中國藥典微生物限度檢查和相關(guān)的發(fā)展趨勢

1、中國藥典微生物限度檢查和相關(guān)的發(fā)展趨勢2無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷3微生物限度檢查現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢1、方法和標(biāo)準(zhǔn)的修訂與完善2、技術(shù)現(xiàn)狀與標(biāo)準(zhǔn)化3、微生物限度檢查的幾個問題4、微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則5、抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則6、藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則7、藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則4 1、方法和標(biāo)準(zhǔn)的修訂與完善表8 中國藥典2005版微生物限度檢查法與英美藥典比較比較項(xiàng)目ChP2005USP29BP2002檢驗(yàn)條件規(guī)定總體10000級、局部100級無具體規(guī)定無具體規(guī)定計(jì)數(shù)測定方法平皿法、

2、薄膜過濾法、MPN平皿法、MPN平皿法、薄膜過濾法、MPN控制大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌(10)、銅綠假單胞菌、金葡球菌、梭菌、其他致病菌大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金葡球菌、大腸菌群、腸道菌、腸桿菌科大腸埃希菌、沙門菌(10)、銅綠假單胞菌、金葡球菌；腸桿菌科及某些革蘭陰性菌稀釋液pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液；pH6.8/7.6PBS；0.9%NaClpH7.2PBS；大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基/乳糖肉湯培養(yǎng)基pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液；乳糖肉湯/其他培養(yǎng)基培養(yǎng)條件與時間細(xì)菌數(shù)：營養(yǎng)瓊脂，48hrs霉菌及酵母：玫瑰紅鈉瓊脂，72hrs,57天需氣菌總數(shù)：大豆酪蛋白消化物瓊脂，4872

3、hrs霉菌及酵母：沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡萄糖瓊脂，57天需氣菌總數(shù)：大豆酪蛋白消化物瓊脂，5天霉菌及酵母：含抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂、大豆酪蛋白消化物瓊脂，5天控制菌檢查結(jié)果判斷與復(fù)試規(guī)定一次檢出為準(zhǔn)不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，取大于25g的樣品復(fù)試一次檢出為準(zhǔn)計(jì)數(shù)結(jié)果判斷與復(fù)試規(guī)定第一次結(jié)果超過規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)試兩次，三次結(jié)果平均報(bào)告不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，取大于25g的樣品復(fù)試測定結(jié)果在規(guī)定的限度標(biāo)準(zhǔn)5倍以內(nèi)均為合格5樣品10g或10ml+緩沖液至100ml總需氧菌TSA,35 ,48-72h真菌SDA(PDA),20-25 ,5-7d結(jié)果(cfu/ml or g) 取1ml樣品液圖14 USP、BP總需氣菌/霉

4、菌及酵母菌計(jì)數(shù)流程總需氣菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)中國藥典: 玫瑰紅鈉瓊脂, 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂6對供試品的前處理和一些檢驗(yàn)方法進(jìn)行了完善；具有明顯的中國特色，與國際差距顯著。計(jì)數(shù)測定體系的差異： 難以操作，檢驗(yàn)繁瑣 需氣菌總數(shù)=細(xì)菌數(shù)+霉菌及酵母菌？ 1000 1000 100參見：美英歐藥典微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的淺析，蘇德模、胡昌勤、馬越，中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005年第3期1、方法和標(biāo)準(zhǔn)的修訂與完善7Harmonization(USP/EP/JP):Microbiological Examination of Nonsterile Products The USP and the EP Microbi

5、al Limits Tests are in the final stages of harmonization.They were signed off to Stage6A at the November,2005 meeting of the PDG held in Chicago,IL USA (USP 2006a). Stage6A:REGIONAL ADOPTION USP31 General Information/ Phmarmacopeial Harmonization: The following policy statement was approved by the P

6、DG at its September 2002 meeting. Table2. Status of Harmonization-General Chapters Tests for specified microorganisms EP Stage4 Microbial Enumeration EP Stage4 Microbial Attributes EP Stage4 Stage4:Official Inquiry8Harmonization(USP/EP/JP):Microbiological Examination of Nonsterile ProductsUSP31 Guid

7、e to General Chapters/Chart10 As of May1,2009 chapterMicrobial Limits Tests will be replaced by Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests,and the new chapter Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms will become offic

