免疫學(xué)方法以及其應(yīng)用(2)

1、關(guān)于免疫學(xué)方法及其應(yīng)用 (2)第一張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月病原微生物感染機(jī)體對(duì)抗免疫免疫學(xué)幾個(gè)基本概念免疫(immunity)：是人和動(dòng)物機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)，其作用是“識(shí)別”和排除抗原性“異物”，以維持機(jī)體生理的平衡和穩(wěn)定。免疫學(xué)：研究機(jī)體自我識(shí)別和對(duì)抗原性異物排斥反應(yīng)的一門科學(xué)。傳統(tǒng)的免疫概念：機(jī)體抵抗病原微生物的能力，即抗傳染免疫1.免疫和免疫學(xué)第二張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)：具有自身的運(yùn)行機(jī)制并可與其他系統(tǒng)相互配合、相互制約，共同維持機(jī)體在生命過(guò)程中總的生理平衡。免疫系統(tǒng)的任務(wù)是消滅“異己”“異己”來(lái)自兩個(gè)方面:外來(lái)的入侵者： 侵入

2、身體的各種致病菌包括哪些？(2)“變壞了的”自身細(xì)胞。 細(xì)胞癌變第三張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月免疫系統(tǒng)的生理功能免疫防御機(jī)體排斥外源性抗原異物的能力。免疫自穩(wěn)機(jī)體識(shí)別和清除自身衰老殘損的組織 、細(xì)胞，維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。免疫監(jiān)視機(jī)體殺傷和清除異常突變細(xì)胞，機(jī)體 監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)。第四張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(1)探針帶來(lái) 細(xì)菌入侵(2)吞噬細(xì)胞趕 赴“現(xiàn)場(chǎng)”(3)消滅入侵恢復(fù)健康第五張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 機(jī)體防御機(jī)制人體第一道防線天然免疫(非特異性免疫)屏障結(jié)構(gòu)、非特異性免疫細(xì)胞和免疫分子組成。人體第二道防線獲得性免疫(特異性

3、免疫)分類：體液免疫 細(xì)胞免疫第六張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 抗感染免疫的構(gòu)成因素天然免疫與獲得性免疫的關(guān)系在抗感染免疫過(guò)程中，天然免疫與獲得性免疫相互依賴與協(xié)作，共同發(fā)揮消除病原微生物感染的作用。第七張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月吞噬細(xì)胞的吞噬和殺菌過(guò)程示意圖第八張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 特異性免疫包括兩個(gè)基本內(nèi)容：（1）免疫原性：抗原刺激有機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反 應(yīng)的能力；（2）反應(yīng)原性：抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生 特異性結(jié)合反應(yīng)的能力；抗原性：免疫原性和反應(yīng)原性的統(tǒng)稱。 三免疫分子及其在體液免疫中的作用、抗原與抗體簡(jiǎn)介抗 原(anti

4、gen) 定義：凡是能刺激有機(jī)體(人或動(dòng)物體)產(chǎn)生抗體， 并能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。第九張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(一)、抗 原1、抗原的基本性質(zhì)（1）異物性 （2）大分子量 （3）特異性 抗原刺激機(jī)體后只能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體并能與之結(jié)合。 特異性是由抗原表面的抗原決定基(簇) 決定的。 抗原決定基（表位）：抗原分子中決定抗原特異性的基 本結(jié)構(gòu)或具有化學(xué)活性的基團(tuán)。 抗原決定基是與抗體特異性結(jié)合的基本單位。（4）化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜 免疫原性的形成還要求蛋白質(zhì)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜。極性基團(tuán)愈多或含支鏈氨基酸愈多，以及帶芳香族氨基酸多的蛋白質(zhì)抗原性愈強(qiáng)。 第十張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)

