定HDL中膽固醇。 HDL的分離方法有：超速離心法、凝膠過濾法、免疫化學(xué)法、電泳法、沉淀法。臨床實驗室常用沉淀法。沉淀劑一般為二價陰離子和多價陰離子。如：肝素-Mg2+、硫酸葡聚糖- Mg2+、磷鎢酸- Mg2+、聚乙二醇（PEG）等。 如：磷鎢酸- Mg2+選擇性地沉淀血清中的LDL和VLDL，經(jīng)離心上清液中保留HDL，然后用酶法測定上清液中的膽固醇含量，即代表HDL中的膽固醇。 【參考范圍】男 1

15、.280.33mmol/L 女 1.370.33mmol/L 【臨床意義】HDL-C與冠心病發(fā)病呈負相關(guān)，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病危險因素。（三）血清高密度脂蛋白亞組分測定 HDL有三個亞類（HDL1、HDL2、HDL3）最近的研究工作表明，HDL2亞類與冠心病危險度的相關(guān)程度比總HDL-C更密切。 HDL2 d = 1.0631.125g/ml HDL3 d = 1.1251.210g/ml HDL2脂類60% 蛋白質(zhì)40% ；HDL3脂類45% 蛋白質(zhì)55% 高密度脂蛋白亞組分的分析方法有超速離心法、柱層析法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、多價陰離子分級沉淀法。 其中多價陰離子分級

16、沉淀法具有快速、經(jīng)濟、簡便更為實用，是目前臨床實驗室最常用的方法。常用的沉淀劑有硫酸葡聚糖- Mg2+、聚乙二醇（PEG）。 【原理】用PEG做沉淀劑，以不同濃度的PEG在不同pH條件下分別將VLDL和LDL（沉淀劑 95g/L PEG，pH6.5）HDL2（沉淀劑 170g/L PEG，pH7.5）沉淀，上清液中只含有HDL（沉淀劑）和HDL3（沉淀劑），然后用酶法測定HDL-C和HDL3-C，并以HDL-C減去HDL3-C的差即為HDL2-C的含量。 【參考范圍】 HDL2-C 男 0.530.17mmol/L 女 0.620.22mmol/L HDL3-C 男 0.750.17mmol/

17、L 女 0.750.16mmol/L （四）低密度脂蛋白測定 低密度脂蛋白水平通常以LDL-C含量表示。LDL-C測定方法很多，常用的有： 1. Friedewald公式法 LDL-C TCHDL-C 式中的濃度單位是mmol/L，在一般情況下能得到可被臨床接受的近似結(jié)果，但TG4.25mmol/L時不能應(yīng)用此公式計算，否則結(jié)果偏差太大。TG2.2 2.聚乙烯硫酸鹽沉淀法 聚乙烯硫酸（PVS）能選擇性沉淀血清中LDL，再以血清TC減去上清液（含HDL和VLDL）膽固醇，即得LDL-C值。試劑中加入EDTA去除兩價陽離子，避免VLDL共沉，輔以聚乙二醇獨甲醚（PEGME）可加速沉淀。 3.直接測

18、定法 勻相的LDL-C直接測定法是以不同的表面活性劑的雙試劑使非LDL-C與LDL-C分兩步水解，因先消除非LDL-C，故也稱為消除法。 【參考范圍】LDL-C3.12mmol/L 【臨床意義】LDL-C增高是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要危險因素。 （五）脂蛋白（a）測定 脂蛋白(a)是由載脂蛋白(a)與載脂蛋白B100通過二硫鍵連接所形成的特殊蛋白。脂蛋白(a)測定的方法目前常用的是ELISA法。 血清中的脂蛋白(a)與單克隆抗Lp(a)抗體結(jié)合，再與過氧化物酶結(jié)合，形成Lp(a)-單克隆抗體-酶復(fù)合物，然后與底物孵育顯色。 【參考范圍】120180mg/L 【臨床意義】Lp（a）動脈粥樣硬化、冠心病的獨立危險因素，與動脈粥樣硬化成正相關(guān)，血清Lp（a）濃度300mg/L時，其冠心病的發(fā)病率高于健康人的25倍。血清Lp（a）水平主要決定于遺傳，個體間Lp（a）水平差異很大，但同一個體血漿Lp（a）水平的變化較小，環(huán)境、飲食、藥物對它的影響不明顯。五、血清載脂蛋白A及B測定 脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分稱為載脂蛋白（apolipoprotein，Apo），可分為A、B、C、D、E、F、G、H八類，其中ApoA，B，C還有亞類。 ApoA是HDL的主要蛋白質(zhì)，占HDL蛋白質(zhì)的85%左右，它的血清濃度可代表HDL水平，ApoB是LDL的主要蛋白質(zhì)，