8、ial. Also on May1,2009,Chapter Microbial Attributes of Nonsterile Pharmaceutical Products will be replaced by Microbiological Examination of Nonsterile Products: Acceptance Criteria for Pharmaceutical Preparations and Substances for Pharmaceutical Use. This general chaper presents 2 sets of tests. T

9、he 1st set gives the reference methods for determining compliance with monographs. Reference to this chapter in a monographs therefore implies compliance with the 1st set of tests, unless use of the 2nd set of tests has been authorised. The tests in the 2nd set also constitute official methods of th

10、e EP and may be refered to as such, notably in applications for marketing authorisation. It is intended to replace the 1st set by the 2nd set once the monographs concerned have been revised. The 2nd set presents tests developed in co-operation with the JP and USP to achieve harmonised requirements.

11、9Harmonization(USP/EP/JP):Microbiological Examination of Nonsterile Products USPEPMicrobiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests2.6.12 Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests Microbiological Examination of Nonsterile Products:

12、Tests for Specified Microorganisms 2.6.13 Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms Microbiological Examination of Nonsterile Products: Acceptance Criteria for Pharmaceutical Preparations and Substances for Pharmaceutical Use5.1.4 Microbiological Quality

13、of Nonsterile Pharmaceutical ProductsHarmonization Timing/IssuesEP:2007/01 USP:2009/05 JP:2007/10 101、方法和標(biāo)準(zhǔn)的修訂與完善2010年版中國藥典微生物限度檢查法 附錄XIII C（一部） 附錄XI J （二部）引入培養(yǎng)基適用性實(shí)驗(yàn)增加白色念珠菌檢查法貼膏劑檢查方法的改進(jìn)限度標(biāo)準(zhǔn)表示方法改變112010年版微生物限度檢查法修訂1、附錄107頁，微生物限度檢查法供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對微生物（的生長和存活無影響）無毒性。除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌及控

14、制菌培養(yǎng)溫度為3035；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為2328（；控制菌培養(yǎng)溫度為3537）。檢驗(yàn)結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2 為單位報(bào)告，特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告。122010年版微生物限度檢查法修訂2、附錄107頁，檢驗(yàn)量除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；（中藥）膜劑為（50）100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽性對照試驗(yàn) ）。132010年版微生物限度檢查法修訂3、附錄107頁，膜劑供試品取供試品（50）100cm2，剪碎，加（50ml或）100ml的無菌

15、氯化鈉-蛋白胨緩沖液（必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為110（或120）的供試液。142010年版微生物限度檢查法修訂4、附錄108頁，新增：貼膏劑供試品 取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護(hù)層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30分鐘，或以其他方法制備成供試液。152010年版微生物限度檢查法修訂5、附錄108頁，修訂：離心沉淀法 取一定量供試液，500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取全部上清液混合。用于細(xì)菌檢查。162010年版微生物限度檢查法

16、修訂6、附錄108頁，增加：計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，包括成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。菌種 驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44 102金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26 003枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63 501白色念珠菌（Candida albicans）CM

17、CC（F）98 001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98 003172010年版微生物限度檢查法修訂6、附錄108頁，增加：計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)57天，加入35ml 含（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后

18、，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液。菌懸液制備后應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在28的菌懸液可以在24小時內(nèi)使用。黑曲霉也可制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在28，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)替代對應(yīng)量的新鮮孢子懸液使用。182010年版微生物限度檢查法修訂6、附錄108頁，增加：計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)48hr，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50100c

19、fu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2025培養(yǎng)72hr，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌50100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2025培養(yǎng)72hr，計(jì)數(shù)。同時，用對應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定 被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比大于70%，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。192010年版微生物限度檢查法修訂7、附錄109頁，增加：表1常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛亞硫酸氫納酚類、

20、乙醇、吸附物稀釋劑醛類稀釋劑、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯、卵磷脂、聚山梨醇酯汞類制劑亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類化合物卵磷脂碘酒、洗必泰類聚山梨醇酯鹵化物硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸（EDTA）鎂或鈣離子磺胺類對氨基苯甲酸-內(nèi)酰胺類抗生素-內(nèi)酰胺酶202010年版微生物限度檢查法修訂8、附錄109頁，增加：若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那么驗(yàn)證試驗(yàn)中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗(yàn)菌污染。然而，供試品也可能僅對試驗(yàn)用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)

