7.新型興奮劑匯總課件

1、新型興奮劑-基因興奮劑董貴俊山東體育學(xué)院20世紀(jì)人類(lèi)科技發(fā)展史上的三大創(chuàng)舉 90年代人類(lèi)基因組計(jì)劃40年代第一顆原子彈爆炸60年代人類(lèi)首次登上月球人類(lèi)基因組計(jì)劃的啟動(dòng) 1986 年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者R.Dulbecco（杜爾貝科）提出人類(lèi)基因組計(jì)劃測(cè)出人類(lèi)全套基因組的 DNA 堿基序列（ 3 X 109 bp ）1975年，獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 美國(guó)政府決定于 1990年正式啟動(dòng)HGP，預(yù)計(jì)用 15 年時(shí)間，投入 30 億美元，完成 HGP。 由國(guó)立衛(wèi)生研究院和能源部共同組成“人類(lèi)基因組研究所” 逐漸地，HGP 擴(kuò)展為多國(guó)協(xié)作計(jì)劃。參與者包括：英、日、法、德和中國(guó)（1993年）二000年六月二十六日

2、克林頓宣布人類(lèi)基因組草圖繪制完成2001 年2月16日 人類(lèi)基因組“精細(xì)圖”完成，(99%),DAN測(cè)序膠圖 裸鼠背上“長(zhǎng)”人耳朵 這種背上“背”著人耳的小鼠在1997年問(wèn)世，主要由在哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院從事博士后研究的曹誼林于Vacanti實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成的。 “轉(zhuǎn)基因豬”可移植器官給人 轉(zhuǎn)基因豬:就是用一系列的基因改造手段，把豬身上會(huì)引起排斥反應(yīng)最關(guān)鍵的基因敲掉，再加入一些人的基因，經(jīng)過(guò)這樣“基因改造”的豬，就會(huì)變成一個(gè)適用于人體的、不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥的“萬(wàn)能供體”。 對(duì)豬而言，引起排斥反應(yīng)的主要原因是豬血管內(nèi)皮細(xì)胞上含有一種人類(lèi)沒(méi)有的糖分子，當(dāng)豬器官植入人體后，人體的免疫系統(tǒng)會(huì)將這種糖分子認(rèn)作外來(lái)物

3、而發(fā)起攻擊，幾分鐘內(nèi)即可將移植器官摧毀。要解決這一問(wèn)題，就要“敲掉”豬細(xì)胞中負(fù)責(zé)產(chǎn)生這種糖分子的基因，然后再用這種經(jīng)過(guò)修改的細(xì)胞進(jìn)行克隆，這樣培育出的豬器官移入人體后，就可避免超急免疫反應(yīng)。這種“轉(zhuǎn)基因敲除豬”有三只，現(xiàn)在還在廣州，正在做角膜移植試驗(yàn)。 隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展, 通過(guò)多種載體有針對(duì)性地將DNA、RNA 等遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到人類(lèi)自體的細(xì)胞或組織中, 以到達(dá)治療疾病的目的, 這種基因治療手段已經(jīng)在動(dòng)物試驗(yàn)中取得很多成功的實(shí)例, 在人體上也有成功的報(bào)道?；蛑委熅哂嗅槍?duì)性強(qiáng)、副作用低、療效持久等優(yōu)點(diǎn)。正是由于這些優(yōu)點(diǎn), 雖然基因治療技術(shù)還處在實(shí)驗(yàn)階段, 需要不斷的改進(jìn)還是引起了競(jìng)技體育界