5、作于2022年6月2、抗原的種類按抗原性的完整與否及其在機(jī)體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)， 可分為完全抗原和不完全抗原。（1）完全抗原與不完全抗原 完全抗原 既有免疫原性又有反應(yīng)原性。即能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并 與產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)或體外(試管內(nèi))發(fā)生反應(yīng)的抗原。 如細(xì)菌、病毒、外毒素、血清白蛋白、花粉蛋白、 不完全抗原（半抗原） 只有反應(yīng)原性而沒(méi)有免疫原性。即不能單獨(dú)刺激機(jī)體產(chǎn)生 抗體，若與蛋白質(zhì)或膠體顆粒結(jié)合，形成大分子復(fù)合物成 為完全抗原，則可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。 如各種低分子量的藥物、脂類和多糖等都屬于不完全抗原。第十一張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）細(xì)菌抗原第十二張，PPT共六十九

6、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月菌體抗原 （O抗原）在細(xì)胞壁上，主要抗原。主要成分為脂多糖。根據(jù)O抗原的組成不同進(jìn)行分群。O抗原耐熱，121，2h不被破壞。如沙門氏菌屬的O抗原不同分成67個(gè)血清群。 鞭毛抗原（H抗原）在鞭毛中，由蛋白質(zhì)組成，具有不同的種和型特異性，可作菌型鑒別。H抗原不耐熱，5680，3040min即被破壞。在制備O抗原時(shí)常用煮沸法消除H抗原。2、抗原的種類（2）細(xì)菌抗原第十三張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月表面抗原（表面抗原）包圍在細(xì)菌細(xì)胞壁最外面，故稱。表面抗原隨菌種和結(jié)構(gòu)的不同可有不同的名稱。如肺炎鏈球菌莢膜抗原；大腸桿菌、痢疾志賀氏菌 包膜抗原或K抗原，沙門氏菌屬V

7、i抗原等。菌毛抗原 存在于菌毛中的抗原，也具有特異的抗原性。外毒素和類毒素 細(xì)菌外毒素具有很強(qiáng)的抗原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗毒素抗體。外毒素經(jīng)0.3%0.4%甲醛溶液處理后使其失去毒性，但仍保持抗原性，即成為類毒素。2、抗原的種類（2）細(xì)菌抗原第十四張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(二)、抗 體(antibody,Ab)定義：抗原刺激有機(jī)體(人或動(dòng)物)所產(chǎn)生的具有特異性的免疫球蛋白。抗體是由B細(xì)胞識(shí)別抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一類糖蛋白，能與相應(yīng)抗原表位結(jié)合，是介導(dǎo)體液免疫的重要免疫分子。分泌型(secreted Ig,sIg)：膜型(membrane Ig,mlg)：在血清和組織液

8、中，占全部機(jī)體血清的20%25%。具有抗體的各種免疫功能是B細(xì)胞表面的抗原受體。含有免疫球蛋白的血清，稱為免疫血清或抗血清。第十五張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(二)、抗 體1、抗體的性質(zhì)（1）免疫球蛋白是一種糖蛋白，具有蛋白質(zhì)的通性。 凡能破壞球蛋白的各種理化因素均能使之滅活；能被多 種蛋白水解酶裂解；可以在乙醇、三氯醋酸或中性鹽類 中沉淀，生產(chǎn)上常用50%飽和硫酸銨或硫酸鈉從免疫血 清中提取抗體球蛋白。（2）在體外 (試管內(nèi))，抗體可與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié) 合并出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)； 在體內(nèi)，與其他防御機(jī)能協(xié)同作用下殺滅病原菌，起 到抗感染作用。但某些抗體在機(jī)體內(nèi)與相應(yīng)的抗原相遇時(shí)，

9、能引起變態(tài)反應(yīng)。如青霉素過(guò)敏等。第十六張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）由不同細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體具有不均一性和結(jié)構(gòu)的 多樣性。 例如將血清電泳時(shí)，免疫球蛋白主要分布于球蛋白區(qū)，因而曾稱抗體為球蛋白，也有少量延伸到區(qū)和2區(qū)。 抗體作為一種球蛋白，對(duì)異種動(dòng)物又是很好抗原。因此,抗體 即是抗體，又是抗原。利用此種特性可以制備抗免疫球蛋白 抗體(或稱抗抗體)，用于熒光抗體技術(shù)中(間接法)。1、抗體的性質(zhì)第十七張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、抗體的基本結(jié)構(gòu)兩條重鏈(H鏈)兩條輕鏈(H鏈)440個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約5070kD220個(gè)氨基酸組成，分子量約22.5kD。二硫