21、報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。若驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進(jìn)行供試品檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時，若采用上述計(jì)數(shù)方法總存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求，那么選擇回收情況最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢測。212010年版微生物限度檢查法修訂9、附錄109頁，修訂：供試品檢查（法）（取按驗(yàn)證的方法制備的均勻供試液，）按計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)確認(rèn)的程序進(jìn)行供試液制備。用無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成110、1102、1103等稀釋級。1.平皿法（采用平皿法進(jìn)行菌數(shù)測定時，應(yīng)取適宜的連續(xù)23個稀釋級

22、的供試液。）222010年版微生物限度檢查法修訂10、附錄109頁，修訂：培養(yǎng)和計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)（48小時）3天，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以（48小時）3天的菌落數(shù)報(bào)告；霉菌、酵母菌培養(yǎng)（72小時）5天，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以（72小時）5天的菌落數(shù)報(bào)告；必要時，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至（5）7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。232010年版微生物限度檢查法修訂11、附錄109頁，修訂：菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 細(xì)菌、酵母菌宜選?。?xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)在30300之間）小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)（在30100之間）小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以

23、稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、1mL或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。242010年版微生物限度檢查法修訂12、附錄109頁，修訂：薄膜過濾法采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于，直徑（約）一般為50mm，若采用其它直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整?？倹_洗量不得超過1000ml(每片濾膜的總過濾量不宜過大)，以避免濾膜上的微生物受損傷。252010年版微生物限度檢查法修訂13、附錄110頁，增加：控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。檢查項(xiàng)目包括培養(yǎng)基的促生長、指示和抑制特性能力。菌種 對試驗(yàn)菌種的要求同計(jì)數(shù)培

24、養(yǎng)基的適用性檢查。大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003乙型付傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）CMCC（B） 50 094銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B） 10 104生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（B） 64 941白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 00126控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能

25、力金黃色葡萄球菌MUG培養(yǎng)基促生長能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂促生長能力+指示能力大腸埃希菌大腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基促生長能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂促生長能力+指示能力大腸埃希菌沙門菌營養(yǎng)肉湯促生長能力乙型付傷寒沙門菌四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基促生長能力乙型付傷寒沙門菌抑制能力金黃色葡萄球菌膽鹽硫乳瓊脂或沙門、志賀氏屬瓊脂促生長能力+指示能力乙型付傷寒沙門菌曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂促生長能力+指示能力乙型付傷寒沙門菌27控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力銅綠假單胞菌

26、抑制能力金黃色葡萄球菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂促生長能力銅綠假單胞菌抑制能力大腸埃希菌綠膿菌素測定用培養(yǎng)基促生長能力+指示能力銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基促生長能力金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇鹽瓊脂促生長能力+指示能力金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基促生長能力生孢梭菌哥倫比亞瓊脂促生長能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉湯促生長能力白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂促生長能力+指示能力白色念珠菌念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大腸埃希菌吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)物促生長能力+指示能力白色念珠菌282010年版微生物限度檢查法修

27、訂13、附錄111頁，增加：控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查增菌培養(yǎng)基促生長能力檢查：分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。固體培養(yǎng)基促生長能力檢查：取試驗(yàn)菌各（50100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板中，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比生長的菌落形態(tài)應(yīng)一致。培養(yǎng)基抑制能力檢查：劃線接種試驗(yàn)菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度和時間

28、下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長。培養(yǎng)基指示能力檢查：分別接種少量試驗(yàn)菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度和時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌生長的菌落形態(tài)、大小、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。292010年版微生物限度檢查法修訂14、附錄111頁，修訂：控制菌檢查方法的驗(yàn)證刪除陰性菌對照組15、附錄113頁，修訂：梭菌上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的（0.1%新鮮庖肉）梭菌增菌培養(yǎng)基中，（各培養(yǎng)基管在）置厭氧條件下培養(yǎng)（7296）48小時。（如試驗(yàn)管不出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣、消化碎肉、臭氣等現(xiàn)象，判供試品未檢出梭菌；否則，應(yīng)）取上述每一培養(yǎng)物，分別涂抹

29、接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，在置厭氧條件下培養(yǎng)4872小時。302010年版微生物限度檢查法修訂16、附錄111頁，增加：白色念珠菌 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2）直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448 小時。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時（必要時延長至72小時）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠

30、菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時（必要時延長至72小時）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。312010年版微生物限度檢查法修訂16、附錄111頁，增加：白色念珠菌若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗(yàn)。芽管試驗(yàn)挑取1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，置3537、13h，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。若上述疑似菌

