DB35_T 1992-2021番鴨細(xì)小病毒和鵝細(xì)小病毒雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別診斷技術(shù)

1、ICS 65.02035CCS B 40福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T 19922021番鴨細(xì)小病毒和鵝細(xì)小病毒雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別診斷技術(shù)Diagnostic technique of duplex real-time fluorescent PCR for the detection ofmuscovy duck parvovirus and goose parvovirus2021 - 08 - 17 發(fā)布2021 - 11 - 17 實(shí)施福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布DB35/T 19922021DB35/T 19922021III目次前言II范圍1規(guī)范性引用文件1術(shù)語(yǔ)和定義1原理1

2、試劑與材料2儀器設(shè)備及耗材2操作方法2結(jié)果判定3附錄 A（規(guī)范性） 0.01 mol/L（pH 7.2）磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制5附錄 B（規(guī)范性） MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別檢測(cè)方法所用引物6附錄 C（規(guī)范性） MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別檢測(cè)反應(yīng)體系組分7附錄 D（資料性） MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線8附錄 E（資料性） MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別檢測(cè)融解曲線9前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本

3、文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本文件由福建省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本文件主要起草人：林甦、王劭、陳少鶯、陳秀琴、黃梅清、程曉霞、肖世峰、陳仕龍、林鋒強(qiáng)。DB35/T 19922021DB35/T 19922021 PAGE 9 PAGE 8番鴨細(xì)小病毒和鵝細(xì)小病毒雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別診斷技術(shù)范圍本文件規(guī)定了鑒別檢測(cè)番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）和鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）雙重實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pol

4、ymerase chain reaction，PCR）方法的原理、試劑與材料、儀器設(shè)備及耗材、操作方法、結(jié)果判定。本文件適用于番鴨細(xì)小病毒、鵝細(xì)小病毒的核酸檢測(cè)和鑒別。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB 19489 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求NY/T 541 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。Ct 值 cycle threshold每個(gè)反應(yīng)管

5、內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。融解（解鏈）溫度 melting temperature；Tm 值核酸加熱變性過(guò)程中，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為核酸的解鏈溫度，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似，又稱融解溫度。注： 基于產(chǎn)物長(zhǎng)度和G/C含量的不同，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)在不同的溫度點(diǎn)解鏈。原理MDPV與GPV全基因序列在核苷酸水平上同源性約為81.9%?；趦煞N水禽細(xì)小病毒基因核苷酸序列上的差異，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性PCR引物，分別擴(kuò)增兩種病毒VP基因序列上的一段300 bp左右特異性片段， 并在PCR 反應(yīng)體系中加入過(guò)量雙鏈嵌合熒光染料，熒光染料非特異性地?fù)饺朊撗鹾颂呛怂幔―eoxyr

6、ibonucleic acid，DNA）雙鏈后發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的熒光染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步，呈現(xiàn)正向?qū)?yīng)關(guān)系。當(dāng)PCR反應(yīng)結(jié)束后， 通過(guò)重新加熱擴(kuò)增產(chǎn)物（反應(yīng)溫度逐漸升高），使結(jié)合了熒光染料分子的雙鏈DNA解離或“融解”成單鏈DNA，熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著變化，形成一幅融解曲線圖。由于上述兩個(gè)特異性片段的Tm值不同，造成不同的PCR產(chǎn)物融解曲線特性不一樣（出現(xiàn)峰值所對(duì)應(yīng)的溫度不同），通過(guò)分析擴(kuò)增后融解曲線，可以簡(jiǎn)單、直接地判斷實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物的目的基因片段，以此來(lái)鑒別MDPV和GPV。試劑與材料 除另有規(guī)定外，所用生化試劑均