10、鍵(-SS-)根據(jù)重鏈的氨基酸順序同源程度的差異，可將Ig分為類和亞類。人的免疫球蛋白共5類：IgG 、IgA 、Ig M、IgD和IgE第十八張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、抗體的基本結(jié)構(gòu)N端可變區(qū)恒定區(qū)鍵間二硫鍵輕鏈重鏈C端CDR區(qū)識(shí)別抗原構(gòu)架區(qū)第十九張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、抗體的基本結(jié)構(gòu)第二十張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月免疫抗體3、抗體的種類 （1）根據(jù)抗體獲得方式分類天然抗體自身抗體（2）根據(jù)抗體作用對(duì)象分類抗菌性抗體抗毒性抗體抗病毒性抗體過(guò)敏性抗體動(dòng)物患傳染病后或經(jīng)人工注射疫苗后產(chǎn)生動(dòng)物先天就有的抗體，可以遺傳給后代 機(jī)體對(duì)自身組織成

11、分產(chǎn)生的抗體 細(xì)菌或內(nèi)毒素刺激機(jī)體所產(chǎn)生的抗體 細(xì)菌外毒素刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體 病毒刺激機(jī)體而產(chǎn)生的抗體，阻止病毒侵害異種動(dòng)物血清進(jìn)入機(jī)體后所產(chǎn)生的使動(dòng)物發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的抗體 第二十一張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、人工制備抗體（1）多克隆抗體(polyclonal antibody，PoAb) 定義： 將抗原免疫動(dòng)物，刺激動(dòng)物體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生 的抗體，是針對(duì)多種抗原決定基的混合抗體。特點(diǎn)： 來(lái)源廣泛、制備容易，但不易大量制備； 特異性不高，常出現(xiàn)交叉反應(yīng)；評(píng)價(jià)：應(yīng)用受到限制。第二十二張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、人工制備抗體（2）單克隆抗體(monoclona

12、l antibody，McAb) 原理: 淋巴細(xì)胞增殖分化的漿細(xì)胞 (來(lái)自脾臟，有抗原特異性,能產(chǎn)生抗體，但短壽) 骨髓瘤細(xì)胞 (無(wú)抗原特異性，但長(zhǎng)壽，能在體外無(wú)限繁殖) 利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合， 獲得既能在體外培養(yǎng)又能產(chǎn)生單一抗體的雜交瘤細(xì)胞。特點(diǎn)：純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、無(wú)或少血清交叉反應(yīng)， 制備成本低等特性。 已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。 第二十三張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、人工制備抗體單克隆抗體制備示意圖第二十四張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體制作過(guò)程第二十五張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、人工制備抗體（2）單克隆

13、抗體(monoclonal antibody，McAb) 應(yīng)用：已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。 對(duì)微生物病原體的鑒定。 特異性抗原或腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定。 疾病的被動(dòng)免疫治療和生物導(dǎo)向藥物的制備。 檢測(cè)血液中的藥物含量。 分離某些昂貴的生物活性物質(zhì)。 第二十六張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、人工制備抗體（3）基因工程抗體（重組抗體） 在基因水平上對(duì)Ig分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，重新組裝成的新型抗體分子。特點(diǎn)：保留天然抗體的特異性和主要生物學(xué)活性，去除或減少 了無(wú)關(guān)結(jié)構(gòu)，并可賦予抗體分子以新的生物學(xué)活性。迄今已成功構(gòu)建多種基因工程抗體，如人-鼠嵌合抗體、人源化抗體、單鏈

14、抗體(ScFv)、雙特異性抗體(BsAb)及噬菌體抗體等。 第二十七張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一. 抗原與抗體反應(yīng)的一般規(guī)律抗原抗體反應(yīng)：抗原與相應(yīng)抗體之間在體內(nèi)或體外所發(fā)生的 特異性結(jié)合反應(yīng)。體內(nèi)反應(yīng)：介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)：根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的 介質(zhì)不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié) 合反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測(cè)中多用血清作試驗(yàn)，故體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清學(xué)反應(yīng)。第四節(jié) 免疫學(xué)方法及其應(yīng)用第二十八張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)1.特異性與

