微遺-同源重組的應(yīng)用ppt課件

1、同源重組的運(yùn)用09生工夏章傳同源重組概述同源重組homologous recombination即普通重組，是染色體之間進(jìn)展遺傳信息的方式之一，幾乎一切生物都發(fā)生同源重組。如真核生物減數(shù)分裂中染色體的交換，細(xì)菌結(jié)合、轉(zhuǎn)化、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳重組都屬于同源重組。同源重組要求兩個(gè)DNA分子的序列同源，同源區(qū)越長(zhǎng)越有利于重組；同源區(qū)太短，那么難于發(fā)生重組。由于它依賴(lài)于大范圍DNA同源順序的聯(lián)會(huì)，擔(dān)任DNA配對(duì)和重組的蛋白質(zhì)因子無(wú)堿基序列特異性，只需兩條DNA序列一樣或相近，重組便可以在聯(lián)會(huì)部分的任何位置發(fā)生。當(dāng)然，也存在重組熱點(diǎn)，即某些序列發(fā)生重組的概率高于其它序列。同源重組也是對(duì)損傷DNA修復(fù)的一種

2、重要途徑，即重組修復(fù)。同源重組的運(yùn)用同源重組的運(yùn)用價(jià)值 主要是用于基因敲除knock-out和基因敲進(jìn)(knock-in) 研討基因功能 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備 用于藥物挑選的動(dòng)物模型 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為“生物反響器消費(fèi)藥物基因敲進(jìn)和敲進(jìn)基因敲除knock out of gene:是基因打靶技術(shù)的一種，指外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列一樣或相近的基因發(fā)生同源重組，從而替代受體細(xì)胞基因組中的一樣或類(lèi)似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中。基因敲進(jìn)knock in of gene：利用基因同源重組，將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因組中不存在或已失活的細(xì)胞中與其基因組中同源序列進(jìn)展同源重組，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)，這

3、一技術(shù)稱(chēng)為基因敲進(jìn)?；蚯贸颓眠M(jìn)的原理都是同源重組，即同源雙交換，用克隆的外源基因取代基因組中野生型等位基因。兩者不同點(diǎn)在于，基因敲除導(dǎo)入的外源基因是失活的、無(wú)功能的基因，基因敲進(jìn)導(dǎo)入的是有活性和功能的基因。因此兩者的詳細(xì)用途有所不同?；蚯贸颓眠M(jìn)都可用于基因功能的研討，基因敲進(jìn)那么也可用于突變基因的修復(fù)。 基因敲除是自80年代末以來(lái)開(kāi)展起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是經(jīng)過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是運(yùn)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而到達(dá)基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的開(kāi)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被運(yùn)用，比

4、較勝利的有基因的插入突變和iRNA，它們同樣可以到達(dá)基因敲除的目的。小鼠基因敲除實(shí)驗(yàn)基因敲出實(shí)踐操作簡(jiǎn)要步驟：1、克隆目的基因及其兩側(cè)的DNA序列。2、經(jīng)過(guò)插入抗性基因或者DNA缺失，對(duì)克隆的目的基因進(jìn)展體外遺傳改造，使克隆的目的基因失活。3、將經(jīng)體外改造失活的目的基因引入受體細(xì)胞，使之與野生型基因進(jìn)展同源重組。這兩種基因取代，都是是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點(diǎn)，用同源序列的目的基因整個(gè)置換內(nèi)源基因。目前用于基因敲除的技術(shù)有Cre/Lox P系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等。此法可產(chǎn)生準(zhǔn)確的基因突變，也可正確糾正機(jī)體的基因突變。 研討基因功能細(xì)菌和一些低等真核生物在進(jìn)展基因取代時(shí)，克隆的基因能準(zhǔn)確地

5、插入到染色體的同源部位，所以他們是研討基因取代的理想資料?；蛉〈ǔ齽倮糜诩?xì)菌和酵母菌的基因分析外，還勝利地運(yùn)用到老鼠和雞的基因功能分析中。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的運(yùn)用領(lǐng)域1、生物反響器：藥用或食品蛋白的大量消費(fèi)，即轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥；2、疾病的動(dòng)物模型：用于研討、藥物挑選、藥物治療、毒物測(cè)試；3、經(jīng)過(guò)添加或刪除基因來(lái)研討基因的功能、調(diào)控和發(fā)育，如癌基因、免疫系統(tǒng)等；4、異種器官的移植；5、家畜種類(lèi)的改良。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的運(yùn)用領(lǐng)域 用于藥物挑選的動(dòng)物模型誘發(fā)性或?qū)嶒?yàn)性動(dòng)物模型ExperimentalAnimalModels 用同源重組的方法，將致病要素作用于動(dòng)物，呵斥動(dòng)物組織、器官或全身一定