7、為分析純。 PBS（磷酸鹽緩沖溶液）：0.01 mol/L（pH 7.2）PBS 的配制方法按照附錄 A 要求，4 保存。試驗(yàn)用水應(yīng)符合 GB/T 6682 的規(guī)定。 核糖核酸酶（20 mg/mL）。 10%SDS（十二烷基硫酸鈉溶液）。蛋白酶 K（10 mg/mL）。 Tris-鹽酸飽和酚（pH 7.6）。 酚-氯仿-異戊醇混合液（25：24：1）：在一滅菌棕色瓶中按 25：24：1 比例分別加入酚、氯仿、異戊醇。 乙酸鈉：3 mol/L，pH5.4。 熒光定量 PCR 試劑盒：市售商品化雙鏈嵌合熒光染料（如 SYBR Green）熒光定量 PCR 試劑盒或其他等效產(chǎn)品，于20 保存。 無(wú)

8、DNA 酶/RNA 酶（DNase/RNase-Free）去離子水：4 保存。 陽(yáng)性對(duì)照：經(jīng)滅活的 MDPV 或GPV 陽(yáng)性尿囊液。 陰性對(duì)照：MDPV 和GPV 陰性尿囊液。 MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)用上、下游引物序列：按照附錄 B 的要求。 MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)反應(yīng)體系組分：按照附錄 C 的要求。儀器設(shè)備及耗材 熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。 高速冷凍離心機(jī)：可控溫至 4 ，最大離心速度可達(dá) 12 000 r/min 以上。 生物安全柜。 微量移液器。 組織勻漿器。操作方法 樣品采集與核酸的提取樣品采集與處理在實(shí)驗(yàn)室操作過(guò)程中首先應(yīng)嚴(yán)

9、格遵守GB 19489和NY/T 541的要求。在采樣區(qū)無(wú)菌采集發(fā)病或病死雛番鴨肝、脾、胰腺等組織，剪碎研磨，按體積比1:4加入PBS制成組織勻漿，反復(fù)凍融3次，經(jīng)2 000 r/min離心20 min，取上清液分裝，于20凍存待檢。對(duì)于活禽樣品，采取病鴨或鵝口咽拭子、泄殖腔拭子等，將樣品放入盛有1.0 mL PBS的1.5 mL滅菌離心管中，振蕩器上充分振蕩30 s，然后將樣品懸液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL滅菌離心管中，于20凍存待檢。采樣過(guò)程中樣本不應(yīng)交叉污染，采樣和樣品處理過(guò)程中應(yīng)穿戴一次性手套和口罩。樣品 DNA 提取按下列步驟完成DNA的提取，也可選擇市售商品化DNA提取試劑盒或全自動(dòng)核酸

10、抽提儀及配套核酸提取試劑，按其說(shuō)明書完成DNA的提?。喝?1.5 mL 滅菌離心管，加入 7.1.1 處理樣品上清液或棉拭子懸液 400 L和 30 L（20 mg/mL）核糖核酸酶，混勻后，室溫下作用 20 min；加入 43 L 10%的SDS 溶液和 5 L 蛋白酶 K，42 水浴溫育過(guò)夜（或 55 30 min 以上）；加入等量的 Tris-鹽酸飽和酚，充分混勻，12 000 r/min 離心 5 min，小心吸出上層水相于新的 1.5 mL 滅菌離心管中；加等量的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），充分混勻，12 000 r/min 離心 5 min，小心吸出上層水相至新的 1.5

11、mL 滅菌離心管中；加 1/10 體積 3 mol/L 的乙酸鈉（pH5.4），2.5 倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，12 000 r/min 離心20 min，棄去乙醇，75%的乙醇洗滌沉淀一次后真空干燥。用 20 L DNase/RNase-Free 去離子水溶解沉淀，20保存?zhèn)溆谩?熒光定量 PCR 檢測(cè)加樣在檢測(cè)區(qū)使用熒光定量PCR試劑盒配制MDPV和GPV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)反應(yīng)體系n管（n為待檢樣品數(shù)量+陽(yáng)性管數(shù)+陰性管數(shù)，反應(yīng)體系按照附錄C要求），向每管中分別加入7.1.2中待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照的DNA提取物各1 L，蓋緊管蓋后充分混勻、除氣泡、離心，然后放入熒光定量PCR

