生物制片基本原理

1、生物制片基本原理 生物制片是研究生物有機(jī)體微觀(guān)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)方法，其目的是提供在顯微鏡下以適度的樣品，有效地對(duì)其進(jìn)行形態(tài)和功能觀(guān)察研究。 生物制片的目的（一）切片法:用刀片將標(biāo)本切成薄片。石蠟切片法火棉膠切片法冰凍切片法炭蠟切片法 超微切片法徒手切片法切片法分類(lèi)（二）非切片法：用物理或化學(xué)的方法，將生物組織分離成單個(gè)細(xì)胞或，薄片或?qū)⒄麄€(gè)組織進(jìn)行整體封藏。非切片法分類(lèi)整體制片法涂片（布）法壓片（碎）法磨片法離析法生物制片的方法切片法制作過(guò)程（以常用石蠟切片為例）取材固定沖洗脫水或保存透明貼片烘干脫蠟染色封片 透蠟浸蠟 包埋修塊切片展片非切片法制作過(guò)程（以整體封藏法為例）固定沖洗（遇必要時(shí)）整體染色分

2、化與退染脫水透明封藏1.動(dòng)物選擇 組織材料的選擇非常重要，一般必須根據(jù)教學(xué)或科研的目的和要求確定。 組織切片以人的材料最好但局限性大，不過(guò)一些特殊的結(jié)構(gòu)動(dòng)物的比人的更具有代表性。 第一節(jié) 材料的采集與處理幾種動(dòng)物組織取材選擇簡(jiǎn)表猴：肝、脾、腎、胰、大腦、小腦、脊髓、脊神經(jīng)節(jié)、有髓神經(jīng)纖維、氣管、血管、淋巴結(jié)、輸尿管、膀胱、子宮、卵巢、輸卵管、乳腺、輸精管、前列腺、食道、胃、十二指腸、結(jié)腸、甲狀腺、腎上腺、腦垂體、松果體、眼球、手掌皮、內(nèi)耳、鼻腔、喉、骨骼肌、腮腺、頜下腺狗：食道、結(jié)腸、膽囊、舌、喉聲帶、扁桃體、淋巴結(jié)、脾、心臟、血管、肺、氣管、輸尿管、膀胱、輸精管、甲狀腺、周?chē)窠?jīng)（坐骨神經(jīng)）

3、、脊神經(jīng)節(jié)、頜下腺、眼球、胃賁門(mén)、幽門(mén)、直腸肛管交界處、鼻粘膜（嗅細(xì)胞）貓：肝、胃、十二指腸、空腸、回腸、腎、腎上腺、腦垂體、卵巢、大腦、小腦、脊髓、脊神經(jīng)節(jié)、交感神經(jīng)節(jié)、周?chē)窠?jīng)纖維、運(yùn)動(dòng)末梢（肋間?。⒐趋兰?、平滑肌、手掌皮羊：心肌、心傳導(dǎo)系統(tǒng)、子宮、宮頸、乳腺豬：肝（肝小葉）、脊髓、腦垂體、膽囊、脾兔：疏松結(jié)締組織（皮下組織）、腸系膜、卵巢、睪丸、肺、 耳廓（彈性纖維）、回腸（潘氏細(xì)胞）豚鼠：胰腺（胰島細(xì)胞）、腎上腺、內(nèi)耳、小腸（嗜銀細(xì)胞）大白鼠：皮下組織（肥大細(xì)胞）、小腸（潘氏細(xì)胞）2. 組織取材的方法總原則：取材一般先取腹腔內(nèi)的器官組織，多數(shù)遵循下列順序：肝臟、膽囊 胃、腎上腺 胰腺

4、、脾 小腸、結(jié)腸；然后是胸腔、盆腔器官組織；最后取神經(jīng)系統(tǒng)。 組織取材以前，首先對(duì)該器官組織做大體檢查，觀(guān)察是否有病變。1.肌組織取材 肌組織取材時(shí)要注意防止因肌肉收縮肌纖維起波浪形變化而影響對(duì)肌纖維正常形態(tài)的觀(guān)察。 避免方法是在固定前將肌肉切成縱條，結(jié)扎并分別固定于拱形玻璃棒兩端。 骨骼肌應(yīng)該取縱橫兩個(gè)切面。2.肝臟取材 肝臟左右四葉，組織學(xué)取材一般在肝臟右前葉或左外葉中部做縱切或冠狀切面，然后分切成若干小塊，投入固定液固。因肝是實(shí)質(zhì)性器官，固定液不宜迅速滲入組織內(nèi)，故肝取材不宜過(guò)大，以厚2-3mm為宜。3.膽囊 應(yīng)先將膽囊與肝臟分離，用無(wú)齒鑷子夾起膽囊，從一側(cè)將膽囊剪開(kāi)，倒掉膽汁，用生理鹽