31、為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。322、技術(shù)現(xiàn)狀與標(biāo)準(zhǔn)化1）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 MUG凝集、效價測定用培養(yǎng)基瓊脂含量過高。 固體培養(yǎng)基的靈敏度。 2010年版培養(yǎng)基適用性實(shí)驗(yàn) 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的專屬性33實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)用菌液制備需氧菌計(jì)數(shù)霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26 003大豆酪胨瓊脂或大豆酪胨肉湯，3035培養(yǎng)1824小時大豆酪胨瓊脂和大豆酪胨肉湯，100cfu3035，3天銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10104大豆酪胨瓊脂或大豆酪

32、胨肉湯，3035培養(yǎng)1824小時大豆酪胨瓊脂和大豆酪胨肉湯，100cfu3035，3天枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CMCC（B）63501大豆酪胨瓊脂或大豆酪胨肉湯，3035培養(yǎng)1824小時大豆酪胨瓊脂和大豆酪胨肉湯，100cfu3035，3天白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯，2025培養(yǎng)23天大豆酪胨瓊脂，100cfu3035，5天沙氏葡萄糖瓊脂100cfu，2025，5天黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98 003沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡萄糖瓊脂，2025培養(yǎng)57天，或直到獲

33、得良好的孢子大豆酪胨瓊脂，100cfu3035，5天沙氏葡萄糖瓊脂100cfu2025，5天培養(yǎng)基適用性實(shí)驗(yàn)（協(xié)調(diào)案）34檢查目標(biāo)菌推薦培養(yǎng)基特性測試菌株*耐膽鹽革蘭陰性菌腸道菌增菌肉湯促生長能力E.coli、P.aeruginosa抑制能力S.aureus紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂促生長能力+指示能力E.coli、P.aeruginosa大腸埃希菌麥康凱肉湯促生長能力E.coli抑制能力S.aureus麥康凱瓊脂促生長能力+指示能力E.coli沙門菌RVS肉湯促生長能力S paratyphi B抑制能力S.aureus木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂促生長能力+指示能力S paratyphi B指示能力E.

34、coli銅綠假單胞菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂促生長能力P.aeruginosa抑制能力E.coli金黃色葡萄球菌甘露醇鹽瓊脂促生長能力+指示能力S.aureus抑制能力E.coli梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基促生長能力Cl. sporogenes哥倫比亞瓊脂促生長能力Cl. sporogenes白色念珠菌沙氏葡萄糖肉湯促生長能力C.albicans沙氏葡萄糖瓊脂促生長能力+指示能力C.albicans35玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的專屬性以中檢所玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：050428 ）與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：050523 ）比較，加入50100cfu陽性菌在相同條件培養(yǎng)觀察，見下表9：大腸銅綠金葡枯草營養(yǎng)瓊脂培

35、養(yǎng)基35培養(yǎng)48hrs75819179玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基35培養(yǎng)48hrs574700玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基25培養(yǎng)72hrs454100表10、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果362、技術(shù)現(xiàn)狀與標(biāo)準(zhǔn)化2）、自動化程度低，仍然依賴大量的人工以方法驗(yàn)證為基礎(chǔ)，引入更為便捷的供試品前處理技術(shù)，規(guī)范供試品前處理有條件的地方可以考慮引入自動稀釋、自動接種、儀器判讀結(jié)果等設(shè)備和技術(shù)3）、75mm薄膜過濾器的研制征對我國中成藥品種多、情況復(fù)雜，開發(fā)研制的75mm薄膜過濾器在目前的驗(yàn)證工作中發(fā)揮了重要作用（圖1617）。373、微生物限度檢查的幾個問題原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題；藥材原粉的界定問題；含豆豉、神曲等發(fā)

36、酵成分的中成藥制劑標(biāo)準(zhǔn)問題；純化水微生物限度檢查問題；38原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題原料藥是藥品生產(chǎn)過程中引入微生物污染的重要來源之一，雖然一些藥品在生產(chǎn)過程或終產(chǎn)品階段可以采取一些滅菌措施殺滅污染微生物，但可能因?yàn)橛纱艘氲乃谰w、毒素等無法消除而危害患者，而原料藥過高的微生物荷載可能直接挑戰(zhàn)一些滅菌措施的有效性，造成滅菌失敗，使藥品存在更大的安全隱患。所以世界各國藥典均規(guī)定應(yīng)對原料藥進(jìn)行微生物檢查，以消除或控制其對藥品引入的微生物污染。39原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題在嚴(yán)格執(zhí)行藥品GMP的前提下，國外藥典更為重視原料藥的微生物檢查，尤其是對一些非滅菌制劑，甚至僅僅對原料藥有微生物限度控制要求，而對制