6、的損害，出現(xiàn)某些類(lèi)似人類(lèi)疾病時(shí)的功能、代謝或毒使動(dòng)物患相應(yīng)的傳染病，又如用化學(xué)致癌劑、放射線(xiàn)、致癌病毒誘發(fā)動(dòng)物的腫瘤等。誘發(fā)性疾病動(dòng)物模型具有能在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出大量疾病模型，并能?chē)?yán)厲控制各種條件使復(fù)制出的疾病模型適宜研討目的需求等特點(diǎn)，因此為近代醫(yī)學(xué)研討所常用，特別是藥物挑選研討任務(wù)所首選。但誘發(fā)模型和自然產(chǎn)生的疾病模型在某些方面畢竟存在一定差別。因此在設(shè)計(jì)誘發(fā)性動(dòng)物模型要盡量抑制其缺乏，發(fā)揚(yáng)其特點(diǎn)。 用于藥物挑選的動(dòng)物模型用于藥物挑選的動(dòng)物模型例如：帕金森病動(dòng)物模型，用于藥物挑選。建立抗丙型肝炎病毒藥物挑選的動(dòng)物模型。精神分裂癥動(dòng)物模型及其藥物挑選。高尿酸血癥動(dòng)物模型的建立及抗痛風(fēng)中藥的挑選

7、。要求：一類(lèi)似性二反復(fù)性三可靠性四適用性和可控性 五易行性和經(jīng)濟(jì)性。 用于藥物挑選的動(dòng)物模型動(dòng)物模型的意義和優(yōu)越性 ：一防止了在人身上進(jìn)展實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn) 。二臨床上平常不易見(jiàn)到的疾病可用動(dòng)物隨時(shí)復(fù)制出來(lái)。三可以抑制人類(lèi)某些疾病埋伏期長(zhǎng)，病程長(zhǎng)和發(fā)病率低的缺陷 。四可以嚴(yán)厲控制實(shí)驗(yàn)條件，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)資料的可比性 。五可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作和樣品搜集 。六有助于更全面地認(rèn)識(shí)疾病的本質(zhì)。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為“生物反響器消費(fèi)藥物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物消費(fèi)藥物不僅開(kāi)辟了制藥業(yè)的新紀(jì)元，而且它也是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研討最活潑的領(lǐng)域。基因工程藥物3 個(gè)階段:1、細(xì)菌基因工程，即把目的基因經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)母慕▽?dǎo)入大腸桿菌中，再經(jīng)過(guò)細(xì)菌等原核微

8、生物表達(dá)的目的蛋白作為藥物;2、是細(xì)胞基因工程藥物，這是把人或哺乳動(dòng)物的基因直接導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，消費(fèi)有生物活性的產(chǎn)品;3、其三是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物消費(fèi)低本錢(qián)、高活性的藥物。一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是把外源基因?qū)雱?dòng)物的生殖細(xì)胞中，并整合該細(xì)胞后發(fā)育成為個(gè)體整合的外源基因，整合的外源基因又能影響其后代遺傳的動(dòng)物。藥用蛋白基因表達(dá)細(xì)胞株細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因動(dòng)物消費(fèi)藥用蛋白的根本過(guò)程受體動(dòng)物供體動(dòng)物受精卵無(wú)核受精卵組裝的核細(xì)胞多細(xì)胞胚胎假孕動(dòng)物動(dòng)物幼崽雌性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁藥用蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物消費(fèi)藥物的優(yōu)點(diǎn)：1、種類(lèi)多、產(chǎn)量高、質(zhì)量好。2、設(shè)備簡(jiǎn)單、不耗能、無(wú)環(huán)鏡污染。3、消費(fèi)周期短。4、消費(fèi)本錢(qián)低。2006年報(bào)道：我國(guó)目前已有乳鐵蛋白、白蛋白、凝血因子等進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，首個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物消費(fèi)的藥物有望在5年內(nèi)上市。“終究是哪種轉(zhuǎn)基因藥物率先上市，還得由臨床療效說(shuō)了算。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就是指經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)方法，人工地把外源基因?qū)雱?dòng)物的受精卵， 使外源基因與動(dòng)物本身的基因組整合在一同，因此外源基因能隨細(xì)胞的分裂而增殖，并能穩(wěn)定地遺傳給下一代。在此根底上，人們只需將事先提取到的藥用蛋白注射到牛、羊等身上，當(dāng)它們的下一代出生，人們便可以從其體內(nèi)提取更多的藥用蛋白。簡(jiǎn)單地說(shuō)，就像在動(dòng)物的體內(nèi)批量消費(fèi)藥物一樣。此前，我國(guó)科學(xué)家曾在上海勝利研制