5、水充分洗干凈。取材時(shí)不要取貼附于肝臟的一面，可在游離面膽囊的體部做一縱切面，以被膜面附貼于濾紙上再行固定。另法：亦可直接在膽囊游離面的體部取材，取下膽囊立即附貼于濾紙?jiān)僦糜谏睇}水中充分洗去膽汁，然后投入固定液固定，注意不要讓鑷子損傷膽囊粘膜。4.胰腺 一般取胰腺的尾部做橫切面，因胰尾含胰島較多，便于做胰島細(xì)胞的特色染色研究，取材時(shí)應(yīng)注意將胰腺周?chē)闹窘M織去掉，以免影響胰組織的固定，胰腺有各種消化酶，動(dòng)物死后易于自溶，取材操作要快，保持新鮮，組織切取要小，以免發(fā)生組織自溶變性。6.腎臟腎臟取材可采用兩種方法：一，先從腎臟注射固定液，固定后取材，固定液可由腎動(dòng)脈注入，同時(shí)切斷腎靜脈，使在固定液

6、注入的同時(shí)，腎臟血液也同時(shí)排出。二，取出腎臟，注意保護(hù)其被膜，沿著腎的外側(cè)緣的中部，直到深部做縱剖切面，全部切成兩半，然后在腎的任一半面再做一扇形切面，皮質(zhì)和髓質(zhì)都應(yīng)切到。5.胃 胃取材一般以空虛為好，如果胃內(nèi)有儲(chǔ)存的食物，應(yīng)先用生理鹽水洗干凈，取材時(shí)可在胃底或胃體部做一縱切面，組織取出后洗去胃內(nèi)的食物殘?jiān)?，放在濾紙上鋪開(kāi)，防止卷縮，而后投入固定劑中固定。7.肺 肺的取材不能取邊緣部位，應(yīng)取肺小葉的中部，一般做橫切片，以能全面看到肺內(nèi)小支氣管 細(xì)支氣管 終末細(xì)支氣管 呼吸性細(xì)支氣管 肺泡囊 肺泡的組織結(jié)構(gòu)為好。8.心臟 主要取左心室壁，首先用解剖刀沿心臟的左緣至心尖部切開(kāi)，再由心尖部沿心室中隔

7、之平行線(xiàn)切開(kāi)左心室的前壁和主動(dòng)脈，這樣左心室便全部剖開(kāi)，取材一般切取左心室乳頭肌部位，沿乳頭肌的長(zhǎng)軸做縱切面。3.外科活體組織取材法1.臨床手術(shù)中 多用于腫瘤組織，取材時(shí)應(yīng)注意腫瘤的部位、形態(tài)、大小、顏色以及與四周組織的關(guān)系，有無(wú)完整或不完整的包膜，測(cè)量腫瘤的體積，包括長(zhǎng)度，寬度和高度等。2.活體小組織 活體組織標(biāo)本一般體積小，似米?；蛑ヂ椋庋塾^(guān)可以看出組織病變區(qū)域和大體層次的，必須盡量按切片的面進(jìn)行包埋。4.組織取材注意事項(xiàng)1.取材應(yīng)遵循準(zhǔn)確、典型、完整、適時(shí)的原則；2.研究正常結(jié)構(gòu)應(yīng)選取健全而又有代表性的部分取材，采取病理材料時(shí)， 除取病理部位外，還應(yīng)選取正常部位，以利于對(duì)照觀(guān)察；3.取

8、材前，要根據(jù)要求選擇并配制好固定液，取材后，立即投入固定液 中，以防組織自溶和腐敗保持材料新鮮；4.切取材料時(shí)，刀必須銳利，動(dòng)作要快且仔細(xì)，切割時(shí)切勿拉鋸式的來(lái)回 切取，鑷取也應(yīng)輕拿輕放，避免材料的損壞，組織塊力求小而薄 0.3*；5.取材要詳細(xì)記錄日期、采集地點(diǎn)、標(biāo)本名稱(chēng)、取材部位、斷面和所用固 定液等。 殺死：兩層含義。一是把用于取材的動(dòng)物處死；二是使用化學(xué) 藥品，迅速地終結(jié)生物組織的生理活性。 固定：在殺死的基礎(chǔ)上，把組織或細(xì)胞按生活的狀態(tài)固定下來(lái) ，使在以后的制片過(guò)程中不發(fā)生任何變化。 保存：將固定好的材料浸泡于保存液使其不發(fā)生變質(zhì)。5.殺死、固定、保存的概念6.動(dòng)物致死法1.麻醉法2

9、.空氣栓塞法3.擊頭法4.斷頭法5.股動(dòng)脈放血法 動(dòng)物致死法 1、麻醉法 可將浸有乙醚或氯仿的棉球連同小動(dòng)物一起密封于鐘罩或有蓋玻璃瓶?jī)?nèi)進(jìn)行麻醉；也可用4%戊巴比妥作靜脈注射，劑量按動(dòng)物體重1ml/kg；或用20%氨基甲酸乙脂作腹腔注射，劑量一般按動(dòng)物體重5ml/kg。 2、空氣栓塞法 如家兔可用50ml注射器將空氣由耳靜脈推入，使動(dòng)物很快死亡。 3、擊頭法 大、小鼠，可用重物擊頭后部或?qū)⑵漕^后部猛撞桌沿，最好一擊而死。 4、斷頭法 青蛙、小鼠等小動(dòng)物，可用剪刀剪去其頭部，較大動(dòng)物如兔子等，可用斧頭迅速砍頭致死。 5、股動(dòng)脈放血法 動(dòng)物經(jīng)吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切開(kāi)股動(dòng)脈放血。 注意：上述