37、劑沒有強(qiáng)制要求。中國藥典2005版參考了國外藥典的這一發(fā)展趨勢，對于化學(xué)藥品的片劑、膠囊劑、顆粒劑等6個主要口服制劑在各論和制劑通則中均未做微生物限度檢查的強(qiáng)制要求，僅在附錄中做出通用性要求，但很多企業(yè)不清楚這一變化的背景和兩個必要前提，即嚴(yán)格的原料藥微生物控制和嚴(yán)格的GMP管理，從而放松了對這些產(chǎn)品的微生物控制，可能會存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。40原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題中國藥典規(guī)定，對藥品原輔料藥的微生物檢查參照相應(yīng)用途的藥品進(jìn)行，即用于非滅菌制劑生產(chǎn)的原料藥應(yīng)按相應(yīng)制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行微生物限度控制；而用于滅菌制劑的原料藥一般應(yīng)符合無菌要求?？紤]到生產(chǎn)過程中污染微生物可能發(fā)生的變化，國外企業(yè)通常在

38、生產(chǎn)上自覺執(zhí)行比制劑要求更為嚴(yán)格的原料藥微生物。41原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題（1）重視不夠 目前一些企業(yè)對原料藥微生物控制的重要性和意義認(rèn)識不夠，對源頭上的問題解決不好，加之GMP執(zhí)行流于形式，造成了頻繁的藥品微生物污染事故發(fā)生。（2）標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)不清楚 目前中國藥典絕大多數(shù)藥品原輔料各論項(xiàng)下沒有明確的微生物檢查標(biāo)準(zhǔn)，而是需要根據(jù)實(shí)際用途去確定相應(yīng)的控制標(biāo)準(zhǔn)。42原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題（3）抽樣不正確 原料藥微生物檢查的抽樣除了應(yīng)參照相應(yīng)的抽樣原則，還應(yīng)強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是抽樣的環(huán)境要求和無菌操作要求，不當(dāng)?shù)某闃臃椒ú粌H可以使得樣本對總體沒有代表意義、抽取的樣本被污染，甚至可因抽樣而污染原料。（4）方法不合

39、理 對于原料藥微生物檢查方法驗(yàn)證應(yīng)與藥品制劑微生物檢查方法驗(yàn)證同等重視，否則同樣存在檢驗(yàn)方法不合理、不科學(xué)，檢驗(yàn)結(jié)果沒有意義的問題。43藥材原粉的界定問題生藥原粉；動物臟器及臟器提取物。含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的中成藥制劑標(biāo)準(zhǔn)問題參見：淺析含豆豉、神曲等發(fā)酵成分制劑的微生物限度的沿革與現(xiàn)狀，馬仕洪、胡昌勤，中國藥事，2007，21（09）：70470644純化水問題USP31/Water for Pharmaceutical PurposeDrinking Water: Pour Plate Method or Membrane Filtraion Method Sample Volume-1.

40、0mL minimun Maximun action levels are 500 cfu per mLPurified Water: Pour Plate Method or Membrane Filtraion Method Sample Volume-1.0mL minimun Maximun action levels are 100 cfu per mL Water for Injection: Membrane Filtraion Method Sample Volume-100mL minimun Maximun action levels are 10 cfu per 100m

41、L 45純化水問題2005版二部P3032010版二部P412 純化水（Purified Water） 【檢查】微生物限度 取本品，采用薄膜過濾法處理后，依法檢查（附錄XI J），細(xì)菌、霉菌和酵母菌總數(shù)每1ml不得過100個。 這一標(biāo)準(zhǔn)源于國外，在其需氣菌培養(yǎng)基統(tǒng)一規(guī)定的情況下簡單易行。但我國引入后，造成企業(yè)大量的意見。在藥典現(xiàn)有條件下實(shí)際采用2ml實(shí)驗(yàn)，1ml測定細(xì)菌數(shù)、1ml測定霉菌和酵母菌數(shù)，再加合起來作為一個檢驗(yàn)結(jié)果。 主要問題還是培養(yǎng)基和檢驗(yàn)體系的差異。464、微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則2010年版中國藥典一部附錄XVIII F2010年版中國藥典二部附錄XIX P目的：為更好應(yīng)用