15、交叉性 特異性：一種抗原只能與它相應(yīng)的抗體結(jié)合。交叉性：兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、 抗體間構(gòu)型部分相同，就可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2.可逆性 抗體與抗原的結(jié)合是分子表面的一種物理結(jié)合即非共價(jià)鍵的結(jié)合，在一定條件下可以發(fā)生解離。分開(kāi)后，二者的性質(zhì)不變。3.定比性 抗原物質(zhì)是多價(jià)的；抗體是雙價(jià)的?？乖贵w的結(jié)合是抗原抗體抗原抗體這樣順次結(jié)合，只有當(dāng)兩者比例合適時(shí)，聚集成較大的復(fù)合物才能出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。第二十九張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)3.定比性圖7-4 沉淀反應(yīng)的曲線每一個(gè)Y字形的Ig單體分子能結(jié)合2個(gè)抗原表位，稱之為兩價(jià)； 分泌型IgA為4價(jià)；五聚

16、體IgM理論上為10價(jià)，但由于立體構(gòu)型 的空間阻位，一般只能結(jié)合5個(gè)抗原表位。第三十張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)4.階段性 第一階段：發(fā)生特異性反應(yīng)，特點(diǎn)是反應(yīng)快，不被肉眼所見(jiàn)。第二階段：可見(jiàn)階段，是非特異性的。反應(yīng)較慢，受到電解 質(zhì)、pH值和溫度的影響。5.敏感性 高度的敏感性，用于定性，還可用于定量和定位。第三十一張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響抗原抗體反應(yīng)的因素1.電解質(zhì)4.雜質(zhì)異物0.85的NaCl生理鹽水2.溫度 37水浴3.pH值多數(shù)血清學(xué)反應(yīng)的適宜pH值為68第三十二張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、抗原、抗體間的主要

17、反應(yīng)1、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、免疫電泳4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 第三十三張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、主要抗原抗體反應(yīng)(一)、凝集反應(yīng) 定義：顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在有電解質(zhì)合適條件下反應(yīng) 并出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集團(tuán)現(xiàn)象。（凝集原，凝集素） 一般稀釋抗體(抗血清)，使其與抗原有一合適比例。1 直接凝集反應(yīng) 玻片法 定性試驗(yàn)。用已知抗體檢測(cè)未知抗原。 用途：鑒定菌種，菌種分型，測(cè)定ABO血型等。 試管法 定量試驗(yàn)。用已知抗原測(cè)定血清中抗體有無(wú)及相對(duì)含量 發(fā)生明顯凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度（抗體效價(jià)，滴度 )，以表示血清中抗體的相對(duì)含量。 用途：測(cè)定患傳染病的人或家畜血清中的抗體，診斷第三十四

18、張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、主要抗原抗體反應(yīng)2. 間接凝集反應(yīng)定義：利用某些與免疫無(wú)關(guān)的均一的小顆粒物質(zhì)作為載體， 將可溶性抗原(或抗體)吸附于表面，如與相應(yīng)的抗體 (或抗原)結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，發(fā)生 凝集現(xiàn)象。表面吸附抗原(或抗體)的載體微球稱為免疫微球。特點(diǎn)：增大體積，敏感，可檢測(cè)極微量抗原。根據(jù)所用載體不同，常用的間接凝集反應(yīng)有間接血球凝集反應(yīng)，碳凝集反應(yīng)，乳膠凝集反應(yīng)等。還有間接凝集抑制反應(yīng)，第三十五張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十六張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、主要抗原抗體反應(yīng)(二)、沉淀反應(yīng) 定義：可溶性抗原與相應(yīng)抗體

19、結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在條 件下，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物。（沉淀原，沉淀素） 凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的區(qū)別： 凝集反應(yīng)的抗原是顆粒性抗原，總表面積小，做抗體稀釋。 沉淀反應(yīng)的抗原是可溶性的膠體溶液，單位面積抗原多，需 抗體量多，抗原稀釋。 以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。 類型：環(huán)狀法、絮狀法和瓊脂擴(kuò)散法（單向和雙向）。第三十七張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、主要抗原抗體反應(yīng)圖7-5 瓊脂雙向擴(kuò)散的幾種不同方式結(jié)果示意圖第三十八張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3、免疫電泳 將瓊脂擴(kuò)散和電泳技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。 特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、很高的靈敏性和分辨力。 用途：分析抗原