10、各法，應(yīng)根據(jù)制片需要選用，如空氣栓塞法不宜用作血管注射標(biāo)本的制作；乙醚麻醉對(duì)丘腦下神經(jīng)部分泌物染色標(biāo)本不利；股動(dòng)脈放血法有利于腸系膜鋪片的制作。 在于通過(guò)固定劑，在盡量短的時(shí)間內(nèi)使生物細(xì)胞或組織停止生命活動(dòng)，借助化學(xué)藥品的作用使其保持原來(lái)的形狀和結(jié)構(gòu)，同時(shí)易于后步驟的染色。 固定有物理方法固定（干燥、高熱、低溫驟冷等）、化學(xué)方法固定（用化學(xué)試劑配制成固定液進(jìn)行的固定）。第二節(jié) 固定和固定液1.固定作用的原理2.固定的意義和目的1.意義 只有將組織充分固定才能進(jìn)行制片； 固定可使要觀(guān)察的組織結(jié)構(gòu)盡量接近生前的正常狀態(tài)（機(jī)體死亡后細(xì)胞內(nèi)的酶會(huì)使蛋白質(zhì)分解，細(xì)胞溶解破壞，組織變形，而且病原微生物迅速

11、繁殖，不利于形態(tài)學(xué)觀(guān)察）。2.目的 a、防止組織自溶和腐??； b、使細(xì)胞內(nèi)各種成分沉淀保存下來(lái)，從而保持細(xì)胞與生 活狀態(tài)相近似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)； c、避免組織或細(xì)胞發(fā)生收縮或膨脹； d、能增加著色能力和媒染能力； e、對(duì)組織有硬化作用，適于切片，但又不能使材料過(guò)于 堅(jiān)硬或變得松脆； f、增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光程度，易于鑒別； g、固定以后，又能有保存的作用。3.固定的對(duì)象和方法 構(gòu)成細(xì)胞的主要物質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以固定的對(duì)象主要是蛋白質(zhì)。 組織固定時(shí)，應(yīng)使用足夠的固定液，固定液的量一般不少于組織塊總體積的10倍以上（一般是20倍，多比少好）。 小塊組織固定法：從人體和動(dòng)物取下的小塊組織，立即置入液態(tài)固定

12、劑中進(jìn)行固定，這是應(yīng)用最廣泛最經(jīng)常的方法。局部灌注固定注射或灌注固定 對(duì)某些體積過(guò)大或者固定液極難滲入的組織塊或者需要對(duì)整個(gè)臟器或者動(dòng)物進(jìn)行固定時(shí)多使用此方法，將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達(dá)整個(gè)組織和全身。 肺-可從氣管、支氣管或肺動(dòng)脈注入固定液，然后將整個(gè)肺葉投入固定液，6-12小時(shí)后再分切。 眼球-從眼后房或頸動(dòng)脈注入 肝、腎-經(jīng)肝動(dòng)脈或腎動(dòng)脈注入 腦-動(dòng)物麻醉暴露頸動(dòng)脈用注射針向著頭部的方向注入特殊固定方法全身灌注固定 多數(shù)為滿(mǎn)足原位雜交方法取材的要求使用。 對(duì)較大的動(dòng)物如兔、貓、狗、猴等采用輸液的方法，將固定液從一側(cè)頸總動(dòng)脈或股動(dòng)脈輸入，將另一側(cè)頸靜脈切開(kāi)放血。 對(duì)較小的動(dòng)物如鼠，可

13、在乙醚麻醉的情況下打開(kāi)胸腔，縱向切開(kāi)心包膜，用注射器從左心室向主動(dòng)脈方向注射（結(jié)扎緊），同時(shí)右心房開(kāi)孔放血，一般在注射固定液前先用與該動(dòng)物等量的生理鹽水注入血管沖洗，流出的液體不見(jiàn)血時(shí)，再將固定液注入。蒸汽固定法 多用于比較細(xì)小而薄的組織，可用鋨酸或甲醛蒸汽固定，主要用于如血液、細(xì)胞涂片或薄的組織固定。4.組織固定的注意事項(xiàng)1.組織必須新鮮，組織塊不易過(guò)大，一般以厚度5mm，長(zhǎng)寬 不超過(guò)1515mm；2.防止材料因固定劑的作用而發(fā)生變形：對(duì)柔嫩而薄的材 料可先攤于吸水紙上再投入固定劑；3.固定所用固定液以新配的為好，防止過(guò)久失效；4.固定劑的用量：保證組織有足夠的固定劑；5.固定的時(shí)間：參考組