42、微生物限度檢查法。對標(biāo)準(zhǔn)和方法中的特定內(nèi)容及標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用做進(jìn)一步說明。（結(jié)合2010年版中國藥典微生物限度檢查法詳細(xì)解讀）。475、抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則2010年版中國藥典一部附錄XVIII D2010年版中國藥典二部附錄XIX N抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則目的 如果藥物本身不含有充分的抗菌力，在正常儲存和使用過程中可能發(fā)生細(xì)菌污染和大量繁殖；對患者引起污染或造成藥物變質(zhì)。在生產(chǎn)過程中添加適合的防腐劑以保證藥品的質(zhì)量。 所有防腐劑都具有一定的毒性，而且在貯存過程中其有效性有可能因藥物的活性成分提高或降低，為保證藥品的質(zhì)量和用藥安全，添加防腐劑的量應(yīng)根據(jù)制劑本身是否具抗菌活性，保持最低有效量。 防腐

43、劑效力的測定可為生產(chǎn)過程中添加防腐劑提供指導(dǎo)，隨著科學(xué)發(fā)展，新型防腐劑大量出現(xiàn)，防腐劑效力的測定更為重要；使生產(chǎn)者正確掌握產(chǎn)品中添加防腐劑的效力，有助于選擇合適的防腐劑，也可對防腐劑使用的正確性給予評價。抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則國內(nèi)外現(xiàn)狀 目前歐洲、美國、英國等國藥典均已在附錄中收載了防腐劑效力測定，雖然方法不同，但均采用了生物測定方法。我國藥典防腐劑效力測定目前還是空白，有必要經(jīng)過研究，制訂出科學(xué)、簡便、易行的測試方法收載于藥典附錄中。防腐劑效力的測定，不但為生產(chǎn)者提供正確的使用防腐劑的指導(dǎo)，而且可對使用防腐劑的正確性給予評價。50抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則基本規(guī)定抑菌劑效力檢查法系用于測定滅菌、

44、非滅菌制劑中抑菌劑的活性，以評價最終產(chǎn)品的抑菌效力，同時也可用于指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑的確定。如果藥物本身不具有充分的抗菌活性，那么應(yīng)根據(jù)制劑特性（如水溶液制劑）添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏和使用過程中可能發(fā)生的微生物污染和繁殖使藥物發(fā)生變質(zhì)而對使用者造成危害，尤其是多劑量包裝的制劑。在藥品生產(chǎn)過程中，抑菌劑不能用于替代藥品生產(chǎn)的GMP管理，不能作為非滅菌制劑降低微生物污染的唯一途徑，也不能作為控制多劑量包裝制劑滅菌前的生物負(fù)載的手段。51抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則基本規(guī)定所有抑菌劑都具有一定的毒性，制劑中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效量。同時，為保證用藥安全，最終包裝容器中的抑菌劑

45、有效濃度應(yīng)低于對人體有害的濃度。在制劑通則中要求具有抗菌活性的制劑，不管是添加的抑菌劑，還是藥物本身具有抗菌活性，在藥物研發(fā)階段，均應(yīng)確認(rèn)其抗菌效力。抑菌劑的抗菌效力在貯存過程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影響而提高或降低，因此，應(yīng)驗(yàn)證最終容器中的抑菌劑效力在效期內(nèi)不因貯藏條件而降低。本試驗(yàn)方法和抑菌劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)用于包裝未啟開的成品制劑。52抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案；驗(yàn)證計(jì)數(shù)測定方法；制備濃菌液（108cfu/ml）；原包裝接種；立即計(jì)數(shù)與第7、14、28天計(jì)數(shù)；計(jì)數(shù)結(jié)果的常用對數(shù)值比較；結(jié)果判斷。536、藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則2010年版中國藥典一部