4、的關(guān)注, 不少運(yùn)動(dòng)員期望通過(guò)基因技術(shù)提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)。 早在2003 年, 世界反興奮劑組織( WADA) 就首次公布了禁止使用基因興奮劑的條例。WADA 定義基因興奮劑為: 非治療目的使用提高運(yùn)動(dòng)能力的基因、遺傳構(gòu)件和( 或)細(xì)胞。使用基因興奮劑( gene doping ) 就是指利用可提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)的DNA , 對(duì)運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行基因改造, 以獲取競(jìng)技優(yōu)勢(shì)。2009 年, 世界反興奮劑組織再次明確指出基因興奮劑包括轉(zhuǎn)移細(xì)胞、遺傳元件或使用細(xì)胞、遺傳元件、藥理學(xué)制劑等手段, 以調(diào)控可以提高運(yùn)動(dòng)能力的內(nèi)源性基因的表達(dá)?；蚺d奮劑的種類(lèi) 現(xiàn)在已知的與身體機(jī)能和運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的基因多達(dá)100多種 。這使得運(yùn)動(dòng)

5、員可以根據(jù)自身身體條件和運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的特點(diǎn)來(lái)選擇性的進(jìn)行基因治療以期達(dá)到提高運(yùn)動(dòng)能力的目的。這種基因表達(dá)后的蛋白質(zhì)與人體天然形成的蛋白質(zhì)基本相同, 很難被檢測(cè)出來(lái), 具有很高的隱蔽性。目前比較受關(guān)注的基因興奮劑有以下幾種：（一）促紅細(xì)胞生成素( EPO) 促紅細(xì)胞生成素是由人體腎臟細(xì)胞合成的一種糖蛋白。其作用主要是促進(jìn)晚期紅系祖細(xì)胞增殖并向形態(tài)可識(shí)別的前體細(xì)胞分化, 加速前體細(xì)胞的增殖分化, 促進(jìn)骨髓釋放網(wǎng)織紅細(xì)胞。因此使用EPO 可以起到增加紅細(xì)胞數(shù)量, 提高血氧含量的作用。EPO 作為興奮劑使用已經(jīng)有比較長(zhǎng)的歷史。早在上世紀(jì)九十年代重組人促紅細(xì)胞生成素( rhEPO)就已經(jīng)作為興奮劑被用于有氧

6、耐力型項(xiàng)目。但是2000年后這種外源性的EPO 已經(jīng)能被檢測(cè)出來(lái)。這使得更多的運(yùn)動(dòng)員會(huì)傾向于使用EPO 基因興奮劑。1997, Svensso n等人已經(jīng)成功地將EPO 基因注入老鼠與猴子體內(nèi)。大鼠的血球容積猛增了81%, 并且表達(dá)水平能保持一年。猴子的紅細(xì)胞數(shù)目由40 %增加到70 % , 表達(dá)水平保持12 周。由于這種基因表達(dá)后產(chǎn)生的EPO 和人體自身產(chǎn)生的EPO 結(jié)構(gòu)一致, 具有較高的隱蔽性, 這又增加了檢測(cè)的難度, 為濫用EPO 提供可能。（二）血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( VEGF) 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的主要作用是促進(jìn)血管新生。VEGF在醫(yī)學(xué)上可以用來(lái)治療缺血性心臟病等疾病。運(yùn)用在運(yùn)動(dòng)上可以提高

7、血管的生成速度, 增加組織氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給, 促進(jìn)代謝產(chǎn)物排出, 延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間。（三）過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體( PPAR) PPAR的表達(dá)使I 型肌纖維數(shù)量增加, 促進(jìn)II 型肌纖維向I 型肌纖維轉(zhuǎn)換。從而增加運(yùn)動(dòng)員肌肉的抗疲勞能力,提高有氧運(yùn)動(dòng)成績(jī)。Wang 等人將PPAR基因植入小鼠受精卵后發(fā)現(xiàn)I 型肌纖維比例大幅增加。這種基因改造后的小鼠比正常小鼠的跑步時(shí)間提高67%, 跑步距離增加92%。并且這類(lèi)小鼠的脂肪代謝能力也較正常小鼠強(qiáng)。（四）胰島素樣生長(zhǎng)因子- I( IGF- I) 胰島素樣生長(zhǎng)因子- I 產(chǎn)生于肝臟和肌肉組織, 能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。采用病毒載體將IGF- I 基因遞