14、織的種類(lèi)、性質(zhì)、大小、固定劑種 類(lèi)性質(zhì)、滲透力強(qiáng)弱，固定的溫度等；6.其他：定期搖動(dòng)組織或容器可有利于固定液的滲入，對(duì) 長(zhǎng)期固定的標(biāo)本可經(jīng)常更換固定液。5.固定液的性質(zhì)和條件1.迅速滲入組織，使解剖的組織細(xì)胞形態(tài)短期內(nèi)不至 于有較大變化；2.固定液有相當(dāng)?shù)臐B透力，對(duì)組織各部分的滲透力相 等，可使組織內(nèi)外完全固定；3.使組織細(xì)胞不至于因固定而引起人為的改變。 用于固定組織的化學(xué)試劑溶液稱(chēng)固定液。分單一、混合固定液兩類(lèi)。1、單一固定液 甲醛、酒精、冰醋酸、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯 化汞、碘、鋨酸等。2、 混和固定液 Zenken氏液、 Bouin氏液、 Carnoy氏液等。 較好的固定液必須具備

15、以下條件：具有強(qiáng)的滲透力；不會(huì)使組織過(guò)度收縮或膨脹，并能使組織內(nèi)易于觀(guān)察的成分凝固為不溶性物質(zhì)；使組織達(dá)到一定硬度，獲得較佳的折光率和對(duì)染料具有較強(qiáng)的親和力。5.固定液?jiǎn)我还潭ㄒ旱姆N類(lèi)、性質(zhì)及其應(yīng)用 酒精、甲醛、冰醋酸、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、碘、鋨酸 混和固定液的種類(lèi)、性質(zhì)及其應(yīng)用 Zenken氏液、 Bouin氏液、 Carnoy氏液等等固定液的類(lèi)型1、乙 醇 組織保存劑，制片時(shí)的固定劑。50%以上的乙醇都有固定作用，固定濃度以80-95%為好。固定的特點(diǎn)：殺死快,滲透力強(qiáng)，可使材料變硬。用純酒精固定時(shí)間不宜太長(zhǎng)，否則會(huì)使材料發(fā)脆，但70%的酒精可較久的保存材料具有固定、硬化、脫水

16、等作用無(wú)水酒精固定時(shí)穿透速度快，宜做糖原固定。但取材薄時(shí)才能固定好，也容易變脆，收縮染色不如甲醛滲透力差 即福爾馬林，濃度為40%，實(shí)際只有4%甲醛，固定蛋 白質(zhì)最好。 特點(diǎn)：非沉淀性固定劑，不能使白蛋白和核蛋白沉淀，但 可與蛋白質(zhì)化合; 滲透力均勻，對(duì)組織收縮較少，能固定大塊組織; 對(duì)小塊組織固定數(shù)小時(shí)即可，時(shí)間長(zhǎng)沒(méi)有關(guān)系； 用福爾馬林固定的材料，有利于核的染色，特別是 對(duì)動(dòng)物組織的固定效果更佳; 對(duì)長(zhǎng)期固定的標(biāo)本，制備切片時(shí)須流水沖洗24小時(shí) 甚至48小時(shí)。2、甲 醛3、醋 酸醋酸又稱(chēng)乙酸，常在16.6以下凝成冰狀固體故名冰醋 酸 。用 1%-5%的醋酸作固定液，滲透力極強(qiáng)，對(duì)一般組織短時(shí)

17、間內(nèi)就可產(chǎn)生固定作用。醋酸可沉淀核蛋白，所以對(duì)染色質(zhì)或染色體的固定和染色都很好，但它不能固定類(lèi)脂物。醋酸可使細(xì)胞膨脹和防止收縮；同時(shí)由于它不能凝固細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，組織不會(huì)硬化，因此可與引起組織收縮的液體相混合，起到相互平衡的作用。4、苦味酸(三硝基苯酚）苦味酸是極毒的黃色結(jié)晶，極易爆炸，常配成飽和水溶液貯存，它在水中的溶解度為0.9%-1.4%，亦可溶于酒精、氯仿等。可沉淀一切蛋白質(zhì)，對(duì)類(lèi)脂物無(wú)作用，也不能固定碳水化合物。滲透速度較慢。固定后細(xì)胞收縮明顯，收縮率達(dá)50%以上，但不使組織硬化?？辔端岬墓潭〞r(shí)間不宜過(guò) 長(zhǎng)，否則會(huì)影響蘇木精等堿性染料的染色?？辔端峁潭ńM織的黃色，在以70%酒精脫水

18、時(shí)加入少許碳酸鋰飽和水溶液即可除去。5、升汞（氯化汞）是一種毒性很強(qiáng)的化合物，滲透力僅比醋酸弱。幾乎可沉淀所有蛋白質(zhì)，升汞能充分固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，并可增加對(duì)酸 性 染料的親和力，升汞能使組織收縮，但硬化作用不強(qiáng)，多與冰醋酸、鉻酸鹽及甲醛混合使用。升汞固定的材料中常存有沉 淀或結(jié)晶，因此固定后用 0.5%的碘酒（70%酒精洗滌，以提出升汞；然后再用70%酒精洗滌，將碘 去掉；最后還要用0.2%-0.5%硫代硫酸鈉溶液洗滌，徹底去掉碘黃色。6、重鉻酸鉀為橙紅色結(jié)晶，性毒，為一種強(qiáng)氧化劑，不能與酒精、甲醛混合。同時(shí)為一種強(qiáng)硬化劑,滲透力差，很少單獨(dú)使用。與醋酸混合后，pH在時(shí)可以固定染色體，以及對(duì)