12、檢測(cè)儀內(nèi)并記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置第一階段，預(yù)變性95 /5 min。第二階段，擴(kuò)增95 /15 s，60 /10 s，72 /15 s，30個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的延伸階段進(jìn)行熒光信號(hào)采集。第三階段，融解60 95 ，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，添加融解步驟，生成融解曲線。結(jié)果判定 閾值設(shè)定試驗(yàn)結(jié)束后讀取檢測(cè)結(jié)果，Ct值的閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照的Ct值25.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線（參見附錄D），融解曲線于85.4 0.23 （MDPV）和87.3 0.26 （GPV）出現(xiàn)明顯的特異性峰值（參見附錄E）

13、。陰性對(duì)照無(wú)Ct值，且無(wú)典型擴(kuò)增曲線；或陰性對(duì)照Ct值29.0，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但融解曲線于85.4 0.23 （MDPV）和87.3 0.26 （GPV）未出現(xiàn)明顯的特異性峰值。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照同時(shí)成立可判斷試驗(yàn)有效，否則試驗(yàn)無(wú)效。 結(jié)果描述及判定陽(yáng)性檢測(cè)樣品Ct值27.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，如融解曲線于85.4 0.23 出現(xiàn)明顯的特異性峰值，則判定為MDPV陽(yáng)性；如融解曲線于87.3 0.26 出現(xiàn)明顯的特異性峰值，則判定為GPV陽(yáng)性； 如融解曲線于85.4 0.23 和87.3 0.26 出現(xiàn)特異性雙峰，則判定為MDPV和GPV雙陽(yáng)性。陰性檢測(cè)樣品Ct值29.0或無(wú)，無(wú)典型擴(kuò)增曲線，

14、并且融解曲線未出現(xiàn)明顯的特異性峰，則判定為陰性?？梢扇魴z測(cè)樣品27.0Ct值29.0，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，則判定為可疑，應(yīng)重新檢測(cè)。重新檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性或可疑的判定為陽(yáng)性，結(jié)果為陰性的判定為陰性。AA附 錄 A（規(guī)范性）0.01 mol/L（pH 7.2）磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制A 液（0.2 mol/L 磷酸二氫鈉水溶液）磷酸二氫鈉水溶液（NaH2PO4H2O）27.6 g，用適量蒸餾水融解，定容至1 000 mL。B 液（0.2 mol/L 磷酸氫二鈉水溶液）磷酸氫二鈉水溶液（Na2HPO412H2O）71.6 g，用適量蒸餾水融解，定容至1 000 mL。0.01 mol/L PBS 的配制

15、A液14 mL，B液36 mL，加氯化鈉（NaCl）8.5 g，用蒸餾水定容至1 000 mL；121 高壓滅菌15 min，4 保存?zhèn)溆谩B附 錄 B（規(guī)范性）MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別檢測(cè)方法所用引物MDPV和GPV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)方法所用引物見表B.1。表B.1 MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別檢測(cè)方法所用引物引物名稱引物濃度引物序列MDPV上游引物M3-P110 mol/L5- TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC -3MDPV下游引物M3-P210 mol/L5- TGTTACCATGATGTCTGAAAT

16、-3GPV上游引物G5-P110 mol/L5- GAGGTAGACAGCAACAGAAA -3GPV下游引物G5-P210 mol/L5- GCTCGTCCGTGACCATA -3CC附 錄 C（規(guī)范性）MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別檢測(cè)反應(yīng)體系組分MDPV和GPV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)反應(yīng)體系組分見表C.1。表C.1 MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別檢測(cè)反應(yīng)體系組分體系組分用量SYBR Green熒光定量PCR酶混合物（2）a10 L上游引物M3-P10.5 L下游引物M3-P20.5 L上游引物G5-P10.5 L下游引物G5-P20.5 LDNase/RNase-Free去離子水7 L總量19 La SYBR Green熒光定量PCR試劑盒內(nèi)提供，內(nèi)含DNA聚合酶，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）混合物，鎂離子（Mg2+），SYBR Green熒光染料等。DD附 錄 D（資料性）MDPV 和 GPV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 鑒別檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線MDPV和GPV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線見圖D.1。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：