20、或抗體純度。 類型：對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、雙向免疫電泳、瓊脂免疫 電泳。（1）對(duì)流免疫電泳 這是一種將雙向擴(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合而成的方法。 原理：抗原與抗體分別置于凝膠板電場(chǎng)負(fù)、正極附近的小孔 中，通電后，抗原向正極移動(dòng)，而抗體則向負(fù)極移動(dòng) ，結(jié)果在兩孔間合適的抗原、抗體濃度處會(huì)形成一條 沉淀線。 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲種胎兒蛋白(AFP)等的檢測(cè)。第三十九張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、免疫電泳（2）火箭免疫電泳定義：抗原在含定量抗體的瓊脂中向一個(gè)方向泳動(dòng)，兩者比例合適時(shí)，在較短時(shí)間內(nèi)生成如火箭狀或錐狀的沉淀線。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。圖7-

21、6 火箭電泳結(jié)果示意圖第四十張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）雙向免疫電泳這是一種將火箭電泳與血清免疫電泳相結(jié)合的方法定義：先將血清用電泳分離出各成分，然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移 至另一已加有抗血清的凝膠上，進(jìn)入垂直方向的第二 次電泳，形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線。 圖7-7 雙向免疫電泳示意圖 第四十一張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、免疫電泳（4）瓊脂免疫電泳先進(jìn)行瓊脂平板電泳再做雙向瓊脂擴(kuò)散的血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。定義：先將抗原樣品在瓊脂凝膠中電泳，不同抗原成分因其遷移率的不同而分離成區(qū)帶，挖一條平行的抗體槽，加入抗血清做雙向擴(kuò)散，在兩者比例適合處形成可見(jiàn)的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線

22、的數(shù)量、位置和形狀，即可分析樣品中所含的抗原成分和含量。瓊脂免疫電泳示意圖第四十二張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(三)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)定義：有補(bǔ)體參與，并以綿羊紅血球和溶血素(紅細(xì)胞的 特異抗體)是否發(fā)生溶血反應(yīng)作指示的一種高靈敏 度的抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)。原理：補(bǔ)體沒(méi)有特異性，可與任何抗原抗體復(fù)合物發(fā)生結(jié) 合(即不能與單獨(dú)的抗原或抗體結(jié)合)，一旦結(jié)合后 并不再游離，但不能顯示肉眼可見(jiàn)現(xiàn)象。通常應(yīng)用溶血系統(tǒng)作為指示劑，以判定補(bǔ)體是否已被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。游離補(bǔ)體，就會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的溶血反應(yīng)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)有抗原、抗體、補(bǔ)體、紅血球、溶血素5種成分參加，并分屬于反應(yīng)系統(tǒng)和指示系統(tǒng)。第四十

23、三張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 圖7-9 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)示意圖 第四十四張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（1）反應(yīng)系統(tǒng)(試驗(yàn)系統(tǒng)、結(jié)合系統(tǒng)) 由已知抗原(或抗體)、被檢抗體(或抗原)和補(bǔ)體組成。先加入抗原、抗體，再加入補(bǔ)體，混合后作用一定時(shí)間。如果抗原和抗體相對(duì)應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，則補(bǔ)體就被結(jié)合，否則即為游離狀態(tài)。（2）指示系統(tǒng)(溶血系統(tǒng))由紅血球(抗原)和溶血素(抗體)組成。在反應(yīng)系統(tǒng)完畢后，再向試管內(nèi)加入綿羊紅血球和溶血素。不發(fā)生溶血：補(bǔ)體被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，陽(yáng)性反應(yīng)。發(fā)生溶血： 液體中的抗原抗體不相對(duì)應(yīng)，沒(méi)有發(fā)生結(jié)合， 補(bǔ)體依然