19、細(xì)胞質(zhì)和染色體產(chǎn)生網(wǎng)狀沉淀作用。在未與醋酸混合pH大于時(shí)，對(duì)類(lèi)脂體具有良好的作用，可以固定高爾基體和線(xiàn)粒體，但此時(shí)對(duì)染色體不利，不能用作核的固定。常用濃度1%-3%，它固定的材料，一般不收縮，有的反而稍膨脹，但經(jīng)酒精處理后可繼續(xù)收縮，固定后可充分用水洗滌。性質(zhì)：灰黃色結(jié)晶，強(qiáng)氧化劑，劇毒優(yōu)點(diǎn)：目前最好的固定劑之一，脂類(lèi)物質(zhì)唯一的固定劑缺點(diǎn)：滲透力弱，組織固定不均勻，價(jià)格昂貴 *取材較小，固定后用過(guò)氧化氫漂洗7、鋨 酸性質(zhì)：三氧化鉻的水溶液。三氧化鉻是紅棕色結(jié)晶體，易潮解 ，強(qiáng)氧化劑，配好后必須立即使用。優(yōu)點(diǎn)：可使蛋白質(zhì)、核蛋白、核酸等產(chǎn)生良好的固定不溶解。 缺點(diǎn)：滲透力弱，容易使組織收縮且過(guò)度

20、硬化。 8、鉻 酸1、FAA固定液(萬(wàn)能固定液) 配方：50%或70%酒精90ml + 福爾馬林5ml + 冰醋 酸5ml。此液可用于一般植物組織的固定，一般薄嫩的組織用50%酒精，厚硬的組織用70%酒精，醋酸穿透力強(qiáng)，可縮短固定時(shí)間，有利于固定質(zhì)量。一般固定5-20小時(shí)，超過(guò)時(shí)間也無(wú)妨，固定的材料不用水洗，可直接從70%酒精開(kāi)始脫水。2.卡諾固定液(Carnoys)無(wú)水乙醇3份+冰醋酸 1份無(wú)水乙醇6份+氯仿3份+冰醋酸 1份此液可固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核, 對(duì)于花粉母細(xì)胞、胚胎以 及染色體的固定均可收到良好的效果。此液由于有較多醋酸，所以固定速度很快，不同的組織固定的時(shí)間也不相同，如根尖固定15

21、分鐘；花藥固定1小時(shí)；動(dòng)物組織因小時(shí)，固定無(wú)需水洗，要用純酒精浸洗數(shù)次。3、秦克氏液（Zenker s)細(xì)胞學(xué)中最常用的一種固定液對(duì)動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核的固定效果最佳，并有利于染色。固定時(shí)間約為18-24小時(shí)，固定后水洗12小時(shí)，以除去 組織中的重鉻酸鉀。當(dāng)酒精分級(jí)脫水至70%酒精時(shí)，可加少許碘，以提出留于組織中的汞。配方：重鉻酸鉀2.5g +升汞5g +硫酸鈉1g +冰醋酸5ml +蒸餾水100ml先將升汞放在蒸餾水中加熱溶解，然后加重鉻酸鉀和硫酸鈉，溶后放置，同時(shí)用少量的冰醋酸調(diào)節(jié)pH至2.3。4、波恩氏液(Bouns)配方：福爾馬林25ml +冰醋酸5ml +苦味酸飽和水溶液75ml常用的

22、改良液：1%酸鉻50ml+福爾馬林10ml+10%冰醋酸20ml +苦味酸飽和水溶液20ml1%酸鉻50ml+福爾馬林10ml+冰醋酸5ml +苦味酸飽和水溶液35ml應(yīng)用范圍較廣，如植物組織、花粉母細(xì)胞、胚囊細(xì)胞以及動(dòng)物的一些柔軟組織。此液有較多醋酸，滲透力強(qiáng)，固定速度快。薄軟組織1-3小時(shí)，較大的組織塊，12-24小時(shí)，固定后直接由50%酒精逐級(jí)脫水。5、納瓦興(Navaschjns)固定液改良液 :材料較柔嫩，含水量較多，可用配方I、；材料較堅(jiān)硬，含水量較少，可用、V 配方。分別配成甲、乙兩種基液，用時(shí)臨時(shí)等量配合。固定時(shí)間為12-24小時(shí)，固定后用70酒精洗滌數(shù)次。 沖洗：用洗滌劑滲透