46、附錄XVIII E2010年版中國藥典二部附錄XIX O54藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則本指導(dǎo)原則是為所采用的試驗(yàn)方法能否替代藥典規(guī)定方法用于藥品微生物的檢驗(yàn)提供指導(dǎo)。微生物檢驗(yàn)的新技術(shù)基于微生物生長信息的檢驗(yàn)技術(shù)，如生物發(fā)光技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)、比濁法等； 直接測定的被測介質(zhì)中活微生物的檢驗(yàn)技術(shù)，如固相細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法等； 基于微生物細(xì)胞所含有特定組成成分的分析技術(shù)，如脂肪酸測定技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、基因指紋分析技術(shù)等。 55藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則在生物技術(shù)和制藥行業(yè)中，對微生物質(zhì)量進(jìn)行控制主要有兩方面的工作：過程監(jiān)控和成品放行。傳統(tǒng)方法的弱點(diǎn)是檢驗(yàn)速度慢。利用傳統(tǒng)方法

47、所得到的微生物質(zhì)量控制信息，只能作為產(chǎn)品放行評價的一部分內(nèi)容，而不能用于及時指導(dǎo)生產(chǎn)過程中的各工藝環(huán)節(jié)。替代方法的優(yōu)點(diǎn)是檢驗(yàn)速度快，能夠?qū)ιa(chǎn)過程的關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié)作出及時的微生物質(zhì)量評價。在醫(yī)藥行業(yè)完全有必要也有可能使用微生物檢驗(yàn)的替代方法56參數(shù)定性檢驗(yàn)定量檢驗(yàn)準(zhǔn)確度精密度專屬性檢測限定量限線性范圍重現(xiàn)性耐用性驗(yàn)證參數(shù)表注：表示需要開展 表示不需要開展藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則57驗(yàn)證參數(shù)與國外藥典比較，這部分內(nèi)容有所不同。在定性檢驗(yàn)的驗(yàn)證中，借鑒了美國藥典的規(guī)定，需要開展的驗(yàn)證參數(shù)為專屬性、檢測限、重現(xiàn)性和耐用性，放棄了歐洲藥典對準(zhǔn)確度和精密度的規(guī)定。 在定量檢驗(yàn)的的驗(yàn)證中，借鑒了歐

48、洲藥典的規(guī)定，除檢測限外，其他參數(shù)均需要驗(yàn)證。 58定性檢驗(yàn)的方法驗(yàn)證1、專屬性專屬性是指檢測樣品中可能存在的微生物種類的能力強(qiáng)調(diào)應(yīng)關(guān)注樣品存在對檢驗(yàn)結(jié)果的影響研究表明，在使用依賴培養(yǎng)技術(shù)的替代方法時，樣品的存在會導(dǎo)致檢驗(yàn)出現(xiàn)假陰性 對于不依賴培養(yǎng)技術(shù)的替代方法，樣品的存在還可能導(dǎo)致檢驗(yàn)出現(xiàn)假陽性 對驗(yàn)證數(shù)據(jù)可采用2檢驗(yàn) 59定性檢驗(yàn)的方法驗(yàn)證2、檢測限檢測限是指在替代方法設(shè)定的檢驗(yàn)條件下，樣品中能被檢出的微生物的最低數(shù)量 ，該數(shù)量是指在稀釋或培養(yǎng)之前初始樣品所含有的微生物數(shù)量，而不是指檢驗(yàn)過程中某一環(huán)節(jié)的供試液中所含有的微生物數(shù)量 驗(yàn)證的關(guān)鍵是確定接種菌的最低數(shù)量，與國外藥典規(guī)定相同，要求該數(shù)量應(yīng)能夠在采用藥典方法檢驗(yàn)時，有50的檢出率對驗(yàn)證數(shù)據(jù)可采用2檢驗(yàn) 60定性檢驗(yàn)的方法驗(yàn)證3、重現(xiàn)性重現(xiàn)性是指相同的樣品在正常的實(shí)驗(yàn)條件（如實(shí)驗(yàn)場所、實(shí)驗(yàn)人員、儀器、試劑的批次等）發(fā)生變化時，所得檢驗(yàn)結(jié)果的精密度 ，反映了微生物檢驗(yàn)方法在檢驗(yàn)結(jié)果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力 驗(yàn)證的關(guān)鍵是使接種菌的量在檢測限以上評價驗(yàn)證結(jié)果時，應(yīng)排除樣品均一性的影響對驗(yàn)證數(shù)據(jù)可采用2檢驗(yàn)61定性檢驗(yàn)的方法驗(yàn)證4、耐用性耐用性是指當(dāng)方法參數(shù)有小的刻意變化時，檢驗(yàn)結(jié)果不受影響的能力，為方法正常使用時的可靠性提供依據(jù) 對替代方法進(jìn)行耐用性評價，確定方法操作的關(guān)鍵