Real Time PCR 檢測方法原理

1、Real Time PCR檢測方法原理嵌合熒光染料檢測法（SYBR Green I）SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，能與雙鏈DNA非特異性結(jié)合，結(jié)合后發(fā)出熒光，可以通過檢測反應(yīng)體 系中的SYBR Green I熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。通過PCR反應(yīng)生成雙鏈DNA，SYBR Green I與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光，通過檢測熒光不但可以檢測反應(yīng)體系中的DNA擴(kuò)增 量，同時(shí)還能測定擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA融解溫度。具體原理見下圖。嵌合熒光染料法原理圖 TaqMan探針法TaqMan探針法是使用5端帶有熒光物質(zhì)（如：FAM等），3端帶有淬滅物質(zhì)（如:TAMRA

2、等）的TaqMan探針進(jìn)行熒光檢測的方 法。當(dāng)探針完整時(shí)，5端的熒光物質(zhì)受到3端的淬滅物質(zhì)的制約，不能發(fā)出熒光。而當(dāng)TaqMan探針被分解后，5端的熒光物質(zhì) 便會(huì)游離出來，發(fā)出熒光。當(dāng)PCR反應(yīng)液中加入熒光探針后，在PCR反應(yīng)的退火過程中，熒光探針便會(huì)和模板雜交。進(jìn)一步在PCR反應(yīng)的延伸過程中，Taq DNA聚合酶的5一3Exonuclease活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。通過檢測反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度， 可以達(dá)到檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。具體原理見下圖。*引物退火/探釘與模根的雜壹TaqMan探針法原理圖 CycleavePCR 法原理CycleavePCR法是由R

3、NA和DNA構(gòu)成的雜合Cycling探針與RNase H組合使用的高靈敏度檢測方法，能夠高效率地檢出目的 基因。Cycling探針內(nèi)部夾有RNA部分，一端標(biāo)記熒光物質(zhì)，另一端標(biāo)記淬滅物質(zhì)，當(dāng)探針處于完整狀態(tài)時(shí)，由于熒光淬滅作用 抑制熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，但當(dāng)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列雜交后，RNase H在RNA部分將探針切斷，淬滅抑制作用解除，熒光 物質(zhì)發(fā)出熒光，通過測定熒光強(qiáng)度，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物量。如果探針的RNA部分與模板不匹配，RNase H就不能在RNA部分將探針切斷，所以該檢出方法是一種即使一堿基不同也能識(shí)別 的高特異性檢出方法，特別適合于SNP解析。Cycling探針堿基數(shù)少，一

4、般為十二個(gè)堿基左右，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離近，淬滅效果好，熒光背景低，信噪比高。具體 原理見下圖。Cycling 探針Frinqr淳天物質(zhì)HE1德彎性2引物退火，探針與模板的雜變3 RNase H切斷和A部分Pntymragt4發(fā)出螢光Cycling探針法原理利用CycleavePCR法的SNP解析原理CycleavePCR法在SNP分型解析方面具有強(qiáng)大的優(yōu)勢。使用CycleavePCR法進(jìn)行SNP解析，在設(shè)計(jì)探針時(shí)，把多型位點(diǎn)或與 其相鄰的第2 3個(gè)堿基設(shè)計(jì)成RNA，使用不同的熒光物質(zhì)分別標(biāo)記野生型和突變型探針，通過對(duì)兩種不同熒光物質(zhì)進(jìn)行雙通道同 步檢測，實(shí)現(xiàn)對(duì)每個(gè)檢測樣品的SNP位點(diǎn)的基因型判定。SNP Point模板