23、到組織間隙中去，把固定劑洗掉。 沖洗的目的：以免妨礙染色或使材料在后續(xù)處理中變質(zhì)。 常用洗滌劑：水、低濃度的酒精。沖洗的原則:1.固定劑為酒精，或酒精混合物，一般不要求沖洗，如有必要，必須采用與固定劑中的酒精濃度相同或相近的酒精。2.凡是含有鉻酸、重鉻酸鉀、鋨酸的固定劑，必須用流水沖洗，沖洗時(shí)間應(yīng)等于或多于固定時(shí)間。3.如固定液中含有氯化汞，應(yīng)根據(jù)溶液的性質(zhì)用水或酒精沖洗，沖洗完畢必須在70%酒精中加碘液去汞 。4.含有苦味酸的固定劑，宜選用70%的酒精進(jìn)行洗滌?？辔端岬狞S色在70%酒精中能自行脫去,或加入碳酸鉀飽和水溶液除去。 第三節(jié) 沖洗與脫水 脫水：用一種藥劑把材料中的水分全部去除干凈。

24、 脫水的目的：使組織中的水分完全去除，并使組織變硬。 常用的脫水劑：酒精、丙酮、甘油、正丁醇、叔丁醇、 酒精脫水，如需過(guò)夜，應(yīng)停留在70酒精中丙酮脫水力和收縮作用都較酒精強(qiáng)甘油常用于藻類(lèi)、菌類(lèi)和柔弱材料脫水，特別在整體制片法中應(yīng)用廣泛正丁醇、叔丁醇均為石蠟溶劑，用其脫水后的材料不需要透明，可直接浸蠟透明：采用苯類(lèi)有機(jī)溶劑，將組織或切片中的水溶劑 取代，并且達(dá)到透明的目的。目的：1、包埋前透明使組織中的酒精或者丙酮被透明劑替 代，使石蠟可以順利的進(jìn)入組織中，增強(qiáng)組織的 折光系數(shù) 2、封藏前透明，增加透明度，溶解封藏劑使封片均 勻緊密。透明劑：二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油、丁香油。第四節(jié) 透明與

25、透明劑常用透明劑的種類(lèi)和使用方法1.二甲苯 為最常用透明劑。無(wú)色透明液體 ，長(zhǎng)期接觸可刺激呼吸道粘膜。 透明組織塊時(shí)所用鑷子必須干燥，不得將水滴混入二甲苯，為減少組織變形和收縮，可先經(jīng)純酒精與二甲苯或苯的混合液（1:1）。如脫水不凈，用二甲苯透明后，將出現(xiàn)下列不良后果：1、如材料內(nèi)仍留有微量水分，二甲苯就進(jìn)不去，因此石蠟液不能透入，切片后將在蠟片上出現(xiàn)空洞，影響結(jié)果；2、切片內(nèi)留微量水分，封藏后會(huì)發(fā)生乳白色云霧狀，在顯微鏡下觀(guān)察時(shí)可見(jiàn)許多密集水珠把組織掩蓋，切片作廢。3.甲苯 性質(zhì)同二甲苯，但透明較慢4.氯仿（三氯甲烷） 透明能力比二甲苯和苯差，透明時(shí)間至少24小時(shí)，多用于大塊組織透明。5.香

26、柏油 作為透明劑效果較好，但透明時(shí)間長(zhǎng)，至少24小時(shí)，與石蠟不易融合，不適用于透明組織。2.苯 用途與二甲苯相似，對(duì)組織收縮小，但因吸入毒性大，較少使用。6.苯甲酸甲酯 難溶于水，溶于乙醚，組織塊脫水至95%酒精后可直接轉(zhuǎn)入苯甲酸甲酯透明，透明時(shí)間12-24小時(shí)，對(duì)組織塊收縮和硬化很弱，可用于火棉膠切片。7.苯胺油 又名安尼林油，微溶于水，能與醚、醇、苯等混合，暴露于日光很快變?yōu)樽厣?，?yīng)避光保存。 包埋：將融化的包埋劑連同浸透包埋劑的材料一同傾 倒于特制的容器內(nèi)的過(guò)程。 組織包埋前，常利用石蠟將透明劑去除，使石蠟完全浸入細(xì)胞的每個(gè)部分，使石蠟與材料成為一個(gè)整體而便于切片，稱(chēng)為組織浸蠟。 第五節(jié)

27、 包埋與包埋劑浸蠟的目的和方法 組織組織經(jīng)透明后，在溶化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱(chēng)浸蠟，目的是用石蠟代替組織中的透明劑，并滲入組織內(nèi)部使軟組織變?yōu)檫m當(dāng)硬度，以利于切片和觀(guān)察。 石蠟分為軟蠟和硬蠟。 由于石蠟冷凝后脆性較大，可加入一定的黃蜂蠟增加韌性（蜂蠟與石蠟的比例為1:5）。 一般用于浸蠟的石蠟熔點(diǎn)為52-56，在夏天較熱時(shí)一般用高熔點(diǎn)石蠟，在冬天氣溫較低時(shí)用低熔點(diǎn)石蠟，主要是有利于切片的制作。 新蠟應(yīng)多次熔化，使其中所含的揮發(fā)性物質(zhì)蒸發(fā)，以免包埋時(shí)出現(xiàn)蠟花。 浸蠟時(shí)必須經(jīng)過(guò)數(shù)次純石蠟，使其中剩余的透明劑完全去盡。 在組織更換蠟杯時(shí)要間隔一定時(shí)間，盡量減少組織中含有的二甲苯被帶入最后的純蠟杯中，而