8、送進(jìn)肌肉能夠消除老化相關(guān)的肌肉萎縮, 并有利于促進(jìn)肌肉體積增大。Sw eeney 等實(shí)驗(yàn)證明, 用腺相關(guān)病毒( AAV) 作為載體,對(duì)其進(jìn)行篩選, 使其含有IGF- I 基因, 然后用AAV- IGF- I 轉(zhuǎn)染正常大鼠骨骼肌細(xì)胞, 并在其中表達(dá), 大鼠肌肉整體數(shù)量和增長(zhǎng)率增加15 % 30%。研究人員又發(fā)現(xiàn)合成物只會(huì)提高肌肉中的IGF- I 含量, 并不影響血液。這樣就降低了引起心臟病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)還表明, 過(guò)量的IGF- I可以加快肌肉的自我修復(fù), 即使對(duì)于那些患有嚴(yán)重肌肉萎縮癥的老鼠也不例外。這一技術(shù)如應(yīng)用在運(yùn)動(dòng)員身上, 不僅可以實(shí)現(xiàn)有目的的增強(qiáng)某一特定肌群, 還可以增加整體

9、肌肉體積或是促進(jìn)肌肉修復(fù)。（五）肌肉生長(zhǎng)抑制素( Myo stat in) 肌肉生長(zhǎng)抑制素其主要功能是特異性的抑制骨骼肌細(xì)胞增殖與分化, 是骨骼肌生長(zhǎng)、發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。將小鼠的Myo statin 基因剔除后會(huì)使骨骼肌的重量和肌肉的力量都得到增強(qiáng)。給小鼠注射Myo statin 抗體, 通過(guò)抑制My ostatin的活性也可以達(dá)到類(lèi)似效果。不僅如此, 它還能提高胰島素的敏感性, 降低脂肪比例。（六）生長(zhǎng)激素( GH ) 生長(zhǎng)激素由垂體前葉分泌, 其主要功能是促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育。它能動(dòng)員體內(nèi)各方面的能量和原料供應(yīng), 促進(jìn)蛋白質(zhì)合成, 增加身體細(xì)胞的大小和數(shù)量, 促進(jìn)身高發(fā)育, 肌肉生長(zhǎng)。在醫(yī)學(xué)上

10、主要用于內(nèi)源性生長(zhǎng)激素分泌不足的侏儒兒童的身高增長(zhǎng)。運(yùn)動(dòng)員濫用GH 的主要目的是增加肌肉量以獲得競(jìng)技優(yōu)勢(shì)。Voutetakis 等人曾以2 型腺病毒( AAV2) 作載體, 將GH 基因植入老鼠唾液腺中, 獲得了在4周內(nèi)持續(xù)表達(dá)的GH 。（七）機(jī)械生長(zhǎng)因子( MGF) 機(jī)械生長(zhǎng)因子(MGF) 起源于胰島素生長(zhǎng)因子- I( IGF- I) ,是IGF- I 基因經(jīng)過(guò)不同剪切而衍生的. MGF 的表達(dá)主要受機(jī)械刺激和組織損傷的影響, 且比肝型IGF- I 具有潛在的增加肌肉質(zhì)量的能力。MGF 產(chǎn)生于血液組織但不參與血液循環(huán), 在運(yùn)動(dòng)后可以自然分泌, 刺激肌肉生長(zhǎng)。在WADA 組織的資助下, Geo

11、ffr ey Go ldspr ink等研究發(fā)現(xiàn), 大鼠在轉(zhuǎn)移了MGF 基因3 周后肌肉量增加了30%。這一技術(shù)在臨床上用于治療肌肉萎縮。但作為基因興奮劑使用也可以用于提高特定肌群的體積和力量?；蚺d奮劑的檢測(cè)方法 基因興奮劑的檢測(cè)直至今日都是世界性的難題。一方面基因表達(dá)后產(chǎn)生的蛋白基本與人體自然產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白一致, 另一方面很多表達(dá)產(chǎn)物只在局部組織產(chǎn)生并不進(jìn)入血液循環(huán), 這使得基因興奮劑很難用常規(guī)的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)。目前的方法主要著眼于以下三個(gè)方面。（一）對(duì)基因元件的檢測(cè) 基因元件能作為最直接的證據(jù)來(lái)指證基因興奮劑的使用。其中檢測(cè)導(dǎo)入的基因序列是最直觀的方法。使用探針標(biāo)記DNA 片段可以直接