24、游離存在，反應(yīng)陰性。第四十五張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、免疫標(biāo)記技術(shù)現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)包括免疫標(biāo)記技術(shù)、免疫定位分析、免疫親和層析和免疫生物傳感器技術(shù)等，其中尤以免疫標(biāo)記技術(shù)發(fā)展最快，應(yīng)用最廣。免疫標(biāo)記技術(shù)：將某些小分子物質(zhì)作為標(biāo)記劑（如熒光素、酶、放射性同位素或電子致密物質(zhì)等）結(jié)合到抗原或抗體上，不 抗原抗體反應(yīng)，更容易觀察，提高檢測(cè)的靈敏度。標(biāo)記劑：與抗原或抗體結(jié)合的小分子物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，反應(yīng)速度快，容 易觀察； 既可用于定性、定量分析，又可用于分子定位等工作 第四十六張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月現(xiàn)代免疫技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)1、免疫熒光技

25、術(shù)2、免疫酶技術(shù)3、放射免疫測(cè)定法4、免疫電鏡技術(shù)第四十七張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月定義：一種將結(jié)合有熒光素的熒光抗體與抗原反應(yīng)，以提高 免疫反應(yīng)靈敏度和適合顯微鏡觀察的免疫標(biāo)記技術(shù)。熒光素濃度在10-8時(shí)，仍可受激發(fā)而射出肉眼可見(jiàn)的熒光。原理：在一定條件下以化學(xué)方法將熒光素與抗體結(jié)合，制成 熒光素抗體，但不影響抗體的免疫活性。如果標(biāo)本中 的抗原與熒光素抗體結(jié)合著染后，在熒光顯微鏡下成 為發(fā)出熒光的可見(jiàn)物體，即可達(dá)到檢出抗原的目的。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)和羅丹明(RB200)，在藍(lán)紫光激發(fā)下，分別發(fā)出鮮明的綠色熒光和橙黃色熒光?；痉椒ǎ褐苯臃?，間接法、補(bǔ)體結(jié)

26、合法和標(biāo)記法。 (一)、免疫熒光技術(shù)（熒光抗體法）第四十八張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(一)、免疫熒光技術(shù)（熒光抗體法）（1）直接法（2）間接法（3）補(bǔ)體結(jié)合法（4）標(biāo)記法圖7-10 免疫熒光抗體法原理示意圖第四十九張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月直接免疫熒光法第五十張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月間接接免疫熒光法第五十一張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 免疫熒光技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。 一種酶作標(biāo)記的抗體或抗抗體的高靈敏度的免疫標(biāo)記技術(shù)。原理：利用酶與抗原或抗體結(jié)合后，既不改變抗原或抗體的 疫學(xué)反應(yīng)特異性，也不影響酶本身的活性，在特異抗

27、 原抗體反應(yīng)后，于相應(yīng)而合適的酶底物作用下，產(chǎn)生 可見(jiàn)的不溶性有色產(chǎn)物。與免疫熒光技術(shù)區(qū)別：有色的沉淀物可在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞水平的抗原追蹤，也可在電子顯微鏡下進(jìn)行分子水平的觀察，又能用分光光度計(jì)定量測(cè)定酶作用底物分解的量。(二)、免疫酶技術(shù)（酶免疫測(cè)定技術(shù)）目前常用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，也有用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體第五十二張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(二)、免疫酶技術(shù)（酶免疫測(cè)定技術(shù)）1.酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbant assay， ELISA，酶標(biāo)法) ELISA 是目前應(yīng)用最廣泛的生物學(xué)技術(shù)之一。 原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載

28、體表面，并保持免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo) 抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISA試驗(yàn)中需要有3種試劑：固相的抗原或抗體。 目前多用聚苯乙烯酶標(biāo)板(微量滴定板)作為固相載體酶標(biāo)記的抗原或抗體。酶作用的底物。第五十三張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗原捕獲ELISA第五十四張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、把抗體固定在固相支持物上（96孔板）；2、加入蛋白質(zhì)樣品保溫，再洗去未結(jié)合的雜蛋白；3、加入第二抗體，第二抗體結(jié)合一個(gè)供檢測(cè)用的酶（辣根過(guò)氧化物酶）4、洗去未結(jié)合第二抗原，酶活測(cè)定。第五十五張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于202