28、影響浸蠟的程度。浸蠟劑的種類(lèi)1.石蠟：最適合的包埋石蠟熔點(diǎn)為54-68 2.火棉膠：為三硝基纖維素，由濃硝酸和濃硫酸作用于脫脂棉而得，適用于大塊組織和眼球等。3.碳蠟：多乙烯醇，為水溶性油蠟。組織包埋石蠟包埋法快速石蠟包埋法火棉膠包埋法石蠟包埋法 石蠟是動(dòng)植物和人體組織制片技術(shù)中極重要且應(yīng)用最廣的包埋劑。包埋蠟須在溫箱內(nèi)經(jīng)多次熔化，用新蠟和舊蠟混合熔化后沉淀的干凈蠟。1.浸蠟時(shí)間 一般厚5mm的實(shí)質(zhì)性器官（肝、脾、腎）總浸蠟時(shí)間為2-3小時(shí)。 小胚胎可縮短為30min。 組織浸蠟時(shí)，可在溫箱中放置3-4個(gè)蠟杯，按軟蠟1、軟蠟2、硬蠟的順序浸蠟，間隔一定時(shí)間更換一個(gè)蠟杯，可使石蠟充分滲入組織。組

29、織名稱(chēng)浸 蠟 時(shí) 間（分 鐘）10*10*2-3mm10*10*4-5mm軟蠟I軟蠟II硬蠟軟蠟I軟蠟II硬蠟肝、腎102040152050肌肉組織101030101535消化管101520152045胰腺101025101530淋巴器官101535151540血管10155152040肺152055203055膀胱、子宮151540152045神經(jīng)組織101535102540皮膚202050202060垂體101520101535血液骨髓51020101025組織體積大小、浸蠟時(shí)間參考表石蠟包埋過(guò)程1.裝好金屬包埋框，或折好紙盒2.點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好鑷子，需要標(biāo)記的寫(xiě)好標(biāo)簽3.將已熔化的包埋

30、石蠟，傾入包埋框或紙盒中，倒?jié)M即可4. 組織置入包埋框時(shí)，首先應(yīng)明確組織的方位，將組織塊平 置入框底。將標(biāo)簽放置蠟塊上5.包埋框內(nèi)的蠟逐漸凝固后，若表面已凝結(jié)為固體狀，即可 放在冷臺(tái)上冷卻，加速其凝固，但不能過(guò)早放入6.蠟塊完全凝固后即可取出。石蠟包埋注意事項(xiàng)1.鑷子要隨用隨烤熱，以免石蠟?zāi)Y(jié)在鑷子上，造成蠟塊凝 固不均勻；2.包埋過(guò)程要迅速，組織取出的時(shí)間要盡量縮短3.包埋后的蠟塊應(yīng)呈均質(zhì)半透明狀，如出現(xiàn)白色渾濁，應(yīng)考 慮：脫水不徹底；包埋蠟溫度低，過(guò)早凝固；石蠟不純4.包埋箱的溫度必須保持恒定5.包埋不理想應(yīng)重新將蠟塊熔化，重新浸蠟和包埋6.尤其在用紙盒包埋時(shí)，蠟塊表面冷卻后必須放入冷水或

31、冷 卻臺(tái)使其迅速凝結(jié)為蠟塊。快速石蠟包埋法 適用于快速診斷，且組織塊太小或太碎，無(wú)法使用冰凍切片方法制片時(shí)1.將組織塊投入40%甲醛10ml，95%乙醇85ml， 冰醋酸5ml的混合液，固定兼脫水2min2.純丙酮3min3.純丙酮3min4.苯2min5.浸蠟5min 快速包埋組織后進(jìn)行冷卻切片，烤片、脫蠟、染色及封固。 火棉膠包埋法 適用于大塊組織和眼球等，可避免纖維組織和肌肉組織過(guò)度硬化，減少纖維組織的收縮和扭轉(zhuǎn)，有利于保持組織的原有結(jié)構(gòu)。 其缺點(diǎn)是操作過(guò)程過(guò)長(zhǎng)，不適于病理和尸檢制片，對(duì)神經(jīng)組織和眼球較好。1.將組織塊固定、水洗后投入70%乙醇中6-24小時(shí)2.浸入80%乙醇中6-24小

32、時(shí)3.浸入90%乙醇中6-24小時(shí)4.浸入95%乙醇中12-24小時(shí)5.浸入100%乙醇中12-24小時(shí)6.浸入乙醚和純乙醇等量混合液中24小時(shí)7.浸入2%火棉膠（2g火棉膠溶解于50ml純乙醇和50ml乙醚混合液）中24-48小時(shí)?；鹈弈z包埋法參考步驟8.浸入4%（4g火棉膠溶解于50ml純乙醇和50ml乙醚混合液）中24小時(shí)至數(shù)周9.浸入8%（8g火棉膠溶解于50ml純乙醇和50ml乙醚混合液）中24小時(shí)至數(shù)周10.浸入16%（16g火棉膠溶解于50ml純乙醇和50ml乙醚混合液）中1周11.包埋時(shí)，以16%火棉膠液倒入平底玻璃皿內(nèi)，將組織平放埋入其中，上面蓋好。溶液慢慢蒸發(fā)，直到用手指輕

