電鏡生物醫(yī)學(xué)樣品制作方法和電鏡觀察應(yīng)用

1、電鏡生物醫(yī)學(xué)樣品制作方法 和電鏡觀察應(yīng)用 透射電鏡的用途 肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 掃描電鏡的用途 精子和卵子 支氣管粘膜上皮 植物孢子粉 電鏡樣品制作（生物） 透射電鏡樣品的制備(TEM) 超薄切片技術(shù)（常規(guī)、細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、放射自顯影等） 冷凍蝕刻技術(shù)（復(fù)型） 負(fù)染色技術(shù) 其它掃描電鏡樣品的制備(SEM) 生物材料制作（表面、內(nèi)部） 非生物材料制作 血管鑄型超薄切片技術(shù) 常規(guī)超薄切片技術(shù) 電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 在一定的條件下使細(xì)胞內(nèi)的酶作用于酶的底物，再將酶反應(yīng)的產(chǎn)物作為 反應(yīng)物質(zhì)，在酶的作用部位進(jìn)行捕捉，使其在電鏡下具有可見性。 電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理， 用高電

2、子密度的標(biāo)記物標(biāo)記抗體后， 和相應(yīng)的抗原結(jié)合，用電鏡觀察的一種技術(shù)。電鏡放射自顯影技術(shù) 使用感光材料與含有放射性核素樣品接觸，從而檢測(cè)出放射性核素標(biāo) 記的探針、核苷酸等存在于靶基因、蛋白及細(xì)胞內(nèi)的一種示蹤定位技術(shù)。 示蹤細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 利用高電子密度示蹤劑在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散，通過電鏡下觀察的一種技術(shù)。超薄切片制作技術(shù) 超薄切片為TEM提供的厚度為 10-100nm的切片石蠟切片（LM）超薄切片（EM）超薄切片技術(shù) 超薄切片制作程序 取材前固定浸洗后固定浸洗脫水浸透包埋聚合切片染色超薄切片制作程序 取材1、快 1min2、小 1mm33、低溫 0-44、部位準(zhǔn)確5、避免人工損傷超薄切片制作程序 固定1

3、、防止自溶2、防止細(xì)胞成分丟失或增加3、易于切片4、增加反差超薄切片制作程序 超薄切片制作程序 超薄切片制作程序 理想的固定劑1、穿透力強(qiáng)2、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分3、使細(xì)胞內(nèi)成分變不溶4、增強(qiáng)圖像反差5、酶及大分子活性得到保存超薄切片制作程序 固定劑種類四氧化鋨戊二醛多聚甲醛高錳酸鉀其它超薄切片制作程序 常用固定劑的固定方式戊二醛+多聚甲醛前固定 四氧化鋨后固定戊二醛前固定 四氧化鋨后固定 PH 滲透壓 濃度 溫度 時(shí)間 大小超薄切片制作程序 緩沖液 相應(yīng)的PH 適當(dāng)?shù)臐B透壓 適宜的離子濃度 磷酸緩沖液 二甲砷酸鹽緩沖液 固 定 液緩沖液超薄切片制作程序 浸洗 緩沖液 脫水 乙醇 丙酮

4、超薄切片制作程序 浸透 包埋 環(huán)氧樹脂 樣品包埋于包埋劑中，支持柔軟的組織，便于超薄切片聚合 包埋劑在溫度的作用下 由液體變?yōu)楣腆w 超薄切片制作程序 切片半超薄切片1-2（LM）超薄切片50-70nm 載網(wǎng)：銅網(wǎng) 切片刀：玻璃刀超薄切片制作程序 超薄切片制作程序 玻璃刀 鉆石刀超薄切片制作程序 超薄切片制作程序 染色: 醋酸鈾，檸檬酸鉛超薄切片制作程序 取材 快 小 低溫 部位準(zhǔn)確 避免損傷前固定 2-4%GA 2小時(shí)以上浸洗 緩沖液洗后固定 1% OsO4 1-2小時(shí)浸洗 緩沖液洗脫水 乙醇 丙酮浸透 包埋劑 （EPON812+DDSA+MNA+DMP-30）包埋 包埋劑 聚合 37-45-

5、60 /60 48小時(shí)切片 半超薄切片超薄切片染色 醋酸鈾、檸檬酸鉛 10-20分鐘超薄切片制作程序 常規(guī)超薄切片電鏡觀察 常規(guī)超薄切片電鏡觀察 電鏡酶細(xì)胞化學(xué) 細(xì)胞器的標(biāo)志性酶溶酶體-酸性磷酸酶線粒體-琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-葡萄糖-6-鱗酸酶高爾基體-硫氨素焦磷酸酶等微體-過氧化氫酶細(xì)胞膜-ATP酶、堿性磷酸酶等.電鏡酶細(xì)胞化學(xué) 固定劑：1%戊二醛+4%多聚甲醛（二甲胂酸鈉緩沖液）孵育液（ATP酶）：50mM Tris緩沖液ATP（鈉鹽）2mMMgSO4 5mM硝酸鉛對(duì)照反應(yīng)液：-ATP電鏡超薄切片程序電鏡免疫細(xì)胞化學(xué) 細(xì)胞表面抗原膠體金標(biāo)記 電鏡免疫細(xì)胞化學(xué) 真菌表面抗原膠體

6、金雙標(biāo)記（5nm和16nm）電鏡放射自顯影 放射性同位素標(biāo)記固定、脫水、包埋、超薄切片、覆蓋核乳膠膜、曝光、顯影、定影、染色、觀察示蹤細(xì)胞化學(xué) 硝酸鑭示蹤小腸粘膜表面冷凍蝕刻技術(shù)（復(fù)型） 負(fù)染色技術(shù) 利用染色劑高密度的背景，“包埋”低密度的樣品。 染色劑：醋酸鈾、磷鎢酸用途：生物大分子、病毒、細(xì)菌、 分離的細(xì)胞器、 蛋白質(zhì)晶體等顆粒性物質(zhì)負(fù)染色技術(shù) 輪狀病毒 西漢古尸膠原纖維液體材料的制作 碳支持膜銅網(wǎng)將液體滴在覆有支持膜和碳膜的銅網(wǎng)上靜置數(shù)分鐘，待其干燥后即可電鏡下觀察。粉末材料的制作 將粉末直接涂在覆有支持膜和碳膜的銅網(wǎng)上。如果樣品分散不好，可用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂專儆贸暡?分散后按液體材料

7、的方法制作。觀察納米顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的材料， 可將樣品包埋在環(huán)氧樹脂中， 經(jīng)超薄切片后電鏡下觀察。掃描電鏡技術(shù)（生物材料） 冷凍斷裂 取材 固定（前、后） 浸洗 脫水 置換 清潔表面 （真空、空氣、冷凍、臨界點(diǎn)） 干燥 SEM 噴金 掃描電鏡技術(shù)（生物材料）取材： 1、表面清潔 2、迅速固定 3、注意大小干燥： （1）空氣干燥 （2）真空干燥 （3）冷凍干燥 （4）臨界點(diǎn)干燥噴金：鉑金 取材 冷凍斷裂 清潔表面 固定 浸洗 脫水 置換 浸透（超薄切片制作） 干燥（真空、空氣、冷凍、臨界點(diǎn)） 包埋 聚合 噴金 染色 切片 SEM TEM 透射及掃描電鏡樣品制作程序透射及掃描電鏡觀察（生物材料） 紅細(xì)胞 支氣管粘