29、2年6月第五十六張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ELISA for HIV antibodyMicroplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity第五十七張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(二)、免疫酶技術(shù)（酶免疫測(cè)定技術(shù)）1. 酶聯(lián)免疫吸附法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，特異性強(qiáng)。酶標(biāo)抗體制備容易，且高度穩(wěn)定而有效期長(zhǎng)。操作簡(jiǎn)便應(yīng)用范圍廣泛。 ELISA技術(shù)用于檢測(cè)多種病原菌抗原或抗體、血液及其 他體液中微量蛋白成分、細(xì)胞因子等。 在食品加工領(lǐng)域，ELISA技術(shù)可用于測(cè)定蛋白質(zhì)，也可 用于測(cè)定各種生物活性

30、成分，如異黃酮半抗原。在食品安全方面，用于檢測(cè)食品中農(nóng)藥殘留，以及檢測(cè)食品中的病原菌及其毒素，如沙門氏菌及其內(nèi)毒素和腸毒素、大腸桿菌及其腸毒素和腸細(xì)胞出血毒素、金黃色葡萄球菌及其腸毒素、霉菌和真菌毒素。第五十八張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 酶聯(lián)免疫吸附法ELISA方法：將可溶性抗體或抗原吸附到聚苯乙烯等固相載體 上，再滴加酶標(biāo)記的抗原或抗體，然后添加底物 ，進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，以酶標(biāo)儀測(cè)定。 雙抗體夾心法 本法用于檢測(cè)抗原。圖7-11 雙抗體夾心法測(cè)抗原示意圖 標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗體 底物 固相抗體第五十九張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.酶聯(lián)免疫吸附法間接法 圖7-

31、11 間接法測(cè)抗原示意圖 標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗體 底物 固相抗原第六十張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 酶聯(lián)免疫吸附法斑點(diǎn)酶免疫吸附法 (dot-ELISA) 本法原理與上述兩法相同，方法上的不同之處是：A 用硝酸纖維薄膜取代上述微量滴定板；B 最終顯色反應(yīng)是不溶于水的有色沉淀物，例如，堿性磷酸酶的底物不能用對(duì)硝基酚磷酸鹽，而要用氮藍(lán)四唑(NBT)等。最終可從薄膜上沉淀物顏色的有無(wú)或多少確定結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高(比普通ELISA高10100倍)，與放射免疫測(cè)定相當(dāng)。第六十一張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.酶聯(lián)免疫吸附法生物素-親和素系統(tǒng)（BAS)在ELISA中的應(yīng)用

32、 親和素是存在于蛋清中的堿性糖蛋白，一個(gè)親和素分子由4個(gè)亞基組成，可與4個(gè)生物素分子穩(wěn)定結(jié)合；生物素是存在于蛋黃中的維生素H，化學(xué)方法制成的生物素衍生物生物素-羥基琥珀亞胺酯(BNHS)可與蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原、抗體、酶、熒光素、核苷酸等結(jié)合形成生物素化的分子。生物素與親和素結(jié)合具有高度親和力，且均能耦聯(lián)抗體、抗原和辣根過(guò)氧化物酶而不影響其生物學(xué)活性。第六十二張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 酶聯(lián)免疫吸附法生物素-親和素系統(tǒng)（BAS)在ELISA中的應(yīng)用 在生物素-親和素系統(tǒng)中，借助所形成的親和素-生物素酶復(fù)合物，追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)酶催化底物顯色，可檢出相應(yīng)的抗體或抗原。由于抗原或抗體分子可耦聯(lián)多個(gè)生物素，且1個(gè)親和素分子可結(jié)合4個(gè)生物素分子，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。如此組成的新生物放大系統(tǒng)，進(jìn)一步提高ELISA檢測(cè)的靈敏度。BAS除用于抗原抗體檢測(cè)外，還可用于檢測(cè)DNA和RNA。第六十三張，PPT共六十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 酶聯(lián)免疫吸附法生物素-親和素系統(tǒng)（BAS)在ELISA中的應(yīng)用 生物素-親和素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大。可以在固相上預(yù)先包被親和素，再用吸附法包被固相的抗體或抗原，進(jìn)而再與生物素結(jié)合，通過(guò)生物素-親和素反