33、壓火棉膠不再出現(xiàn)指紋時(shí)，即達(dá)到合適的硬度。已經(jīng)包埋好的火棉膠組織塊可存放于70%乙醇中備用。一、 蠟塊的修整與固著 二、切片過(guò)程 （一）切片機(jī)：旋轉(zhuǎn)切片機(jī) （二）切片刀 通常分為平凹型、雙平型、雙凹型。 切片刀的角度，一般以58度為宜。三、石蠟切片時(shí)常見(jiàn)問(wèn)題、原因及補(bǔ)救第六節(jié) 切片與粘片1.載玻片的處理 清潔液浸泡5-12小時(shí) 清潔液配制方法：重鉻酸鉀300g溶于3000ml蒸餾水，緩緩加入濃硫酸300ml1. 切片前的準(zhǔn)備工作2.流水沖洗12-24小時(shí)，蒸餾水沖洗3-5遍3. 95%酒精浸泡2小時(shí)，擦洗，晾干備用2. 粘片劑的選擇1.蛋白甘油 取雞蛋一個(gè)，取出蛋白混入等量純甘油，混合溶解后過(guò)

34、濾，于冰箱中保存，為長(zhǎng)期存放可加入麝香草酚2.鉻釩明膠液 500-800ml蒸餾水加溫溶解5g明膠，完全溶解后加入鉻釩，定容至1000ml。若有殘?jiān)^(guò)濾3.氨丙基三乙氧硅烷（APES） 干凈載玻片 APES（按1:50比例用丙酮稀釋?zhuān)?0s 丙酮沖洗10s 蒸餾水沖洗20s 晾干備用3. 修塊將包埋的組織周?chē)^(guò)多的石蠟切去，四周留約的邊，上下邊要平行4. 磨刀一般使用自動(dòng)磨刀機(jī)進(jìn)行，可在顯微鏡下檢查切片刀，主要觀(guān)察刀口是否平整、有無(wú)缺口5. 撈片、展片機(jī)的準(zhǔn)備1.將預(yù)先冷卻的組織蠟塊裝在切片機(jī)固定器上，再裝切片刀2.調(diào)整切片刀與組織塊平面的傾角關(guān)系，一般為10-15度角3.左手持毛筆，右手轉(zhuǎn)

35、動(dòng)切片機(jī)把，切片帶出來(lái)后，用毛筆 輕輕托起，再用鑷子輕攝蠟片，以正面放入展片箱中，待 攤平后撈片4.左手持清潔好的載玻片一端投入水中附貼切片，右手用鑷 子輔助推動(dòng)切片移至載玻片上5.在空氣中稍晾干即可烤片?？酒瑫r(shí)間一般在45幾小時(shí)至 過(guò)夜。6. 切片：石蠟切片法制作過(guò)程 任何石蠟切片、冰凍切片等，如果不經(jīng)過(guò)染色，在顯微鏡下只能看到細(xì)胞及其他組織的輪廓，即使由于組織內(nèi)部各種物質(zhì)的折光系數(shù)不同，從光線(xiàn)的明暗上能觀(guān)察到一些結(jié)構(gòu)，但遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足觀(guān)察和診斷等目的。 染色的目的就是將染料配制成溶液，將組織烤片浸入染色劑內(nèi)，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間，使組織或細(xì)胞及其他異常的成分被染上不同深淺的顏色，產(chǎn)生不同的折光率，便

36、于在光鏡下進(jìn)行觀(guān)察。第七節(jié) 染色原理與染色劑 染色是染色劑與組織細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程，其原理尚不完全清楚，有不同的學(xué)說(shuō)，一般認(rèn)為是化學(xué)和物理反應(yīng)。1.染色的化學(xué)反應(yīng) 用于染色的染料有酸性、堿性和中性，堿性染料具有堿性助色團(tuán)氨基，酸性染料具有酸性助色團(tuán)羥基和羧基。染色原理與染色劑 組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)性質(zhì)也不同，有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)，酸性物質(zhì)能與溶液中的陽(yáng)離子結(jié)合，堿性物質(zhì)能與溶液中的陰離子結(jié)合。細(xì)胞核尤其是核內(nèi)染色質(zhì)一般由酸性物質(zhì)組成，故與堿性染料親和力強(qiáng)，以蘇木素為代表的堿性染料中有染色主要的陽(yáng)離子。細(xì)胞漿主要是由堿性物質(zhì)組成，與酸性染料有較強(qiáng)的親和力，以伊紅為代表的酸性染料中有染色作用的陰離子。2.染色的物理作用1.吸附作用： 指染料與組織產(chǎn)生的物理現(xiàn)象，而不是染料與組織結(jié)構(gòu)的真正結(jié)合，如鍍銀法是由于組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與銀化合物的吸附，經(jīng)過(guò)還原而變成金屬銀沉