12、檢測(cè)外源DNA 序列。但是由于外源基因序列與人體內(nèi)自然表達(dá)這一功能的基因序列完全一致故而很難區(qū)分。而且對(duì)檢測(cè)部位的確定和取樣亦是難題。目前最有希望的方法是通過(guò)檢測(cè)人體對(duì)載體病毒產(chǎn)生的抗體來(lái)推測(cè)外來(lái)基因的導(dǎo)入。然而這種方法很難區(qū)別抗體是由于基因治療而產(chǎn)生還是來(lái)源于自然感染。而且經(jīng)過(guò)改造后的病毒載體免疫性很低也給檢測(cè)增加了難度。（二）對(duì)基因表達(dá)后各類(lèi)異常產(chǎn)物的檢測(cè) 越來(lái)越多的研究人員發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)基因技術(shù)導(dǎo)入后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與內(nèi)源性的蛋白質(zhì)存在不同。這在對(duì)外源性的EPO的檢測(cè)上比較常用。由于EPO 具有組織依賴性, 在肌肉組織中表達(dá)的EPO 和在腎臟組織中表達(dá)的EPO 在其糖基化結(jié)構(gòu)上存在區(qū)別。Lasne

13、 等根據(jù)這一特點(diǎn), 利用等電聚焦技術(shù)建立了檢測(cè)方法。這一方法具有準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn), 但耗時(shí)較長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)有研究人員發(fā)現(xiàn)利用電噴霧( ESI) 質(zhì)譜可以檢測(cè)到不同來(lái)源EPO 在糖鏈結(jié)構(gòu)上的差異。但這一方法受限于EPO 的含量和取樣量, 靈敏度還不夠。外源基因的導(dǎo)入也會(huì)引起人體的自身免疫反應(yīng)。外源蛋白以及外源基因表達(dá)蛋白引起免疫應(yīng)答都曾有過(guò)報(bào)道。Gao等將外源EPO 基因注入短尾猴的骨骼肌和獼猴的肺部, 結(jié)果多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都產(chǎn)生了EPO 抗體。通過(guò)對(duì)這些抗體的檢測(cè)也可以間接證明基因興奮劑的使用。此外外源基因的導(dǎo)入還會(huì)引起相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)異常。通過(guò)研究基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)組學(xué), 也可以間接獲得基因興奮劑的使用證據(jù)。（三）對(duì)常規(guī)生化指標(biāo)的檢測(cè) 外源基因不僅改變了基因和相關(guān)蛋白的表達(dá), 還引起了一些常規(guī)生化指標(biāo)的異常。WADA 目前推薦用于檢測(cè)外源EPO 的間接方法就是基于這一理論。通過(guò)檢測(cè)5 項(xiàng)常規(guī)血液指標(biāo)來(lái)篩選可疑運(yùn)動(dòng)員。另外WADA 還希望建立一個(gè)運(yùn)動(dòng)員的個(gè)人數(shù)據(jù)庫(kù), 確定每位運(yùn)動(dòng)員蛋白質(zhì)、遺物質(zhì)以及生化指標(biāo)的基數(shù)值。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果高于這一基數(shù)時(shí)則有理由懷疑該運(yùn)動(dòng)員使用了興奮劑。基因興奮劑對(duì)運(yùn)動(dòng)員身體的損害 基因治療存在的一些不成熟的技術(shù)可能會(huì)對(duì)人體健康造成嚴(yán)重的后果 ?，F(xiàn)在使用促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素最大的危害是無(wú)法有效控制血